Izolacja bakterii kałowych z próbek wody przez filtrację

1. Pobieranie i przetwarzanie próbek wody

1. Zbierz kilka próbek wody o pojemności 1 l z testowego źródła wody (e.g. fontanny, baseny, zbiorniki, systemy dystrybucji wody, ścieki surowe lub oczyszczone) i transportuj na lodzie do laboratorium w celu analizy mikrobiologicznej.
2. Wysterylizuj lub zdezynfekuj zespół kolektora filtracji membranowej przed użyciem przez autoklawowanie, wystawienie na promieniowanie UV (2 min) lub zapłon płomienia etanolu.
3. Po schłodzeniu wszystkich części prawidłowo podłącz kolektor do pompy próżniowej i kolby na odpady do filtracji próżniowej zawierającej wybielacz.
4. Płomień etanolu wysterylizuj parę kleszczy i za ich pomocą wyjmij sterylny, siatkowy filtr membranowy z opakowania. Zwykle stosuje się membrany o średnicy 47 mm i wielkości porów 0,45 μm. Można jednak stosować alternatywne średnice i rozmiary porów, pod warunkiem, że wielkość porów może wystarczająco uwięzić docelowe mikroorganizmy i co najmniej 70% obszaru filtra składa się z przestrzeni porów.
5. Umieść filtr na środku obszaru filtracji membranowej kolektora, a następnie nałóż sterylny lejek filtrujący na urządzenie i zabezpiecz go na miejscu.
6. Odmierz żądaną objętość wody testowej (e.g. 100 ml) i dodaj ją do lejka (na lejku widoczny jest znak linii 100 ml).
7. Zastosować podciśnienie cząstkowe [różnica ciśnień od 34 do 51 kPa (kilopaskal)] w celu przeciągnięcia badanej próbki przez filtr. Całkowita zawiesina materiału stałego, w tym bakterie i rozkładająca się materia organiczna, większa niż średnia wielkość porów filtra wynosząca 0,45 μm, jest uwięziona na filtrze. Mniejsze cząstki, w tym wirusy i rozpuszczone ciała stałe, takie jak niewielkie ilości materii organicznej i soli, przejdą przez membranę i trafią do pojemnika na odpady, kolby próżniowej zawierającej wybielacz.
8. Po całkowitym przejściu próbki przez filtr przepłukać wnętrze lejka dwoma lub trzema objętościami sterylnej wody o pojemności 20-30 ml.
9. Wyłącz próżnię i wyjmij lejek z kolektora po zamknięciu ostatniego płukania.
10. W przypadku kleszczy sterylizowanych płomieniem etanolu należy natychmiast wyjąć filtr membranowy z urządzenia i niezwłocznie umieścić go na odpowiednim pożywce agarozowej dla docelowego mikroorganizmu (Tabela 1 zawiera zalecane podłoża wzrostowe i warunki inkubacji dla każdego z nich).
11. Nałożyć filtr membranowy na powierzchnię agarozy ruchem rolkowym, aby zapewnić całkowity kontakt membrany z pożywką wzrostową i uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.
12. Wymień zużyty lejek filtracyjny na sterylną jednostkę między przetwarzaniem każdej próbki i odkaż etanolem kolektor ze stali nierdzewnej, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

2. Wyliczanie kolonii

1. Po okresie inkubacji wyjąć płytki wzrostowe z inkubatora w celu policzenia.
2. Najlepiej jest przeprowadzić liczenie kolonii w powiększeniu o niskiej mocy, używając chłodnego, białego źródła światła.
3. Bakterie z grupy coli ogółem
   1. Całkowite kolonie bakterii z grupy coli mają zazwyczaj kolor od różowego do ciemnoczerwonego z metalicznym połyskiem powierzchni. Sam połysk może częściowo lub całkowicie pokryć kolonię. Nietypowa całkowita morfologia kolonii coli może być ciemnoczerwona, śluzowata lub jądrzasta bez połysku.
   2. Kolonie, które są różowe, niebieskie, białe lub bezbarwne, a jednocześnie pozbawione połysku, są uważane za inne niż bakterie z grupy coli.
4. Bakterie z grupy coli w kale
   1. Kolonie bakterii z grupy coli w kale pojawiają się w różnych odcieniach niebieskiego.
   2. Kolonie bakterii z grupy coli bez kału mają kolor szary do kremowego.
5. Enterokoki kałowe
   1. Kolonie enterokoków kałowych mają kolor od różowego do ciemnoczerwonego.

3. Weryfikacja kolonii

1. Bakterie z grupy coli ogółem
   1. W celu weryfikacji obecności-nieobecności należy pobrać wymaz z całej membrany za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania. W przypadku kolonii zaleca się weryfikację co najmniej pięciu morfologii typowych i nietypowych.
   2. Przenieś wybraną kolonię do szklanego naczynia zawierającego bulion z tryptozy laurylowej za pomocą rurki Durhama. Inkubować zaszczepione probówki w temperaturze 35±0,5 °C przez 48 godzin. Obecność zmętnienia wskazującego na wzrost w połączeniu z produkcją gazu weryfikuje, czy kolonia jest bakterią z grupy coli.
2. Bakterie z grupy coli w kale
   1. Przenieść kolonie o niebieskim kolorze aseptycznie do szklanych naczyń zawierających sterylną pożywkę EC za pomocą probówki Durhama. Inkubować zaszczepione probówki w temperaturze 44,5 ± 0,2 °C przez 24 godziny. Obecność zmętnienia wskazującego na wzrost w połączeniu z produkcją gazu weryfikuje, czy kolonia jest bakterią z grupy coli.
3. Enterokoki kałowe
   1. Uderz w kolonie o typowej morfologii enterokoków kałowych w celu aseptycznej izolacji na agarze do infuzji mózgowo-sercowej (BHIA) i inkubuj w temperaturze 35 ± 0,5 °C przez 24 do 48 godzin.
   2. Przenieś wzrost z izolowanej kolonii na BHIA na dwa wstępnie oczyszczone szkiełka.
   3. Dodaj dwie do trzech kropli 3% nadtlenku wodoru do przygotowanych rozmazów na szkiełkach. Szybkie pojawienie się pęcherzyków wskazuje na wynik "katalazo-dodatni", a izolat nie jest bakterią Streptococcus w kale.
   4. Wykonaj barwienie metodą Grama dla izolatów, które są testowane jako "katalazoujemne" (nie zaobserwowano pęcherzyków). Enterokoki kałowe są Gram-dodatnie, jajowate i pojawiają się głównie w parach lub krótkich łańcuchach.

Wskaźnik bakterii kałowych	Polecane media (Temperatura inkubacji, czas)1
Bakterie z grupy coli ogółem	LES Endo Agar (35 ± 5 °C, 24 h) M-Endo Medium (35 ± 5 °C, 24 h)
Bakterie z grupy coli w kale	m-FC Medium (44.5 ± 0.2 °C, 24 h)
Enterokoki kałowe	m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 °C, 48 h)

Tabela 1. Powszechnie stosowane pożywki hodowlane do wykrywania wskaźników bakterii kałowych w próbkach środowiskowych
¹ Zgodnie z zaleceniami Standardowe metody badania wody i ścieków (Amerykańskie Stowarzyszenie Zdrowia Publicznego i Amerykańskie Stowarzyszenie Wodociągów, 22^nd Edition, 2012)