Metoda dodawania wzorca
1. Przygotowanie odczynników
- 100 ppm standardowy roztwór Al3+: Rozpuścić 0,9151 g azotanu glinu (Al(NO3)3•9H2O) w 1-litrowej kolbie miarowej z wodą DI.
- Roztwór 8HQ w 1 M kwasie octowym (2% wag./obj.): Dodać 2,0 g 8-hydroksychinoliny do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
- Ostrożnie dodać 5,74 ml lodowatego kwasu octowego do kolby o pojemności 100 ml, a następnie rozcieńczyć do kreski wodą demineralizowaną. Dzięki temu 8-hydroksychinolina rozpuszcza się w fazie wodnej.
- 1 M bufor NH4+/NH3 (pH ~ 8): Dodaj 20 g octanu amonu (NH4OAc) do butelki o pojemności 100 ml.
- Dodaj 7 ml 30% wodorotlenku amonu do tej 100-mililitrowej butelki i rozcieńcz do kreski wodą DI. Pomaga to zneutralizować kwas w roztworze 8HQ po połączeniu.
- Inne odczynniki to bezwodny siarczan sodu (Na, 2, SO, 4) i chloroform (klasa Spec).
2. Przygotowanie próbek
- Przygotować 1,00 ppm wzorcowy roztwór Al3+, dodając 1,0 ml podstawowego roztworu Al3+ o stężeniu 100 ppm za pomocą pipety do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
- Umieść sześć lejków separatorowych o pojemności 125 ml na pierścieniach, które znajdują się na dużym stojaku pierścieniowym umieszczonym w pokrywie. Powinny być oznaczone w następujący sposób: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Upewnij się, że wszystkie naczynia szklane są skrupulatnie czyste, ponieważ trudno jest uzyskać wyniki ilościowe, jeśli małe kulki chloroformu przyklejają się do ścianek szkła.
- Dodać 25,00 ml nieznanego roztworu Al3+ do pięciu rozdzielaczy oznaczonych 0, 1, 2, 3 i 4. W tym przykładzie nieznane stężenie wynosi 0,110 ppm.
- Dodaj odpowiednio 0, 1,00, 2,00, 3,00 i 4,00 ml wzorcowego roztworu Al3+ o stężeniu 1,00 ppm do 5 lejków za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
- Przygotować ślepą próbę, dodając 25,00 ml wody destylowanej do rozdzielacza oznaczonego BL.
- Dodać 1,0 ml roztworu 8-hydroksychinoliny za pomocą pipety do każdego z sześciu roztworów.
- Dodać 3,0 ml roztworu buforowego za pomocą pipety do każdego z sześciu roztworów.
- Ekstrahować każdy roztwór dwukrotnie 10 ml chloroformu, energicznie wstrząsając przez 1 minutę za każdym razem. Pamiętaj, aby od czasu do czasu odpowietrzyć rozdzielacz, aby uwolnić narastające ciśnienie. (UWAGA: Dobra ekstrakcja ma miejsce tylko wtedy, gdy między fazami występuje duży kontakt ciecz-ciecz).
- Zebrać chloroform do czystej, suchej zlewki o pojemności 100 ml z etykietą. Chloroform ma gęstość bliską 1,5 g/cm3, a więc jest to dolna warstwa. Po całkowitej ekstrakcji w fazie wodnej nie powinien pozostać żaden ślad żółtego koloru.
- Przenieść połączony ekstrakt chloroformowy z każdej zlewki do odpowiedniej kolby miarowej o pojemności 25 ml i rozcieńczyć chloroformem do kreski. Należy pamiętać o umieszczeniu korków w każdej kolbie miarowej, aby zapobiec parowaniu chloroformu.
- Dodać ~1 g bezwodnego siarczanu sodu (Na2SO4) do każdej z sześciu zlewek o pojemności 100 ml z kroku 2.9. Siarczan sodu pomaga usunąć wszelkie ślady wody, które mogą być obecne w ekstrakcie chloroformowym.
- Przenieś roztwory z powrotem do ich szanowanych zlewek. Obracać ostrożnie, aby ułatwić odwodnienie wody w próbce.
