Podawanie związków III

Czasami różne podejścia eksperymentalne wymagają stosowania rzadziej stosowanych dróg podawania związków u gryzoni. Śródskórna, donosowa i wewnątrzczaszkowa to trzy z takich alternatywnych dróg, których naukowcy biomedyczni używają obecnie w laboratoriach.

Jak sama nazwa wskazuje, śródskórny dostarcza związki do zewnętrznych warstw skóry właściwej. Donosowo polega na umieszczeniu roztworu w nozdrzach zwierzęcia. A wewnątrzczaszkowe polega na wbiciu igły bezpośrednio do mózgu gryzonia.

Specjalistyczne szkolenie jest niezbędne do skutecznego wykonania tych procedur. Tutaj najpierw zilustrujemy rozważania dotyczące każdej z tych metod, a następnie zademonstrujemy techniki, które pomogą Ci nauczyć się procedur, zapewniając jednocześnie bezpieczeństwo zwierzęcia i sukces eksperymentu.

Zacznijmy od omówienia tego, kiedy te drogi są zwykle stosowane i o czym należy pamiętać przed rozpoczęciem stosowania tych specjalistycznych technik administracyjnych.

Iniekcje śródskórne służą do dostarczenia artykułu do przestrzeni między naskórkiem a skórą właściwą Ta droga jest zwykle zarezerwowana do oceny stanu zapalnego, diagnostyki przepływu krwi w skórze lub reakcji alergicznych na antygen. Podobnie jak w przypadku innych dróg, również roztwór śródskórny powinien być przygotowywany techniką sterylną. I musi być fizjologicznie buforowany, aby miał neutralne pH, aby uniknąć martwicy tkanek w miejscu wstrzyknięcia. Do tego wstrzykiwania często stosuje się system bez piasty z igłą o rozmiarze 25-30. System ten pomaga w zachowaniu objętości podawania, która mieści się w zakresie 50-100 mikrolitrów na miejsce wstrzyknięcia. Wstrzyknięcie nadmiaru może spowodować martwicę lub niepożądany wyciek związku z powodu ciśnienia.

Droga donosowa jest często wybierana do miejscowego dostarczania szczepionek lub sprayu obkurczającego naczynia krwionośne, a także do podawania ogólnoustrojowego i OUN. Błona śluzowa wyściełająca jamę nosową ma bogate zaopatrzenie w naczynia krwionośne i nerwy, które pozwalają na szybkie wchłanianie ogólnoustrojowe i bezpośrednie kierowanie do OUN. Jest to nieinwazyjna metoda, która wymaga minimalnego przeszkolenia i umiejętności oraz prostego sprzętu - skalibrowanej mikropipety i kilku jednorazowych końcówek. Objętości podawane szczurom nie powinny przekraczać 40-100 mikrolitrów podanych w kroplach po 6-10 mikrolitrów. A dla myszy maksymalna całkowita objętość to 24 mikrolitry podane w kroplach 3-4 mikrolitrów.

Chociaż znieczulenie nie jest wymagane do tej procedury, ma pewne zalety w porównaniu z podawaniem donosowym u zwierząt przytomnych 1) ułatwia prawidłowe umieszczenie związku w nozdrzach, zapewniając dokładne dawkowanie 2) eliminuje możliwość ugryzienia przez zwierzę sprzętu dozującego 3) zapewnia, że nie dojdzie do uszkodzenia tkanki nosowej zwierzęcia, oczu, lub skóra twarzy z powodu szarpania głową, oraz 4) zwierzę jest mniej skłonne do parskania i rozpylania związku z nozdrzy po podaniu.

Wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe u dorosłych myszy i szczurów wykorzystują sprzęt stereotaktyczny, co opisano w filmie z kolekcji "Essentials of Neuroscience". Sprzęt zapewnia prawidłowe ustawienie i prawidłową głębokość wtrysku. Tutaj skupimy się na porodzie wewnątrzczaszkowym u noworodków myszy i szczurów, u których czaszka jest wystarczająco cienka, aby wstrzyknąć ją bezpośrednio przez nią i może być zbyt delikatna, aby utrzymać urządzenie stereotaktyczne. Głównym celem tej techniki jest dostarczanie środków farmakologicznych OUN bezpośrednio do OUN i unikanie skutków występujących jakąkolwiek drogą ogólnoustrojową. Rozstaw igieł, długość i objętość podawania określa się na podstawie gatunku i wieku młodych. Należy pamiętać, że wraz ze wzrostem wieku zwierzęcia zmniejsza się liczba wskaźnika, zwiększa się wymagana długość igły, a także zwiększa się maksymalna zalecana objętość podawania.

