Izolacja bakterii kałowych z próbek wody przez filtrację

Filtracja membranowa, a następnie hodowla zebranych bakterii jest przydatną techniką oceny jakości i czystości źródła wody.

Jakość wody przeznaczonej do użytku w rolnictwie, rekreacji lub gospodarstwie domowym ma ogromne znaczenie ze względu na możliwość wystąpienia ognisk chorób przenoszonych przez wodę. Jeśli woda jest zanieczyszczona kałem zwierząt lub ludzi, wówczas chorobotwórcze pasożyty, bakterie lub wirusy mogą przenosić się na nowych gospodarzy po ich spożyciu. Monitorowanie źródeł wody pod kątem takich organizmów chorobotwórczych ma zatem kluczowe znaczenie dla zapewnienia zdrowia publicznego.

Sama liczba i różnorodność patogenów kałowo-oralnych, które mogą być obecne w źródle wody, sprawia, że niepraktyczne jest oznaczanie każdego z nich niezależnie i regularnie. Zamiast tego powszechne testy mikrobiologiczne jakości wody wykorzystują bakterie wskaźnikowe z grupy coli. Więcej informacji na temat tego procesu można znaleźć w filmie z tej kolekcji na temat organizmów wskaźnikowych.

Ten film zilustruje proces filtracji membranowej na próbce wody środowiskowej, pokaże, jak hodować kilka rodzajów bakterii wskaźnikowych kału, w tym bakterie z grupy coli ogółem, bakterie z grupy coli w kale i jelita kałowe, a także opisze, jak zweryfikować obecność zanieczyszczenia kałem.

Technika filtracji membranowej wykorzystuje podciśnienie do pobierania próbek wody przez filtr i zatrzymywania bakterii. Filtr jest specjalistyczną membraną o minimalnej średniej wielkości porów 0,45 μm, która umożliwia wychwytywanie bakterii, które zwykle mają wielkość około 1 μm. Po przefiltrowaniu membranę nakłada się na pożywkę wzrostową agarozy i inkubuje w warunkach odpowiednich do hodowli docelowych mikroorganizmów.

Ta technika jest najbardziej idealna dla źródeł o niskim zmętnieniu, takich jak woda pitna, baseny lub jeziora i zbiorniki. Woda o wysokiej zawartości cząstek stałych może powodować zanieczyszczenie lub zatkanie filtra, ograniczając objętość, którą można przetworzyć. Ponadto filtracja membranowa nie jest praktyczna w przypadku źródeł wody zawierających dużą liczbę bakterii tła lub bakterii innych niż bakterie z grupy coli, takich jak surowe ścieki, ponieważ może to zwiększyć trudność w zliczeniu docelowych bakterii z grupy coli podczas hodowli i inkubacji.

Po uwięzieniu próbek bakteryjnych w filtrze można je przenieść na płytki wzrostowe w celu określenia rodzajów bakterii wskaźnikowych obecnych w próbkach wody. Posiewanie na różnych typach pożywek wybiera różne typy bakterii i może pozwolić na szybką identyfikację.

Po wyhodowaniu na płytkach specyficznych dla hodowli, dalsze potwierdzenie tożsamości bakterii wskaźnikowych można przeprowadzić za pomocą technik takich jak pobieranie kolonii do płynnych pożywek i używanie probówek Durhama do wychwytywania gazów, które powinny być wytwarzane tylko w obecności bakterii z grupy coli w kale lub bakterii z grupy coli ogółem. Dodatkowo, podejrzenie enterokoków kałowych można potwierdzić przez połączenie dodatniego barwienia metodą Grama wraz z ujemnym testem katalazy nadtlenku wodoru.

Teraz, gdy jesteśmy już zaznajomieni z zasadami filtracji membranowej próbek wody, przyjrzyjmy się, jak przeprowadza się tę procedurę.

Aby rozpocząć procedurę, najpierw zbierz próbki wody z badanych źródeł wody. Upewnij się, że próbki są zbierane w sterylnych butelkach o pojemności 1 litra. Po zakończeniu pobierania umieść próbki na lodzie i przetransportuj je do laboratorium w celu analizy mikrobiologicznej.

Aby rozpocząć analizę, najpierw wysterylizuj membranowy kolektor filtracyjny. Następnie podłączyć kolektor do pompy próżniowej i kolby filtracyjnej zawierającej wybielacz.

Kleszczyki do sterylizacji płomieniowej etanolu i usuń z opakowania sterylną membranę z siatką. Umieść filtr na środku obszaru filtracji membranowej kolektora i nałóż sterylny lejek filtra na urządzenie, a następnie zabezpiecz na miejscu.

Odmierz żądaną objętość wody testowej do lejka. Zastosuj częściowe podciśnienie, aby przeciągnąć badaną próbkę przez filtr. Zawieszony materiał stały, w tym bakterie i inna materia organiczna, większy niż 0,45 μm zostanie uwięziony na filtrze lub w jego wnętrzu, podczas gdy mniejsze cząstki, wirusy i rozpuszczone ciała stałe przejdą do kolby na odpady zawierającej wybielacz.

Po przejściu próbki przez filtr przepłukać wnętrze lejka 3 razy 25 ml sterylnej wody, pozwalając jej przejść przez filtr. Po zakończeniu ostatniego płukania odłącz odkurzacz i wyjmij lejek z kolektora.