- Zdekantować ekstrakty chloroformu do celi fluorymetru kwarcowego (Uwaga: Chloroform rozpuści plastikową komórkę polistyrenową).
3. Wybór długości fali wzbudzenia
Określ długości fal wzbudzenia i emisji, przeprowadzając skanowanie, a następnie po prostu odczytaj i zapisz intensywność fluorescencji wszystkich próbek przy tych wartościach. Szerokości pasma wzbudzenia i emisji są wstępnie ustawione na 5 nm. Kompleks absorbuje w bliskim UV, więc długość fali wzbudzenia powinna wynosić około 385 nm. Początkowo należy monitorować fluorescencję przy długości fali 500 nm w gałęzi emisyjnej.
- Na fluorymetrze sprawdź, czy zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne wentylatory chłodzące we fluorymetrze są włączone przed włączeniem lampy ksenonowej. Lampa ksenonowa bardzo się nagrzewa i wymaga ciągłego chłodzenia.
- Włącz wysokie napięcie (HV) do detektora PMT na 400 V.
- Otwórz obie rolety.
- Otwórz program do akwizycji danych na komputerze, oto "100nmFluorScan".
- Umieść roztwór "Próbka + 2 ml dodane" (2) w ogniwie kwarcowym, aby użyć go do określenia najlepszych długości fal wzbudzenia i emisji.
- Przy długości fali emisji początkowo ustawionej na 500 nm, uruchom skanowanie wzbudzenia od 335-435 nm z prędkością skanowania 2 nm/s.
- Na podstawie wynikowego wykresu fluorescencji określ maksymalną długość fali wzbudzenia fluorescencji (<span style="line-height: 20.8px;">EXλmax) i ustaw instrument na tę wartość.
4. Wybór długości fali emisji
- Ustaw długość fali emisji fluorymetru na 450 nm.
- Ustaw zakres długości fali emisji, aby uruchomić skanowanie 100 nm od 450 do 550 nm.
- Aby rozpocząć skanowanie, kliknij przycisk "rozpocznij próbę" w programie w tym samym czasie, co naciśnięcie przycisku "START" na przednim panelu fluorymetru.
- Na podstawie wynikowego wykresu fluorescencji określ maksymalną fluorescencję emission wavelength (EMλmax) i ustaw instrument na tę wartość (Rysunek 2).
Rysunek 2. Określanie optymalnego EXλmax i EMλmax Długości fal.
5. Pomiar fluorescencji próbek
- Wszystkie próbki są badane przy EMλmax i EXλmax. Skany nie są potrzebne dla każdej próbki, ale tylko wartość fluorescencji w tych warunkach. Zaczynając od najbardziej rozcieńczonej próbki (ślepej próby), umieść ją w kumorze kwarcowej, a następnie w urządzeniu. Zapisz intensywność fluorescencji w notatniku laboratoryjnym.
- Powtórzyć te czynności dla wszystkich pozostałych próbek.
- Należy pamiętać, że intensywność względna ślepej próby musi zostać odjęta od intensywności względnej każdego roztworu przed utworzeniem karty kalibracyjnej.
6. Tworzenie standardowego wykresu dodawania
- Wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji μg dodanego Al3+.
- Określ wartość najmniejszych kwadratów wynikowego wykresu i zapisz zarówno nachylenie, jak i punkt przecięcia.
- Oznaczyć μg Al3+ w nieznanej próbce z równania μg z Al3+ = -b/m
- Wiedząc, że nieznane aluminium miało objętość 25,0 ml dodaną do każdej próbki, określ stężenie aluminium w nieznanym.
Źródło: Laboratorium dr Paula Bowera - Purdue University
Metoda dodawania wzorca jest metodą analizy ilościowej, która jest często stosowana, gdy prób…
1. Przygotowanie odczynników
- 100 ppm standardowy roztwór Al3+: Rozpuścić 0,9151 g azotanu glinu (Al(NO3)3•9H2O) w 1-litrowej kolbie miarowej z wodą DI.
- Roztwór 8HQ w 1 M kwasie octowym (2% wag./obj.): Dodać 2,0 g 8-hydroksychinoliny do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
- Ostrożnie dodać 5,74 ml lodowatego kwasu octowego do kolby o pojemności 100 ml, a następnie rozcieńczyć do kreski wodą demineralizowaną. Dzięki temu 8-hydroksychinolina rozpuszcza się w fazie wodnej.