Mając na uwadze te podstawowe informacje, zagłębmy się w procedury tych metod iniekcji. Pierwszą z nich jest technika podawania śródskórnego. Zabieg ten musi być wykonywany u zwierząt znieczulonych. Obejrzyj inny film z tej kolekcji, aby zrozumieć procedury indukcji i konserwacji znieczulenia.

Po znieczuleniu zwierzęcia należy ogolić miejsce wstrzyknięcia za pomocą elektrycznej maszynki do golenia lub kremu do depilacji. Za pomocą gazy zwilżonej wodą dokładnie usuń zalegające włosy z tego miejsca. Następnie za pomocą innego gazika nałóż miejscowy roztwór antyseptyczny na ogolony obszar. Przed podaniem należy najpierw ustabilizować skórę w miejscu wstrzyknięcia, rozciągając ją między kciukiem a palcem wskazującym.

Teraz umieść igłę skośną do góry na skórze i delikatnie włóż ją tuż za skos, tak aby otwór znajdował się między warstwami naskórka a skórą właściwą. Następnie wstrzykuj powoli i zwróć uwagę, że tworzy się pęcherzyk na skórze. Jeśli igła zostanie włożona zbyt głęboko, nie powstanie pęcherzyk. Po wstrzyknięciu należy zrobić przerwę, aby skóra mogła się rozciągnąć i dostosować, a następnie powoli wyjąć igłę. W żadnym momencie nie należy odciągać tłoka, ponieważ mogłoby to spowodować wciągnięcie tkanki i spowodowanie urazu w miejscu wstrzyknięcia. Nie należy również wycierać ani osuszać miejsca wstrzyknięcia, ponieważ może to spowodować wyciek wstrzykniętej substancji. W przypadku wykonywania wielokrotnych wstrzyknięć należy pamiętać o rozstawieniu ich na tyle szeroko, aby pęcherzyki nie zachodziły na siebie.

Następnie dowiedzmy się, jak wygląda procedura podawania donosowego u zwierząt przytomnych i znieczulonych.

W przypadku obudzonych zwierząt należy je powstrzymać, potrząsając skórą na karku, a następnie przytrzymać zwierzę w pozycji pionowej z unieruchomioną głową. Należy uważać, aby nie uciskać klatki piersiowej, ponieważ może to utrudnić zwierzęciu wykonywanie wystarczająco głębokich oddechów, aby wciągnąć płyn do płuc. Za pomocą mikropipety podać część roztworu, umieszczając małą kroplę płynu w otworze nosowym. Zwierzę będzie wdychać kropelkę. Powtórz ten proces, naprzemiennie między dwoma otworami nosowymi, aż zostanie podana cała objętość, która ma być podana. Przypomnienie - całkowita objętość podania nie powinna przekraczać 24 μl i 100 μl odpowiednio u myszy i szczurów.

W przypadku znieczulonych myszy i szczurów należy umieścić zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej. Ta pozycja jest idealna do dostarczania do OUN, ponieważ pozwala na lepsze wchłanianie związku. Obróć głowę zwierzęcia i podaj połowę związku bezpośrednio po jednej stronie otworu nosowego, zsynchronizowując to z inhalacją. Następnie obróć głowę zwierzęcia do pozycji do następnego podania. Po około 2 oddechach podaj pozostałą objętość do drugiego otworu nosowego. Po całkowitym podaniu zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce.