Następnie sterylizuj płomieniowo kleszcze na bazie etanolu i natychmiast wyjmij filtr membranowy z urządzenia. Umieść go na odpowiedniej płytce wzrostowej dla docelowego mikroorganizmu, wykonując ruch toczny, aby zapewnić pełny kontakt z powierzchnią i uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza.

Do przetwarzania każdej kolejnej próbki należy zdezynfekować kolektor ze stali nierdzewnej i użyć sterylnego lejka, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Na koniec umieść płytki w inkubatorze na odpowiedni okres inkubacji.

Po okresie inkubacji wyjąć płytki z inkubatora w celu sporządzenia numeru. Jeśli to możliwe, przeprowadź liczenie kolonii w powiększeniu o niskiej mocy, używając chłodnego źródła białego światła. Aby określić całkowitą liczbę bakterii z grupy coli, zidentyfikuj i policz kolonie, które mają kolor od różowego do ciemnoczerwonego i mają metaliczny połysk powierzchni całkowicie lub częściowo pokrywający kolonię. Nietypowe całkowite kolonie bakterii z grupy coli mogą wydawać się ciemnoczerwone, śluzowate lub jądrzaste bez połysku.

Kolonie, które wydają się niebieskie, białe, bezbarwne lub różowe bez połysku, są uważane za inne niż bakterie z grupy coli i nie powinny być uwzględniane w całkowitej liczbie bakterii z grupy coli.

Kolonie bakterii z grupy coli w kale pojawią się w różnych odcieniach niebieskiego i należy je liczyć jako osobną kategorię. Kolonie bakterii z grupy coli bez kału są zazwyczaj koloru od szarego do kremowego i powinny być również rejestrowane w indywidualnej kategorii. Wreszcie, kolonie enterokoków kałowych będą miały kolor od różowego do ciemnoczerwonego i powinny być liczone osobno.

Aby zweryfikować całkowitą liczbę kolonii bakterii z grupy coli, zastosuj wysterylizowaną i schłodzoną pętlę inokulacyjną do pojedynczej kolonii będącej przedmiotem zainteresowania. Przenieś wybraną kolonię do szklanego naczynia zawierającego bulion z tryptozy laurylowej i probówkę Durhama. Następnie umieść kultury w inkubatorze. Obecność zmętnienia wraz z produkcją gazu wychwyconą przez rurkę Durhama weryfikuje, że kolonia jest całkowicie z grupy coli.

W celu weryfikacji bakterii z grupy coli w kale należy aseptycznie przenieść kolonie koloru niebieskiego do szklanych naczyń zawierających sterylną pożywkę EC i probówkę Durhama. Umieść zaszczepione probówki w inkubatorze. Po inkubacji, mętne inokulacje w połączeniu z produkcją gazu potwierdzają, że kolonia jest bakterią z grupy coli w kale.

Aby potwierdzić enterokoki kałowe, należy w asepcie przenieść podejrzane kolonie o prawidłowej morfologii na płytki agarowe do infuzji mózgowo-sercowej i inkubować. Następnie przenieś wzrost z izolowanej kolonii na BHIA na dwa sterylne szkiełka podstawowe.

Dodaj 2-3 krople 3% nadtlenku wodoru do jednego ze szklanych szkiełek. Szybka produkcja gazu wskazuje na bakterię katalazo-dodatnią, taką jak Citrobacter. Enterokoki kałowe są katalazowo ujemne; Dlatego nie obserwuje się bulgotania. W przypadku kolonii katalazo-ujemnych, które nie wykazują bulgotania, wykonaj barwienie metodą Grama. Jako enterokoki kałowe powinny one wydawać się Gram-dodatnie, jajowate i być pogrupowane głównie w pary lub krótkie łańcuchy.

Znalezienie którejkolwiek z tych bakterii wskaźnikowych w źródle wody wskazuje na obecność zanieczyszczenia. Jeżeli w ciągu jednego miesiąca okaże się, że więcej niż 5% próbek jest zanieczyszczonych, źródło może zostać uznane za nienadające się do spożycia przez ludzi.

Filtracja membranowa jest powszechnie stosowana w wielu zastosowaniach biologicznych, a organizmy wskaźnikowe kałowe można również wykrywać za pomocą innych procedur eksperymentalnych. Niektóre z tych zastosowań są badane tutaj.

Filtracja membranowa może być również stosowana do wychwytywania wirusów z próbek wody. Ponieważ wirusy są zazwyczaj obecne w bardzo niskich stężeniach, próbki wody muszą być zagęszczone, aby pobrać je do analizy. Przechwycone wirusy mogą być następnie uwalniane z filtrów i identyfikowane za pomocą technik takich jak testy zakaźności hodowli komórkowych lub PCR.

Filtracja membranowa jest również wykorzystywana w produkcji wody o wysokiej czystości do użytku przemysłowego lub laboratoryjnego. Wiele gałęzi przemysłu wymaga wysoko oczyszczonej wody do procesów operacyjnych, a filtracja membranowa może służyć do usuwania zanieczyszczeń, w tym niepożądanych rozpuszczonych metali i soli z wody. Może być również stosowany do odsalania słonej wody w celu produkcji wody pitnej.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do identyfikacji organizmów wskaźnikowych w wodzie za pomocą filtracji membranowej. Powinieneś teraz zrozumieć, jak filtrować próbki wody metodą membranową, jak hodować kilka rodzajów bakterii wskaźnikowych kałowych z membrany i jak potwierdzić, że są to organizmy wskaźnikowe. Dzięki za oglądanie!