3.11: Elektroforeza kapilarna (CE)

1. Konfiguracja oprzyrządowania CE

1. Włącz instrument CE i komputer. Za pomocą oprogramowania komputerowego włącz źródło światła do analizy UV, aby umożliwić mu rozgrzanie się. Niektóre programy mają wskaźnik, kiedy lampa jest gotowa do użycia (ikona lampy zmienia kolor).
2. Utwórz plik metod. Ustaw ważne parametry do uruchomienia CE. W tej analizie temperatura wkładu i przechowywania próbki wynosi 35 °C. Długość fali do wykrywania UV wynosi 214 nm.
3. Napisz program czasowy. Program zazwyczaj składa się z etapów płukania (w celu oczyszczenia kapilary przed analizą), etapów wtrysku, a następnie etapu elektroforezy. Na etapie płukania wykonaj 2 płukania przez 1 minutę pod ciśnieniem 20 psi. Pierwsze płukanie odbywa się za pomocą NaOH, który pomaga upewnić się, że grupy silanolowe na ścianie kapilary są zdeprotonowane. Drugie płukanie odbywa się za pomocą buforu roboczego (tutaj bufor boranowy 0,025 M), aby upewnić się, że kapilara jest zrównoważona z buforem.
4. Do iniekcji stosuje się wtrysk ciśnieniowy o ciśnieniu 0,5 psi przez 5 s.
5. Dla etapu elektroforezy warunki to napięcie separacji: 20 kV, czas: 5 min, normalna polaryzacja. Dla każdego kroku należy również wskazać, która fiolka jest wlotem, a która fiolką jest wylotem. Zapisz plik metod po wprowadzeniu wszystkich parametrów.

2. Przygotowanie wzorców i próbek sody

1. Przygotuj 500 ppm roztworów podstawowych aspartamu, kofeiny i kwasu benzoesowego w wodzie. Przygotować 50 ml każdego z nich, używając kolby miarowej.
2. Przygotować wzorcowy roztwór 150 ppm aspartamu, 150 ppm kofeiny i 100 ppm kwasu benzoesowego w kolbie miarowej o pojemności 10 ml.
3. Przygotuj standardowe roztwory kofeiny o stężeniu 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm i 200 ppm w kolbach miarowych o pojemności 10 ml.

3. Uruchom próbki na CE

1. Umieścić fiolki zawierające próbki wzorców lub sody w uchwycie na fiolkę z próbką. Upewnij się, że zapisałeś, która próbka znajduje się w którym gnieździe. W dwóch szczelinach znajduje się bufor boranowy i 0,1 M roztwór płuczący NaOH.
2. W pliku metody wprowadź, w którym gnieździe znajduje się pierwsza fiolka z próbką.
3. Uzyskaj pojedynczy przebieg, upewniając się, że wprowadziłeś wszystkie informacje o danych, których żąda program.
4. Kontynuuj zbieranie danych, zmieniając fiolkę wejściową dla każdej próbki. Uruchom wzorzec kombinacji, 3 stężenia kofeiny oraz próbkę Pepsi i Pepsi dietetycznej.
5. Włóż tarczę do instrumentu i wybierz odpowiedni instrument.
6. Przeanalizuj dane na komputerze. Obliczanie obszarów pików i nakładanie standardów oraz rzeczywistych próbek, aby pomóc w identyfikacji pików. Wykonaj krzywą kalibracyjną dla danych dotyczących kofeiny.

Elektroforeza kapilarna lub CE to technika stosowana w analizie chemicznej do oddzielania cząsteczek w polu elektrycznym według wielkości i ładunku.