- 1 M bufor NH4+/NH3 (pH ~ 8): Dodaj 20 g octanu amonu (NH4OAc) do butelki o pojemności 100 ml.
- Dodaj 7 ml 30% wodorotlenku amonu do tej 100-mililitrowej butelki i rozcieńcz do kreski wodą DI. Pomaga to zneutralizować kwas w roztworze 8HQ po połączeniu.
- Inne odczynniki to bezwodny siarczan sodu (Na, 2, SO, 4) i chloroform (klasa Spec).
2. Przygotowanie próbek
- Przygotować 1,00 ppm wzorcowy roztwór Al3+, dodając 1,0 ml podstawowego roztworu Al3+ o stężeniu 100 ppm za pomocą pipety do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
- Umieść sześć lejków separatorowych o pojemności 125 ml na pierścieniach, które znajdują się na dużym stojaku pierścieniowym umieszczonym w pokrywie. Powinny być oznaczone w następujący sposób: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Upewnij się, że wszystkie naczynia szklane są skrupulatnie czyste, ponieważ trudno jest uzyskać wyniki ilościowe, jeśli małe kulki chloroformu przyklejają się do ścianek szkła.
- Dodać 25,00 ml nieznanego roztworu Al3+ do pięciu rozdzielaczy oznaczonych 0, 1, 2, 3 i 4. W tym przykładzie nieznane stężenie wynosi 0,110 ppm.
- Dodaj odpowiednio 0, 1,00, 2,00, 3,00 i 4,00 ml wzorcowego roztworu Al3+ o stężeniu 1,00 ppm do 5 lejków za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
- Przygotować ślepą próbę, dodając 25,00 ml wody destylowanej do rozdzielacza oznaczonego BL.
- Dodać 1,0 ml roztworu 8-hydroksychinoliny za pomocą pipety do każdego z sześciu roztworów.
- Dodać 3,0 ml roztworu buforowego za pomocą pipety do każdego z sześciu roztworów.
- Ekstrahować każdy roztwór dwukrotnie 10 ml chloroformu, energicznie wstrząsając przez 1 minutę za każdym razem. Pamiętaj, aby od czasu do czasu odpowietrzyć rozdzielacz, aby uwolnić narastające ciśnienie. (UWAGA: Dobra ekstrakcja ma miejsce tylko wtedy, gdy między fazami występuje duży kontakt ciecz-ciecz).
- Zebrać chloroform do czystej, suchej zlewki o pojemności 100 ml z etykietą. Chloroform ma gęstość bliską 1,5 g/cm3, a więc jest to dolna warstwa. Po całkowitej ekstrakcji w fazie wodnej nie powinien pozostać żaden ślad żółtego koloru.
- Przenieść połączony ekstrakt chloroformowy z każdej zlewki do odpowiedniej kolby miarowej o pojemności 25 ml i rozcieńczyć chloroformem do kreski. Należy pamiętać o umieszczeniu korków w każdej kolbie miarowej, aby zapobiec parowaniu chloroformu.
- Dodać ~1 g bezwodnego siarczanu sodu (Na2SO4) do każdej z sześciu zlewek o pojemności 100 ml z kroku 2.9. Siarczan sodu pomaga usunąć wszelkie ślady wody, które mogą być obecne w ekstrakcie chloroformowym.
- Przenieś roztwory z powrotem do ich szanowanych zlewek. Obracać ostrożnie, aby ułatwić odwodnienie wody w próbce.
- Zdekantować ekstrakty chloroformu do celi fluorymetru kwarcowego (Uwaga: Chloroform rozpuści plastikową komórkę polistyrenową).
3. Wybór długości fali wzbudzenia
Określ długości fal wzbudzenia i emisji, przeprowadzając skanowanie, a następnie po prostu odczytaj i zapisz intensywność fluorescencji wszystkich próbek przy tych wartościach. Szerokości pasma wzbudzenia i emisji są wstępnie ustawione na 5 nm. Kompleks absorbuje w bliskim UV, więc długość fali wzbudzenia powinna wynosić około 385 nm. Początkowo należy monitorować fluorescencję przy długości fali 500 nm w gałęzi emisyjnej.
