Metoda dodawania wzorca

1. Przygotowanie odczynników

1. 100 ppm standardowy roztwór Al³⁺: Rozpuścić 0,9151 g azotanu glinu (Al(NO₃)₃•9H₂O) w 1-litrowej kolbie miarowej z wodą DI.
2. Roztwór 8HQ w 1 M kwasie octowym (2% wag./obj.): Dodać 2,0 g 8-hydroksychinoliny do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
3. Ostrożnie dodać 5,74 ml lodowatego kwasu octowego do kolby o pojemności 100 ml, a następnie rozcieńczyć do kreski wodą demineralizowaną. Dzięki temu 8-hydroksychinolina rozpuszcza się w fazie wodnej.
4. 1 M bufor NH₄⁺/NH₃ (pH ~ 8): Dodaj 20 g octanu amonu (NH₄OAc) do butelki o pojemności 100 ml.
5. Dodaj 7 ml 30% wodorotlenku amonu do tej 100-mililitrowej butelki i rozcieńcz do kreski wodą DI. Pomaga to zneutralizować kwas w roztworze 8HQ po połączeniu.
6. Inne odczynniki to bezwodny siarczan sodu (Na_{, 2}, SO_{, 4}) i chloroform (klasa Spec).

2. Przygotowanie próbek

1. Przygotować 1,00 ppm wzorcowy roztwór Al³⁺, dodając 1,0 ml podstawowego roztworu Al³⁺ o stężeniu 100 ppm za pomocą pipety do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
2. Umieść sześć lejków separatorowych o pojemności 125 ml na pierścieniach, które znajdują się na dużym stojaku pierścieniowym umieszczonym w pokrywie. Powinny być oznaczone w następujący sposób: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Upewnij się, że wszystkie naczynia szklane są skrupulatnie czyste, ponieważ trudno jest uzyskać wyniki ilościowe, jeśli małe kulki chloroformu przyklejają się do ścianek szkła.
3. Dodać 25,00 ml nieznanego roztworu Al³⁺ do pięciu rozdzielaczy oznaczonych 0, 1, 2, 3 i 4. W tym przykładzie nieznane stężenie wynosi 0,110 ppm.
4. Dodaj odpowiednio 0, 1,00, 2,00, 3,00 i 4,00 ml wzorcowego roztworu Al³⁺ o stężeniu 1,00 ppm do 5 lejków za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
5. Przygotować ślepą próbę, dodając 25,00 ml wody destylowanej do rozdzielacza oznaczonego BL.
6. Dodać 1,0 ml roztworu 8-hydroksychinoliny za pomocą pipety do każdego z sześciu roztworów.
7. Dodać 3,0 ml roztworu buforowego za pomocą pipety do każdego z sześciu roztworów.
8. Ekstrahować każdy roztwór dwukrotnie 10 ml chloroformu, energicznie wstrząsając przez 1 minutę za każdym razem. Pamiętaj, aby od czasu do czasu odpowietrzyć rozdzielacz, aby uwolnić narastające ciśnienie. (UWAGA: Dobra ekstrakcja ma miejsce tylko wtedy, gdy między fazami występuje duży kontakt ciecz-ciecz).
9. Zebrać chloroform do czystej, suchej zlewki o pojemności 100 ml z etykietą. Chloroform ma gęstość bliską 1,5 g/^cm3, a więc jest to dolna warstwa. Po całkowitej ekstrakcji w fazie wodnej nie powinien pozostać żaden ślad żółtego koloru.
10. Przenieść połączony ekstrakt chloroformowy z każdej zlewki do odpowiedniej kolby miarowej o pojemności 25 ml i rozcieńczyć chloroformem do kreski. Należy pamiętać o umieszczeniu korków w każdej kolbie miarowej, aby zapobiec parowaniu chloroformu.
11. Dodać ~1 g bezwodnego siarczanu sodu (Na_2SO4) do każdej z sześciu zlewek o pojemności 100 ml z kroku 2.9. Siarczan sodu pomaga usunąć wszelkie ślady wody, które mogą być obecne w ekstrakcie chloroformowym.
12. Przenieś roztwory z powrotem do ich szanowanych zlewek. Obracać ostrożnie, aby ułatwić odwodnienie wody w próbce.
13. Zdekantować ekstrakty chloroformu do celi fluorymetru kwarcowego (Uwaga: Chloroform rozpuści plastikową komórkę polistyrenową).

