$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Spektroskopia w ultrafiolecie widzialnym lub UV-Vis jest jedną z najpopularniejszych technik analitycznych w laboratorium.
W spektroskopii UV-VIS światło jest przepuszczane przez próbkę o określonej długości fali w widmie UV lub widzialnym. Jeśli próbka pochłonie część światła, nie całe światło zostanie przez nie przepuszczone lub przepuszczone. Transmisja to stosunek intensywności światła przepuszczanego do światła padającego i jest skorelowany z absorbancją. Absorbancję można wykorzystać w sposób ilościowy, w celu uzyskania stężenia próbki. Może być również używany w sposób jakościowy, do identyfikacji związku poprzez dopasowanie zmierzonej absorbancji w zakresie długości fal, zwanym widmem absorbancji, do opublikowanych danych. W tym filmie przedstawiono spektroskopię UV-VIS i zademonstrowano jej zastosowanie w laboratorium do określania stężenia próbki i kinetyki reakcji.
Kiedy foton uderza w cząsteczkę i jest absorbowany, cząsteczka jest przenoszona ze stanu podstawowego do wyższego stanu energetycznego. Różnica energii między nimi to przerwa energetyczna. Energia fotonu musi dokładnie odpowiadać przerwie energetycznej, aby foton został pochłonięty. Struktura chemiczna określa przerwę energetyczną; Dlatego każda cząsteczka ma unikalne widma absorbancji.
Absorbancja jest zgodna z prawem Beera, które mówi, że absorbancja jest równa molowemu współczynnikowi tłumienia pomnożonemu przez długość ścieżki i stężenie. Molowy współczynnik tłumienia jest związany ze zdolnością pojedynczego związku do pochłaniania światła o określonej długości fali. Długość ścieżki odnosi się do odległości przebytej przez światło przez próbkę, która zwykle wynosi 1 cm w przypadku standardowych kuwet. Prawo Beera można wykorzystać do obliczenia stężenia próbki, jeśli znana jest chłonność, lub można użyć krzywej kalibracyjnej.
UV-Vis jest często nazywane techniką ogólną, ponieważ większość cząsteczek pochłania światło w zakresie widzialnym UV. Zakres UV rozciąga się od 100-400 nm, a widmo widzialne od 400-700 nm. Jednak większość spektrofotometrów nie pracuje w głębokim zakresie UV 100-200 nm, ponieważ źródła światła w tym zakresie są drogie. Większość spektrofotometrów UV-Vis wykorzystuje lampę deuterową dla zakresu UV, która wytwarza światło od 170-375 nm, oraz lampę wolframową dla zakresu widzialnego, która wytwarza światło od 350-2,500 nm.
Ponieważ źródłem światła jest zwykle lampa o szerokim zakresie długości fal, właściwą długość fali absorbancji dobiera się za pomocą filtrów lub monochromatora. Monochromator to urządzenie, które przestrzennie oddziela długości fal światła, a następnie umieszcza szczelinę wyjściową w miejscu, w którym znajduje się pożądana długość fali światła. Monochromator może być skanowany w zakresie długości fali, aby zapewnić całe spektrum absorbancji. To sprawia, że technika ta jest przydatna do ilościowego określania i identyfikacji szerokiego zakresu cząsteczek.
Teraz, gdy podstawy spektroskopii UV-Vis zostały nakreślone, przyjrzyjmy się prostemu eksperymentowi UV-Vis w laboratorium.
Przed rozpoczęciem pomiaru włącz spektrofotometr i pozwól lampom rozgrzać się przez odpowiedni okres czasu, aby je ustabilizować.
Przygotuj półfabrykat, napełniając czystą kuwetę rozpuszczalnikiem próbki, a następnie przetrzyj zewnętrzną część niestrzępiącym się papierem, aby usunąć wszelkie odciski palców.
Upewnij się, że kuweta jest prawidłowo wyrównana z wszelkimi rowkowanymi bokami poza ścieżką wiązki i włóż ją do spektrofotometru. Zabezpiecz pokrywę, aby zapobiec przedostawaniu się światła z otoczenia do wnętrza systemu.
Zmierz absorbancję ślepej próby przy jednej długości fali lub w zakresie długości fali. Zapisać lub zapisać absorbancję, ponieważ należy ją odjąć od absorbancji próbki.
Następnie wyrzuć ślepą próbę i dwukrotnie przepłucz kuwetę próbką. Następnie napełnij kuwetę około ? Pełny z próbką. Ponownie wytrzyj zewnętrzną część kuwety, aby upewnić się, że jest czysta i wolna od odcisków palców.