- Na fluorymetrze sprawdź, czy zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne wentylatory chłodzące we fluorymetrze są włączone przed włączeniem lampy ksenonowej. Lampa ksenonowa bardzo się nagrzewa i wymaga ciągłego chłodzenia.
- Włącz wysokie napięcie (HV) do detektora PMT na 400 V.
- Otwórz obie rolety.
- Otwórz program do akwizycji danych na komputerze, oto "100nmFluorScan".
- Umieść roztwór "Próbka + 2 ml dodane" (2) w ogniwie kwarcowym, aby użyć go do określenia najlepszych długości fal wzbudzenia i emisji.
- Przy długości fali emisji początkowo ustawionej na 500 nm, uruchom skanowanie wzbudzenia od 335-435 nm z prędkością skanowania 2 nm/s.
- Na podstawie wynikowego wykresu fluorescencji określ maksymalną długość fali wzbudzenia fluorescencji (<span style="line-height: 20.8px;">EXλmax) i ustaw instrument na tę wartość.
4. Wybór długości fali emisji
- Ustaw długość fali emisji fluorymetru na 450 nm.
- Ustaw zakres długości fali emisji, aby uruchomić skanowanie 100 nm od 450 do 550 nm.
- Aby rozpocząć skanowanie, kliknij przycisk "rozpocznij próbę" w programie w tym samym czasie, co naciśnięcie przycisku "START" na przednim panelu fluorymetru.
- Na podstawie wynikowego wykresu fluorescencji określ maksymalną fluorescencję emission wavelength (EMλmax) i ustaw instrument na tę wartość (Rysunek 2).
Rysunek 2. Określanie optymalnego EXλmax i EMλmax Długości fal.
5. Pomiar fluorescencji próbek
- Wszystkie próbki są badane przy EMλmax i EXλmax. Skany nie są potrzebne dla każdej próbki, ale tylko wartość fluorescencji w tych warunkach. Zaczynając od najbardziej rozcieńczonej próbki (ślepej próby), umieść ją w kumorze kwarcowej, a następnie w urządzeniu. Zapisz intensywność fluorescencji w notatniku laboratoryjnym.
- Powtórzyć te czynności dla wszystkich pozostałych próbek.
- Należy pamiętać, że intensywność względna ślepej próby musi zostać odjęta od intensywności względnej każdego roztworu przed utworzeniem karty kalibracyjnej.
6. Tworzenie standardowego wykresu dodawania
- Wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji μg dodanego Al3+.
- Określ wartość najmniejszych kwadratów wynikowego wykresu i zapisz zarówno nachylenie, jak i punkt przecięcia.
- Oznaczyć μg Al3+ w nieznanej próbce z równania μg z Al3+ = -b/m
- Wiedząc, że nieznane aluminium miało objętość 25,0 ml dodaną do każdej próbki, określ stężenie aluminium w nieznanym.
Metoda dodawania wzorca jest techniką analizy ilościowej stosowaną w celu zminimalizowania efektów matrycy, które zakłócają sygnały pomiarowe analitu.
Nieznane stężenia składników są często wyjaśniane za pomocą szeregu technik analitycznych, takich jak spektroskopia światła, spektrometria mas i elektrochemia. Jednak na pomiar mogą mieć wpływ inne składniki próbki, zwane macierzą, i powodować niezamierzone zmniejszenie lub wzmocnienie sygnału, zwane efektami matrycy. Efekty te mogą zniekształcić wyniki i spowodować znaczne błędy w analizie.
Metoda dodawania wzorca może być stosowana w celu zminimalizowania wpływu matrycy na sygnały pomiarowe. Odbywa się to poprzez dodanie do próbki precyzyjnych objętości znanego roztworu analitu.
Ten film wprowadzi podstawy metody dodawania wzorców i pokaże, jak wykonać tę technikę w laboratorium przy użyciu pomiaru fluorescencji.
Efekty matrycy mogą powstawać w złożonych próbkach, w których wiele innych cząsteczek oddziałuje z analitem. Na przykład może się to zdarzyć, gdy cząsteczki wiążą się lub aglomerują z analitem, zmieniając w ten sposób jego zdolność do fluorescencji. Lub matryca może zmienić siłę jonową całego roztworu, zmieniając określone właściwości analitu.