Następnie przyjrzyjmy się procedurze podawania wewnątrzczaszkowego noworodkom myszy i szczurów. Przed rozpoczęciem zabiegu umieść klatkę ze szczeniętami i zaporą na elektrycznej poduszce grzewczej ustawionej na niski poziom. Upewnij się, że część klatki znajduje się poza poduszką grzewczą. Ma to na celu zapobieżenie hipotermii, a jednocześnie umożliwienie zaporze odsunięcia się od ciepła, jeśli sobie tego życzy. Następnie wybierz rozstaw igieł odpowiedni do wieku zwierzęcia. Przypomnij sobie, miernik igieł; długość igły, która służy do kontrolowania głębokości igły podczas wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego; i objętość administracji... Wszystkie różnią się w zależności od wieku i gatunku zwierzęcia.

Długość regulowana jest za pomocą osłony. Aby przygotować tę osłonę, przyłóż właściwą igłę do jej nasadki i zaznacz ją. Następnie umieść drugi znak na nasadce, aby wskazać, gdzie zostanie wycięta. Odległość między dwoma znakami to pożądana długość igły. Następnie odetnij nakrętkę żyletką. Nie używaj nożyczek, ponieważ zmiażdżą one nasadkę i nie zapewnią czystego, równego cięcia. To jest "osłona przed igłami". Wyrzuć igłę użytą do stworzenia osłony, ponieważ nie jest ona już sterylna, a zamiast tego włóż nową igłę do osłony i upewnij się, że odsłonięta jest odpowiednia długość. Następnie, za pomocą innej igły przymocowanej do odpowiedniej strzykawki, pobrać substancję do wstrzykiwań. Do tego celu używa się innej igły, ponieważ umieszczenie w korku znacznie stępi te drobne igły, co nie jest idealne do podawania wewnątrzczaszkowego. Następnie umieścić napełnioną strzykawkę na igle z osłoną. Teraz system jest gotowy do wstrzyknięcia.

W przypadku szczeniąt powyżej 10 dnia życia należy podawać znieczulenie wziewne. Szczenięta w wieku poniżej 10 dni nie muszą być znieczulane. Aby wykonać wstrzyknięcie, należy najpierw zlokalizować miejsce, które znajduje się 5 mm za okiem i około 3 mm od linii środkowej czaszki. Następnie wprowadzić igłę na głębokość dozwoloną przez osłonę igły. Następnie należy wstrzykiwać powoli, równomiernie, aby uniknąć urazu mózgu. Natychmiast i z dużą ostrożnością należy usunąć igłę, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej. Na koniec umieść zwierzę z powrotem w tamie, aby umożliwić mu prawidłową regenerację.

Przyjrzyjmy się teraz niektórym eksperymentom przeprowadzanym obecnie w laboratoriach, które wykorzystują te rzadkie drogi podawania.

Wstrzyknięcie śródskórne jest często stosowane do badania reakcji zapalnej skóry. W tym eksperymencie naukowcy wykorzystali tę metodę do wstrzyknięcia alergenu do jednego ucha i neutralnej substancji do drugiego ucha wstępnie uczulonej myszy. Następnie dostarczyli niebieski barwnik do układu krążenia zwierzęcia, aby zbadać zmiany w przepuszczalności naczyń krwionośnych spowodowane wstrzyknięciem alergenu.

Jak wspomniano wcześniej, jednym z zastosowań podawania donosowego jest podawanie szczepionek. W tym przypadku naukowcy wykorzystali tę drogę do dostarczenia genetycznie zmodyfikowanej, żywej atenuowanej szczepionki przeciw grypie myszom typu dzikiego i transgenicznego oraz zbadali odporność błony śluzowej poprzez produkcję określonego typu limfocytów T.

Wreszcie, w tych badaniach biomedycznych wykorzystano podawanie wewnątrzczaszkowe do wszczepienia komórek rakowych myszom z obniżoną odpornością, w celu stworzenia modelu guza ludzkiego mózgu. Skuteczność wstrzyknięcia została następnie przeanalizowana za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obejrzałeś już film JoVE na temat niektórych specjalnych metod podawania związków u myszy laboratoryjnych i szczurów. Powinien Pan/Pani teraz zrozumieć, kiedy te procedury są pomocne, o czym należy pamiętać przed i w trakcie wykonywania tych technik, a także niezbędne kroki proceduralne w celu zapewnienia, że podanie ma minimalny wpływ na zdrowie zwierzęcia i na dane doświadczalne, które mają być zebrane. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!