Umieść kuwetę w spektrofotometrze we właściwej orientacji i zabezpiecz pokrywę.
Zebrać pomiar absorbancji lub widmo o tej samej długości fali lub zakresie długości fal co ślepa próba. Odejmij ślepe widmo lub pomiar, jeśli przyrząd nie robi tego automatycznie.
Na podstawie zebranego widma absorbancji określ maksimum absorbancji lub ?max.
Aby określić ilościowo ilość analitu w próbce, utwórz krzywą kalibracyjną przy użyciu zakresu znanych stężeń analitu. Aby uzyskać więcej informacji na temat konstruowania i używania krzywej kalibracyjnej, obejrzyj film "Krzywe kalibracyjne".
Pomiar absorbancji może być również wykorzystany do obliczenia kinetyki reakcji poprzez pomiar wzrostu lub spadku stężenia związków w trakcie reakcji. Rozpocząć od wykonania wstępnego odczytu próbki, w tym przypadku niebieskiego barwnika, przy maksimum absorbancji przed reakcją.
Następnie szybko dodaj odczynnik, w tym przypadku wybielacz, aby rozpocząć reakcję chemiczną. Dobrze wymieszaj, aby zmieszał się z próbką.
Zmierzyć absorbancję przy maksymalnej absorbancji w czasie.
Pokazano początkowe widmo absorbancji próbki niebieskiego barwnika. Kolory tła pokazują kolory światła w widzialnym spektrum. Niebieski barwnik ma maksimum absorbancji przy około 630 nm.
Kinetykę reakcji między niebieskim barwnikiem a wybielaczem mierzono w czasie. Absorbancja niebieskiego barwnika zmniejsza się z czasem, ponieważ reaguje on z wybielaczem. Absorbancja osiąga wartość bliską zeru po 300 s, co wskazuje, że reakcja zbliża się do końca. Aby uzyskać więcej informacji na temat kinetyki i reakcji, obejrzyj film JoVE Science Education "Prawa szybkości reakcji".
Spektroskopia UV-VIS jest szeroko stosowana w wielu różnych obszarach badawczych do identyfikacji lub ilościowego oznaczania próbki.
Na przykład spektroskopia UV-VIS jest szeroko stosowana w dziedzinach biologii do ilościowego określania ilości białka w próbce. Test Bradforda jest często używany do ilościowego oznaczania białek za pomocą barwnika. Najpierw przygotowuje się krzywą kalibracyjną znanych stężeń białka, zwykle przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej lub BSA. Następnie do każdego z wzorców i do próbki dodaje się niebieską plamę Coomassie. Następnie mierzy się absorbancję kompleksu białko-barwnik przy długości fali 595 nm.
Alternatywnie, białka można mierzyć bezpośrednio na podstawie ich absorbancji przy 280 nm. W tym przykładzie stężenie białka określa się ilościowo za pomocą spektrofotometru o bardzo małej objętości. W przypadku wielu białek absorbancja 1 koreluje ze stężeniem 1 mg/ml.
Spektroskopia UV-Vis jest również stosowana do ilościowego określania ilości komórek bakteryjnych w hodowli komórkowej. W tym pomiarze absorbancję, czyli gęstość optyczną, mierzy się przy długości fali 600 nm. Zazwyczaj pomiar OD600 wynoszący 1 wskazuje na obecność 8 x 108 komórek bakteryjnych na ml. Pomiar gęstości komórek podczas wzrostu hodowli umożliwia wyznaczenie krzywej wzrostu bakterii i może pomóc w określeniu, kiedy kultura znajduje się w fazie wzrostu wykładniczego.
Tlenek azotu i dwutlenek azotu (NOx) są produktem ubocznym spalin samochodowych i mogą być szkodliwe dla środowiska, ponieważ tworzą szkodliwy ozon troposferyczny. NOx można mierzyć, reagując z roztworem kwasu sulfanilowego i naptylo-etylenodiaminy. Otrzymany roztwór to różowa cząsteczka barwnika azowego, której intensywność jest bezpośrednio skorelowana ze stężeniem NOx. Stężenie to można następnie określić za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do spektroskopii UV-widzialnej. Powinieneś teraz zrozumieć podstawy działania UV-Vis, jak mierzyć próbkę za pomocą UV-Vis i jak skorelować absorbancję ze stężeniem próbki.
Dzięki za oglądanie!