Aby złagodzić te skutki przy użyciu metody dodawania wzorca, dodaje się szereg objętości wzorcowego roztworu analitu do równych objętości próbki. Objętości roztworu są następnie równe za pomocą rozpuszczalnika.
Następnie mierzony jest sygnał dla próbek z dodatkiem wzorca i bez niego. Dane są wykreślane jako intensywność w funkcji ilości wzorca dodanego do próbki, a nie jako klasyczna krzywa kalibracyjna. Rzeczywiste stężenie analitu w dowolnej kolbie jest określone za pomocą następującego równania. Odpowiedź instrumentalna będzie równa pewnej stałej liczbie razy stężenie analitu. Wynikowe równanie przyjmuje postać liniową y=mx+b. W związku z tym, gdy wykres jest ekstrapolowany na zerową absorbancję, punkt przecięcia jest równy nieznanemu stężeniu próbki.
Wykres sygnału musi być liniowy w zakresie stężeń budzących obawy. Ponadto interferencja nie powinna zmieniać się wraz ze zmianą stosunku analitu do matrycy próbki. Wreszcie, sama matryca nie powinna sama generować żadnych sygnałów pomiarowych.
W poniższym eksperymencie bada się aluminium, gatunek niefluorescencyjny, reagując go z 8-hydroksychinoliną lub 8HQ, tworząc fluorescencyjny kompleks ALQ3.
Fluorescencja kompleksu glinu w rozpuszczalniku organicznym jest mierzona, a następnie odnoszona do stężenia oryginalnego roztworu aluminium. Takie podejście jest powszechne w analizie jonów metali.
Teraz, gdy podstawy metody dodawania wzorca zostały nakreślone, a podstawy eksperymentu wyjaśnione, przeprowadźmy tę technikę w laboratorium.
Najpierw przygotuj 100-ppm roztwór podstawowy aluminium w wodzie, a następnie użyj go do przygotowania roztworu wzorcowego 1-ppm.
Następnie dodać 2 g 8-hydroksychinoliny lub 8HQ do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
Ostrożnie dodaj 5,74 ml lodowatego kwasu octowego, a następnie rozcieńcz do oznaczenia 100 ml wodą dejonizowaną. Ten krok umożliwia rozpuszczenie 8HQ w fazie wodnej.
Następnie przygotuj bufor, dodając 20 g octanu amonu i 7 ml 30% wodorotlenku amonu do 100 ml oznaczonej butelki i rozcieńczyć. Sprawdź pH za pomocą wskaźnika pH w patyczku. Ten bufor pomaga zneutralizować kwas w roztworze 8HQ po połączeniu.
Inne potrzebne odczynniki to bezwodny siarczan sodu i chloroform klasy spektrofotometrycznej.
Teraz przygotuj próbki, w tym przypadku ekstrahując próbkę wodną do fazy organicznej za pomocą ekstrakcji ciecz-ciecz. Umieść sześć lejków separacyjnych o pojemności 125 ml na pierścieniach stojaka wewnątrz okapu. Upewnij się, że wszystkie szklane naczynia są skrupulatnie czyste, ponieważ brudne szkło może zniekształcić wyniki. Kolejno oznacz lejki jako "puste", "0", "1", "2", "3" i "4".
Za pomocą pipety dodaj 25 ml nieznanego roztworu aluminium do każdego z pięciu rozdzielaczy oznaczonych od "0" do "4". Przygotować ślepą próbę, dodając 25 ml wody dejonizowanej do lejka oznaczonego jako "ślepa".
Następnie dodać 1, 2, 3 i 4 ml roztworu wzorcowego 1 ppm do odpowiednich ponumerowanych lejków. Nie dodawaj żadnego standardowego roztworu do ślepej próby lub lejków 0.
Dodać 1 ml roztworu 8HQ i 3 ml roztworu buforowego do każdego z 6 lejków.
Przeprowadzić ekstrakcję ciecz-ciecz, dodając 10 ml chloroformu do każdej kolby. Energicznie potrząśnij lejkiem i od czasu do czasu odpowietrz lejek, aby uwolnić narastające ciśnienie. Umieść lejek z powrotem w pierścieniu i poczekaj, aż warstwy płynu się rozdzielą.