Elektroforeza kapilarna jest wykonywana w rurce o średnicy submilimetrowej, zwanej kapilarą, która zawiera przepływający roztwór elektrolitu. Próbka jest wstrzykiwana do kapilary i przykładane jest pole elektryczne. Cząsteczki są następnie rozdzielane na podstawie różnicy ich prędkości, na którą wpływa ładunek, rozmiar i lepkość rozpuszczalnika. CE jest idealna do rozdzielania naładowanych cząsteczek i ma większą rozdzielczość niż wysokosprawna chromatografia cieczowa, dzięki czemu jest bardziej wydajna i czuła.

W tym filmie przedstawimy podstawy elektroforezy kapilarnej i zademonstrujemy jej zastosowanie poprzez określenie składu napoju bezalkoholowego.

W CE pole elektryczne jest przykładane do kapilary wypełnionej elektrolitem. Pole elektryczne indukuje ładunek dodatni na wlocie kapilary i ładunek ujemny na wylocie.

Elektrolit przepływa w kapilarze, indukowany przez pole elektryczne. Przepływ ten, zwany przepływem elektroosmotycznym, jest spowodowany ruchem dyskretnej warstwy dodatnio naładowanych jonów soli wzdłuż ujemnie naładowanych ścianek kapilary.

Gdy prąd elektryczny przepływa przez kapilarę, kationy wzdłuż ściany przesuwają się w kierunku ujemnego końca. Ten przepływ jonów wciąga roztwór w środku przez rurkę.

Cząsteczki próbki są następnie rozdzielane na podstawie ich prędkości w kapilarze. Prędkość ta, zwana ruchliwością elektroforetyczną, zależy od ładunku i wielkości cząsteczek oraz od tego, jak bardzo są one przyciągane lub odpychane przez pole elektryczne.

Dodatnio naładowane cząsteczki przepływają szybciej przez kapilarę, ponieważ są bardziej przyciągane do potencjału na wylocie. Ujemnie naładowane cząsteczki płyną znacznie wolniej, ponieważ są bardziej przyciągane do potencjału na wlocie. Obojętne cząsteczki są przenoszone wraz z przepływem masowym. Tak więc kolejność cząsteczek wychodzących z kapilary jest naładowana dodatnio, neutralnie, a następnie ujemnie. Dodatkowo przepływ elektrolitu ciągnie mniejsze cząsteczki szybciej niż większe cząsteczki ze względu na siły tarcia.

Cząsteczki są rejestrowane przez detektor, taki jak UV-Vis, gdy opuszczają kolumnę, i są wizualizowane na wykresie intensywności sygnału detektora w funkcji czasu, zwanym elektroferogramem.

Elektroferogramy mogą dostarczyć szeregu informacji; takie jak liczba różnych związków obecnych w próbce i ilość każdej substancji.

Teraz, gdy widziałeś już krótkie streszczenie elektroforezy kapilarnej, przyjrzyjmy się, jak przebiega ona w laboratorium.

Najpierw włącz przyrząd do elektroforezy kapilarnej i komputer. Następnie włącz detektor UV, aby mógł się rozgrzać.

Ustaw parametry uruchamiania eksperymentu. Najpierw ustaw temperaturę wkładu i przechowywania próbki na 35 ? C i długość fali do wykrywania UV do 214 nm.

Następnie ustaw dwa etapy płukania. Pierwsze płukanie odbywa się wodorotlenkiem sodu, aby upewnić się, że grupy silanolowe na ścianie kapilary są protonowane. Drugie płukanie wykorzystuje biegnący bufor do zrównoważenia kapilary. Następnie ustaw próbkę tak, aby wstrzykiwała się pod ciśnieniem 0,5 psi przez 5 s.

Ustaw krok elektroforezy, wybierając napięcie separacji. W takim przypadku należy użyć napięcia 20 kV przez 5 minut przy normalnej polaryzacji, co oznacza, że pole elektryczne jest dodatnie na wlocie i ujemne na wylocie.

Najpierw przygotuj 50 ml roztworów podstawowych składników sody: aspartamu, kofeiny i kwasu benzoesowego w stężeniu 500 części na milion w wodzie.

