Ekstrakcja DNA społeczności z kolonii bakteryjnych

1. Ekstrakcja DNA społeczności bakteryjnej

1. Aby rozpocząć procedurę, odważ 100 g przesianej gleby. Dodaj go do naczynia polipropylenowego i dodaj 100 ml buforu ekstrakcyjnego składającego się z buforu Tris wzbogaconego EDTA w celu ułatwienia uwalniania bakterii z matrycy glebowej, a następnie wstrząśnij ręcznie.
2. Następnie odważ 100 g szklanych kulek i dodaj je do naczynia do mieszania. Mieszać próbkę przez 5 minut za pomocą urządzenia do ubijania kulek lub mechanicznej wytrząsarki na nadgarstku przez 15 minut. Dodać 10 ml 20% dodecylosiarczanu sodu lub SDS do mieszaniny, a następnie mieszać przez dodatkową minutę. Inkubować w wysokiej temperaturze 60 - 65 °C przez 60 minut.
3. Równomiernie rozprowadzić próbkę w oddzielnych probówkach o pojemności 50 ml i odwirować przez 10 minut przy 6 000 x g. Przenieść supernatant z probówek do pojedynczego sterylnego pojemnika. Następnie powtórz ekstrakcję na osadzie glebowym, jak opisano wcześniej, używając świeżej objętości bufora ekstrakcyjnego.
4. Następnie dodać całkowitą objętość przetworzonego supernatantu, około 200 ml, do czystej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej do połowy objętością roztworem 30% glikolu polietylenowego i 1,6 M chlorku sodu. Odwróć butelki kilka razy ręcznie, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 20 minut w celu osadzenia DNA.
5. Ostrożnie usunąć supernatant z probówki wirówkowej, pozostawiając częściowo oczyszczone osady kwasu nukleinowego. Dodać 20 ml buforu TE i 1,5 ml 7,5 M roztworu octanu potasu, aby ponownie zawiesić osad, a następnie odwirować. Umieść zawiesinę na lodzie na 5 minut. Wirować przy 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia białek i polisacharydów.
6. Następnie dodaj RNAzę i proteinazę K do próbki, delikatnie wymieszaj ręcznie i odstaw na chwilę. Dodać równoważną objętość alkoholu fenolowo-chloroformowego:izoamylowego (mieszanina w proporcji 25:24:1) do zawiesiny, która ma być ekstrahowana, i delikatnie wymieszać ręcznie. Odwirowywać preparat przez 10 minut przy 13 000 x g. Ostrożnie wyjmij naczynie z wirówki i zwróć uwagę na dwie warstwy.
7. Dolna, cięższa warstwa składa się z fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego i wyekstrahowanych szczątków, a górna warstwa jest wodna i zawiera DNA. Umieść fazę wodną w sterylnym naczyniu, dodaj równoważną objętość izopropanolu i delikatnie odwróć, aby zainicjować wytrącanie DNA. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Oczyszczone DNA osadzać przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g przez 30 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, ponieważ granulowane DNA może, ale nie musi być widoczne na dnie naczynia, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml buforu TE.
8. Za pomocą spektrofotometru lub fluorymetru do oznaczania ilościowego DNA/RNA zmierz poziom DNA wyekstrahowanego z próbki. Ilość DNA szacuje się na podstawie odczytu 260 nm. Odczyt absorbancji 1,0 odpowiada 50 μg DNA na ml roztworu. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, aby można było uzyskać dokładne odczyty, rozcieńczyć zawiesinę od 1 do 10 lub od 1 do 100 za pomocą wody o czystości cząsteczkowej.
9. Czystość DNA szacuje się na podstawie stosunku odczytu przy 260 nm do odczytu przy 280 nm. Wartość > 1,7 wskazuje na stosunkowo czyste DNA. Maksymalna wartość teoretyczna to 2,0.