Następnie zbierz fazę chloroformu w czystej, suchej i oznakowanej zlewce o pojemności 100 ml. Ponieważ chloroform ma większą gęstość niż woda, jest to dolna warstwa lejka.
Przenieść ekstrakt chloroformu do kolby miarowej o pojemności 25 ml i zakryć każdą kolbę, aby zapobiec parowaniu.
Przeprowadzić drugą ekstrakcję ciecz-ciecz na pozostałym roztworze wodnym, dodając 10 ml chloroformu do każdego lejka. Potrząsnąć lejkiem, jak poprzednio, aby przenieść pozostały analit do fazy chloroformowej. W górnej fazie wodnej nie powinien pozostać żaden żółty kolor.
Powtórzyć drugą ekstrakcję dla każdego lejka, a następnie zebrać fazy chloroformu w odpowiednich oznakowanych zlewkach. Wlać zebrany chloroform do odpowiednich kolb miarowych i rozcieńczyć do kreski świeżym chloroformem.
Aby usunąć śladowe ilości wody, dodaj około 1 g bezwodnego siarczanu sodu do każdej z sześciu zlewek o pojemności 100 ml. Przenieść roztwory z powrotem do odpowiednich zlewek i zawirować, aby ułatwić odwodnienie próbki.
Zdekantować ekstrakt chloroformu do kwarcowej celi fluorymetru.
Ustaw fluorymetr zgodnie z instrukcjami producenta i ustaw voltage na 400 V. Następnie otwórz program do akwizycji danych na komputerze.
Użyj próbki 2, aby określić najlepsze długości fal wzbudzenia i emisji. Ustaw długość fali emisji na 500 nm i uruchom skanowanie wzbudzenia od 335×435 nm, z prędkością skanowania 2 nm/s.
Na podstawie wykresu fluorescencji określ maksymalną długość fali dla wzbudzenia. Ustaw przyrząd na tę wartość długości fali wzbudzenia, w tym przypadku 399 nm.
Następnie określ długość fali emisji, wykonując skan w zakresie 450×550 nm. Z wynikowego wykresu fluorescencji wyznacz maksymalną długość fali i ustaw długość fali emisji, w tym przypadku 520 nm.
Zmierzyć każdą próbkę, w tym ślepą próbę przy wybranej długości fali wzbudzenia i emisji. Zapisz każdy odczyt intensywności fluorescencji.
Odejmij zmierzoną fluorescencję ślepej próbki od każdej z pozostałych 5 próbek.
Wykreślić intensywność fluorescencji każdej z pięciu próbek w funkcji ilości aluminium dodanego do próbki. Określ wartość najmniejszych kwadratów wynikowego wykresu, a następnie zapisz nachylenie i punkt przecięcia.
Wykres intensywności fluorescencji w funkcji ilości dodanego aluminium dał linię najmniejszymi kwadratów, jak pokazano. Ilość aluminium w próbce można następnie obliczyć za pomocą tej linii. Ponieważ ilość nieznanego dodatku wynosiła 25 ml, wyznaczoną wartość 2,916 μg dzieli się przez 25 ml. Daje to końcowy wynik 0,117 μg/ml, czyli 0,117 ppm. Jest to dość blisko znanej wartości 0,110 ppm.
Przyjrzyjmy się teraz kilku innym technikom analitycznym, które mogą mieć zniekształcone wyniki ze względu na efekty macierzy.
Atomowa spektroskopia absorpcyjna to metoda analityczna, która mierzy absorbancję światła przez docelowy analit w fazie gazowej. W przypadku większości próbek prosta krzywa kalibracyjna wiążąca absorpcję ze stężeniem próbki może służyć jako wiarygodna metoda ilościowego określania nieznanego stężenia.
Technika ta może jednak stracić dokładność, jeśli inne składniki mieszaniny wchodzą w interakcję z docelowym analitem i tłumią lub zwiększają absorpcję. W tym przypadku można zastosować metodę dodawania wzorca w celu uwzględnienia skutków tych oddziaływań, zwłaszcza w próbkach, w których nie można usunąć matrycy przed analizą.