3. Wybór długości fali wzbudzenia

Określ długości fal wzbudzenia i emisji, przeprowadzając skanowanie, a następnie po prostu odczytaj i zapisz intensywność fluorescencji wszystkich próbek przy tych wartościach. Szerokości pasma wzbudzenia i emisji są wstępnie ustawione na 5 nm. Kompleks absorbuje w bliskim UV, więc długość fali wzbudzenia powinna wynosić około 385 nm. Początkowo należy monitorować fluorescencję przy długości fali 500 nm w gałęzi emisyjnej.

1. Na fluorymetrze sprawdź, czy zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne wentylatory chłodzące we fluorymetrze są włączone przed włączeniem lampy ksenonowej. Lampa ksenonowa bardzo się nagrzewa i wymaga ciągłego chłodzenia.
2. Włącz wysokie napięcie (HV) do detektora PMT na 400 V.
3. Otwórz obie rolety.
4. Otwórz program do akwizycji danych na komputerze, oto "100nmFluorScan".
5. Umieść roztwór "Próbka + 2 ml dodane" (2) w ogniwie kwarcowym, aby użyć go do określenia najlepszych długości fal wzbudzenia i emisji.
6. Przy długości fali emisji początkowo ustawionej na 500 nm, uruchom skanowanie wzbudzenia od 335-435 nm z prędkością skanowania 2 nm/s.
7. Na podstawie wynikowego wykresu fluorescencji określ maksymalną długość fali wzbudzenia fluorescencji (<span style="line-height: 20.8px;">EXλ_max) i ustaw instrument na tę wartość.

4. Wybór długości fali emisji

1. Ustaw długość fali emisji fluorymetru na 450 nm.
2. Ustaw zakres długości fali emisji, aby uruchomić skanowanie 100 nm od 450 do 550 nm.
3. Aby rozpocząć skanowanie, kliknij przycisk "rozpocznij próbę" w programie w tym samym czasie, co naciśnięcie przycisku "START" na przednim panelu fluorymetru.
4. Na podstawie wynikowego wykresu fluorescencji określ maksymalną fluorescencję emission wavelength (EMλ_max) i ustaw instrument na tę wartość (Rysunek 2).

Rysunek 2. Określanie optymalnego EXλ_max i EMλ_max Długości fal.

5. Pomiar fluorescencji próbek

1. Wszystkie próbki są badane przy EMλ_max i EXλ_max. Skany nie są potrzebne dla każdej próbki, ale tylko wartość fluorescencji w tych warunkach. Zaczynając od najbardziej rozcieńczonej próbki (ślepej próby), umieść ją w kumorze kwarcowej, a następnie w urządzeniu. Zapisz intensywność fluorescencji w notatniku laboratoryjnym.
2. Powtórzyć te czynności dla wszystkich pozostałych próbek.
3. Należy pamiętać, że intensywność względna ślepej próby musi zostać odjęta od intensywności względnej każdego roztworu przed utworzeniem karty kalibracyjnej.

6. Tworzenie standardowego wykresu dodawania

1. Wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji μg dodanego Al³⁺.
2. Określ wartość najmniejszych kwadratów wynikowego wykresu i zapisz zarówno nachylenie, jak i punkt przecięcia.
3. Oznaczyć μg Al³⁺ w nieznanej próbce z równania μg z Al³⁺ = -b/m
4. Wiedząc, że nieznane aluminium miało objętość 25,0 ml dodaną do każdej próbki, określ stężenie aluminium w nieznanym.