Z roztworów podstawowych przygotuj roztwór wzorcowy 150 ppm aspartamu, 150 ppm kofeiny i 100 ppm kwasu benzoesowego.

Następnie przygotuj 4 wzorcowe roztwory kofeiny o stężeniu 50, 100, 150 i 200 ppm. Próbki te zostaną wykorzystane do wykonania krzywej kalibracyjnej. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz film z tej kolekcji na temat krzywych kalibracyjnych.

Na koniec przygotuj próbki sody, odgazowując je azotem. Próbki sody będą analizowane bez rozcieńczania.

Umieścić fiolki zawierające próbki wzorcowe lub próbki sody w uchwycie fiolki. Umieścić również fiolki zawierające bufor wyjściowy i roztwór do płukania wodorotlenku sodu w uchwycie na próbki. Upewnij się, że zapisałeś lokalizację każdego z nich.

W oprogramowaniu przyrządu CE wskazać, w których szczelinach znajdują się dwa roztwory do płukania i pierwsza fiolka z próbką. Teraz uruchom pierwszy przykład.

Następnie uruchom wzorzec kombinacji, 4 stężenia kofeiny oraz zwykłą i dietetyczną próbkę napoju gazowanego, zmieniając fiolkę wejściową.

Po rozdzieleniu wszystkich rozwiązań przeanalizuj dane.

Po pierwsze, użyj wzorców, aby zidentyfikować piki w próbkach napojów gazowanych. Porównanie trzech pików zaobserwowanych w próbce dietetycznego napoju gazowanego z normami pokazuje, że kofeina, aspartam i kwas benzoesowy są obecne w napojach dietetycznych. W zwykłej próbce napoju gazowanego obecny jest tylko szczyt kofeiny, ale nie piki aspartamu i kwasu benzoesowego.

Następnie oblicz powierzchnię piku dla każdego roztworu wzorcowego kofeiny i wykonaj krzywą kalibracyjną. Krzywa kalibracyjna dla kofeiny może być wykorzystana do obliczenia stężenia kofeiny w każdej próbce.

Elektroforeza kapilarna jest stosowana do wielu specjalistycznych separacji w środowisku akademickim i przemysłowym.

CE jest często stosowany jako jeden z elementów testów kontroli jakości w przemyśle farmaceutycznym. Leki, zarówno jako małe cząsteczki, jak i leki biologiczne, mogą być poddawane elektroforezie kapilarnej, aby sprawdzić, czy obecne są jakiekolwiek produkty uboczne. Można go również wykorzystać do określenia, czy białka są prawidłowo pofałdowane, ponieważ fałdowanie może wpływać na ładunek białka.

CE może być również używany do separacji DNA. Korzystając z płytki mikrodołkowej i wielu układów naczyń włosowatych, naukowcy mogą zwiększyć przepustowość pojedynczego eksperymentu, jak pokazano tutaj. Fragmenty DNA rozdzielono na podstawie wielkości, z rozdzielczością do 1 pary zasad. Dzięki temu możliwe jest sekwencjonowanie fragmentów DNA, a także określanie innych parametrów, takich jak warianty liczby kopii, które są wykorzystywane do diagnozowania potencjalnych chorób genetycznych.

Białko może być modyfikowane przez różne grupy funkcyjne, które są chemicznie przyłączone do różnych lokalizacji. Różne kopie tego samego białka mogą się różnić różnymi modyfikacjami, które zmienią ładunek i rozmiar każdego białka. Przepuszczenie oczyszczonych białek przez CE, który jest podłączony do spektrometru mas, może oddzielić białka na podstawie których obecne są modyfikacje, a także zidentyfikować rodzaj i lokalizację modyfikacji.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do elektroforezy kapilarnej. Powinieneś teraz zrozumieć, w jaki sposób CE rozdziela cząsteczki na podstawie ładunku i masy oraz jak przeprowadzić próbkę na CE w laboratorium.

Dzięki za oglądanie!