Kalibracja przyrządu odgrywa kluczową rolę w dokładności pomiaru. Metoda dodawania wzorców jest często stosowana do pomocy w kalibracji przyrządów takich jak ICP-MS. ICP-MS jest metodą porównawczą, co oznacza, że pomiar nieznanej próbki opiera się na pomiarze wzorca chemicznego.
W związku z tym niepewność pomiaru niewiadomej nie może być lepsza niż niepewność kalibracji. Metoda dodawania wzorca może być zatem wykorzystana do stworzenia krzywej kalibracyjnej, która jest dokładniejsza niż metoda standardowa i uwzględnia interakcje matrycy w próbce.
Wiele cząsteczek biologicznych jest analizowanych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub HPLC. HPLC to technika, która oddziela i analizuje złożone mieszaniny na podstawie właściwości cząsteczek, takich jak polarność, ładunek i rozmiar. Czas, w którym analit opuszcza kolumnę, umożliwia użytkownikowi identyfikację każdego składnika mieszaniny.
Cząsteczki biologiczne mogą często wchodzić w interakcje w mieszaninie i duży wpływ ma na nie matryca, w której są zawieszone. Często metoda dodawania wzorca jest używana do stworzenia krzywej kalibracyjnej, która uwzględnia te wpływy.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do metody standardowego dodawania. Powinieneś teraz zrozumieć, jak wykonać tę technikę, aby uwzględnić efekty macierzy w analizie próbki.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are matrix effects and why do they cause errors in analytical measurements?
Matrix effects occur when other components in a sample interact with the analyte, reducing or enhancing its measurement signal. These interactions can cause molecules to bind with the analyte, changing its fluorescence properties, or alter the solution's ionic strength. Such effects skew analytical results and produce significant measurement errors that compromise data accuracy.
Q2: How does the method of standard addition minimize matrix effects?
Standard addition works by adding precise volumes of a known analyte solution to equal volumes of the sample, assuming the matrix affects all solutions equally. By measuring signals with and without standard additions, then plotting intensity versus amount of standard added, the technique accounts for matrix interactions. Extrapolating the resulting linear plot to zero absorbance reveals the unknown analyte concentration.
Q3: What are the key requirements for standard addition to work effectively?
The signal plot must remain linear over the concentration range of interest. The interference should not vary as the ratio of analyte to sample matrix changes. Additionally, the matrix itself must not generate any independent measurement signals. These conditions ensure that the extrapolated intercept accurately represents the unknown analyte concentration.
Q4: Why is liquid-liquid extraction used in the aluminum fluorescence experiment?
Liquid-liquid extraction transfers the aluminum-8HQ complex from the aqueous phase into an organic chloroform phase for fluorescence measurement. This separation isolates the fluorescent analyte from aqueous matrix components, reducing interference. The chloroform extract is then analyzed using fluorimetry to measure the intensity of the aluminum complex.
Q5: How is the unknown aluminum concentration calculated from the standard addition plot?
The least squares line from the fluorescence intensity versus amount of standard added plot is extrapolated to the x-axis intercept, which equals the negative of the unknown concentration. For the aluminum experiment, the intercept value of 2.916 micrograms is divided by the sample volume of 25 mL, yielding a final concentration of 0.117 ppm.
Q6: Which analytical techniques commonly use standard addition to account for matrix effects?
Atomic absorption spectroscopy uses standard addition when matrix components suppress or enhance analyte absorption. ICP-MS employs it to create more accurate calibration curves accounting for sample interactions. High-performance liquid chromatography relies on standard addition when biological molecules interact in mixtures, since the matrix significantly affects measurement accuracy.
Q7: What role does instrument calibration play in the accuracy of standard addition measurements?
Instrument calibration is crucial for measurement accuracy, particularly in comparative methods like ICP-MS where unknown measurements depend on chemical standards. The method of standard addition creates calibration curves more accurate than standard methods by accounting for matrix interactions. This ensures the uncertainty of unknown measurements cannot exceed the uncertainty of the calibration itself.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:08
Principles of Standard Addition
3:19
Preparing the Reagents and Samples
6:56
Measuring and Analyzing the Sample
9:06
Applications
11:09
Summary
Videos from this collection: