$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ekstrakcja DNA społeczności bakteryjnej to proces, w którym DNA uzyskuje się z wielu gatunków bakterii w społeczności podczas jednej procedury ekstrakcji.
Tradycyjne analizy zbiorowisk drobnoustrojów w glebie zwykle obejmowały testy kulturowe, wykorzystujące metodologię rozcieńczania i posiewu na różnych pożywkach selektywnych. Jednak wiele bakterii słabo rośnie w warunkach laboratoryjnych lub na wybranych określonych warunkach pożywki, co oznacza, że mogą być pominięte lub poważnie niedostatecznie reprezentowane.
Ostatnio ekstrakcja DNA społeczności z próbek bakterii glebowych pozwoliła na bardziej kompleksowe pobieranie próbek społeczności bakteryjnych. Uważa się, że to podejście nieoparte na kulturze jest bardziej reprezentatywne dla rzeczywistych społeczności niż tradycyjne metody oparte na kulturze.
Ten film pokaże niehodowlaną metodę ekstrakcji DNA społeczności bakteryjnej, jak sprawdzić jakość i ilość wyekstrahowanego DNA oraz zbadać, w jaki sposób to DNA może być wykorzystane do badania różnorodności bakterii.
Ekstrakcję DNA z gleby można przeprowadzić na jeden z dwóch sposobów. W metodzie frakcjonowania komórki są najpierw oddzielane od matrycy glebowej przed ekstrakcją materiału genetycznego. Próbka jest następnie poddawana kolejnym cyklom mieszania i powolnego wirowania w celu zebrania nienaruszonych komórek w osadzie.
Lizozymy są następnie dodawane do komórek, a zawiesina jest inkubowana. Lizozymy to enzymy, które rozkładają ściany komórkowe bakterii. Gdy struktura ściany komórkowej zostanie naruszona, DNA może zostać uwolnione w celu oczyszczenia. Wykazano jednak, że druga metoda ekstrakcji DNA społeczności, metoda in situ, daje większe stężenie DNA.
W tym przypadku masa gleby jest łączona z równoważną objętością bufora ekstrakcyjnego Tris-EDTA i szklanych kulek, a następnie agresywnie mieszana, aby ułatwić oddzielenie komórek od cząstek gleby. Następnie dodaje się detergent, zwykle dodecylosiarczan sodu lub SDS, a próbka jest dalej mieszana w celu pobudzenia lizy komórek i uwolnienia ich zawartości, w tym DNA.
Następnie przeprowadza się inkubację w wysokiej temperaturze w celu lizy pozostałych komórek bakteryjnych. Próbki są odwirowywane, a ekstrakcja i inkubacja glikolu polietylenowego jest przeprowadzana na supernatancie w celu wytrącenia DNA, które jest następnie odwirowywane do postaci osadu.
DNA jest ponownie zawieszane w buforze TE i octanie potasu w celu dalszego wypłukania DNA z białek i polisacharydów, a następnie przeprowadza się wirowanie w celu osadzenia tych niepożądanych składników. Wodny supernatant zawierający DNA jest usuwany i poddawany ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i wytrącaniu izopropanolu w celu dalszego oczyszczenia i zagęszczenia DNA. Po dwugodzinnym okresie inkubacji w temperaturze pokojowej DNA jest odwirowywane i ponownie zawieszane w buforze TE w celu przechowywania do czasu analizy.
Teraz, gdy jesteśmy już zaznajomieni z koncepcjami i procesami stojącymi za ekstrakcją DNA społeczności bakteryjnej, przyjrzyjmy się, jak odbywa się to w laboratorium.
Aby rozpocząć procedurę, odważ 100 g przesianej gleby. Dodaj go do naczynia polipropylenowego i dodaj 100 ml buforu ekstrakcyjnego składającego się z buforu Tris wzbogaconego EDTA w celu ułatwienia uwalniania bakterii z matrycy glebowej, a następnie wstrząśnij ręcznie.
Następnie odważ 100 g szklanych kulek i dodaj je do naczynia do mieszania. Mieszać próbkę przez 5 minut za pomocą urządzenia do ubijania kulek lub mechanicznego wstrząsacza nadgarstkowego. Dodać 10 ml 20% dodecylosiarczanu sodu lub SDS do mieszaniny, a następnie mieszać przez dodatkową minutę. Inkubować w wysokiej temperaturze przez 60 minut.
Równomiernie rozprowadzić próbkę w oddzielnych probówkach o pojemności 50 ml i wirować przez 10 minut przy 6,000 x g. Przenieść supernatant z probówek do pojedynczego sterylnego pojemnika. Następnie powtórz ekstrakcję na osadzie glebowym, jak opisano wcześniej, używając świeżej objętości bufora ekstrakcyjnego.
Następnie dodać całkowitą objętość przetworzonego supernatantu do czystej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej do połowy objętości roztworem 30% glikolu polietylenowego i 1,6 M chlorku sodu. Odwróć butelki kilka razy ręcznie, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 20 minut, aby uzyskać granulki DNA.
Ostrożnie usunąć supernatant z probówki wirówkowej, pozostawiając częściowo oczyszczone osady kwasu nukleinowego. Dodać 20 ml buforu TE i 1,5 ml 7,5 M roztworu octanu potasu, aby ponownie zawiesić osad, a następnie odwirować. Umieść zawiesinę na lodzie na 5 minut. Wirować przy 16 000 x g przez 30 min przy 4 ? C do wytrącania białek i polisacharydów.
Następnie dodaj RNAzę i proteinazę K do próbki, delikatnie wymieszaj ręcznie i odstaw na chwilę. Dodać równoważną objętość alkoholu fenolowo-chloroformowego do zawiesiny, która ma być ekstrahowana, i delikatnie wymieszać ręcznie. Odwirowywać preparat przez 10 minut przy 13 000 x g. Ostrożnie wyjmij naczynie z wirówki i zwróć uwagę na dwie warstwy.
Dolna, cięższa warstwa składa się z fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego i wyekstrahowanych szczątków, a górna warstwa jest wodna i zawiera DNA. Umieść fazę wodną w sterylnym naczyniu, dodaj równoważną objętość izopropanolu i delikatnie odwróć, aby zainicjować wytrącanie DNA. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Oczyszczone DNA osadzać przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g przez 30 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, ponieważ granulowane DNA może, ale nie musi być widoczne na dnie naczynia, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml buforu TE.
Za pomocą spektrofotometru lub fluorymetru do oznaczania ilościowego DNA/RNA zmierz poziom DNA wyekstrahowanego z próbki. Fluorymetry DNA/RNA będą wyświetlać poziomy DNA w jednostkach nanogramów na mililitr. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, aby można było uzyskać dokładne odczyty, rozcieńczyć zawiesinę od 1 do 10 lub od 1 do 100 za pomocą wody o czystości cząsteczkowej.
Po uzyskaniu DNA ze społeczności bakteryjnej można je wykorzystać na wiele różnych sposobów. Niektóre z tych zastosowań są badane tutaj.
Analizy spektrofotograficzne DNA wyekstrahowanego z DNA społeczności mogą dostarczyć informacji na temat liczby komórek bakteryjnych obecnych w danej próbce gleby. Szacowana ilość DNA w ng na ml roztworu może być odniesiona z powrotem do całkowitej objętości DNA wyekstrahowanego w roztworze, aby uzyskać całkowitą ilość DNA na g gleby. Znając teoretyczną wartość DNA na komórkę, można obliczyć całkowitą liczbę komórek na g gleby.
W przypadku bardziej ukierunkowanych zastosowań, DNA wyekstrahowane ze społeczności bakteryjnych można poddać PCR w celu określenia, czy dany gatunek jest obecny w społeczności. Na przykład naukowcy mogą chcieć określić, czy próbki gleby zawierają określone patogeny, takie jak Clostridium perfringens lub Bacillus anthracis.
Wreszcie, aby uzyskać bardziej wszechstronne zrozumienie bakterii obecnych w społeczności, próbki DNA można poddać charakterystyce "omicznej" i bioinformatycznej, która pozwala na głębszą analizę oryginalnych bakterii w próbce. ? Omika? Opisuje szereg technologii, które badają role, relacje i działania cząsteczek w organizmach lub społecznościach. Obejmuje to badania nad genami i ich funkcją, lub ? Genomika?, oraz ? Proteomika?, nauka o białkach i ich rolach. Na przykład sekwencjonowanie 16S? RNA z próbek może pozwolić na metagenomiczne określenie określonych gatunków w społeczności, dając bardziej szczegółowe oszacowanie różnorodności. Takie podejście może pomóc naukowcom lepiej zrozumieć skład gatunkowy społeczności i role, jakie mogą one pełnić.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ekstrakcji DNA społeczności bakteryjnej. Powinieneś teraz zrozumieć, jak wyodrębnić DNA ze społeczności bakteryjnej, jak sprawdzić jakość tego DNA i jak to DNA może być wykorzystane do badań składu społeczności bakteryjnej. Dzięki za oglądanie!
