Chromatografia jonowymienna

1. Przygotowanie próbki i kolumny

1. W tej demonstracji mieszanina 2 białek zostanie oddzielona na kolumnie kationowymiennej: hemoglobiny i cytochromu C. Dodaj 0,2 ml buforu równoważącego (pH 8,1) do próbki białka i zawiruj, aby dokładnie wymieszać. Wirować przez 2 minuty, aby usunąć piankę.
2. Umieść kolumnę kationowymienną w probówce na 5 minut, aby żywica mogła osiąść. Clamp probówkę z kolumną na stojaku pierścieniowym, aby upewnić się, że jest w pozycji pionowej.
3. Otwórz górną zaślepkę kolumny, a następnie dolną zaślepkę. Pozwól, aby bufor w kolumnie kapał pod wpływem grawitacji do probówki.
4. Przemyć kolumnę dwukrotnie objętością kolumny (w tym przypadku objętość kolumny wynosi 0,3 ml) buforu równoważącego. Pozwolić, aby objętość pierwszej kolumny (0,3 ml) buforu równowagi spłynęła do fiolki z odpadami przed dodaniem drugiej objętości kolumny. Ten krok umożliwia zrównoważenie kolumny z buforem równowagi. Na tym etapie powoli dodawaj bufor równoważący, aby nie naruszyć żywicy.

2. Przepuszczanie próbki białka przez kolumnę kationowymienną

1. Umieść kolumnę w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml oznaczonej "Niezwiązany 1". Ostrożnie załaduj 0,1 ml próbki białka na wierzch kolumny.
2. Po załadowaniu próbki na wierzch kolumny, przemyj ją 0,3 ml buforu równowagowego, dodając bufor w górnej części kolumny i pozwalając mu całkowicie przepłynąć. Powtórz ten krok 4 razy (w sumie 5 prań) i zbierz każde płukanie do osobnej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Oznacz probówki jako "Niezwiązane 1-5".
3. Przez ostatnie 2 płukania wirować przez 10 s przy 1,000 x g, aby upewnić się, że wszystkie niezwiązane gatunki odpadły z kolumny. Żadna próbka, która wiąże się z kolumną, nie powinna znajdować się w tych popłuczynach, ale próbka, która nie jest związana, zostanie wypłukana w postaci niezachowanej. Wirowanie zapewnia większą siłę do zmycia niezwiązanych materiałów z kolumny.
4. Umieść kolumnę w nowej probówce do zbierania wirówek o pojemności 2 ml oznaczonej "Bound 1". Umieścić 0,3 ml buforu elucyjnego (o wysokiej zawartości soli, pH 5,5) na wierzchu kolumny. Odwirowywać powstały eluent przez 10 s przy 1,000 x g.
5. Powtórz etap elucji jeszcze 2 razy, umieszczając kolumnę w nowej probówce wirówkowej, dodając 0,3 ml i wirując przez 10 s. Oznacz je jako "Powiązane 2 i 3".
6. Zapisz wszelkie zmiany koloru lub obserwacje dotyczące frakcji. Hemoglobina to kolorowe białko, które wygląda na czerwonawo-brązowe, podczas gdy cytochrom C ma czerwonawe zabarwienie.

3. Wyniki: Kationowa wymiana hemoglobiny i cytochromu C

1. Cytochrom C ma pI 10,5, a hemoglobina pI 6,8. Tak więc, gdy używany jest bufor równowagi pH 8,1, hemoglobina nie wiąże się z kolumną, ponieważ jest naładowana ujemnie. Cytochrom C jest naładowany dodatnio przy tym pH i wiąże się z kolumną, ponieważ pH < pI.
2. Hemoglobina jest obserwowana we frakcjach niezwiązanych, ponieważ nie jest związana z kolumną.
3. Cytochrom C obserwuje się we frakcjach związanych, ponieważ był związany z kolumną kationowymienną.

Rysunek 1. Obraz frakcji niezwiązanej (hemoglobina) i frakcji związanej (cytochrom C).