Chromatografia jonowymienna
Źródło: Laboratorium dr B. Jill Venton - Uniwersytet Wirginii
Chromatografia jonowymienna to rodzaj chromatografii, która rozdziela anality na podstaw…
1. Przygotowanie próbki i kolumny
- W tej demonstracji mieszanina 2 białek zostanie oddzielona na kolumnie kationowymiennej: hemoglobiny i cytochromu C. Dodaj 0,2 ml buforu równoważącego (pH 8,1) do próbki białka i zawiruj, aby dokładnie wymieszać. Wirować przez 2 minuty, aby usunąć piankę.
- Umieść kolumnę kationowymienną w probówce na 5 minut, aby żywica mogła osiąść. Clamp probówkę z kolumną na stojaku pierścieniowym, aby upewnić się, że jest w pozycji pionowej.
- Otwórz górną zaślepkę kolumny, a następnie dolną zaślepkę. Pozwól, aby bufor w kolumnie kapał pod wpływem grawitacji do probówki.
- Przemyć kolumnę dwukrotnie objętością kolumny (w tym przypadku objętość kolumny wynosi 0,3 ml) buforu równoważącego. Pozwolić, aby objętość pierwszej kolumny (0,3 ml) buforu równowagi spłynęła do fiolki z odpadami przed dodaniem drugiej objętości kolumny. Ten krok umożliwia zrównoważenie kolumny z buforem równowagi. Na tym etapie powoli dodawaj bufor równoważący, aby nie naruszyć żywicy.
2. Przepuszczanie próbki białka przez kolumnę kationowymienną
- Umieść kolumnę w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml oznaczonej "Niezwiązany 1". Ostrożnie załaduj 0,1 ml próbki białka na wierzch kolumny.
- Po załadowaniu próbki na wierzch kolumny, przemyj ją 0,3 ml buforu równowagowego, dodając bufor w górnej części kolumny i pozwalając mu całkowicie przepłynąć. Powtórz ten krok 4 razy (w sumie 5 prań) i zbierz każde płukanie do osobnej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Oznacz probówki jako "Niezwiązane 1-5".
- Przez ostatnie 2 płukania wirować przez 10 s przy 1,000 x g, aby upewnić się, że wszystkie niezwiązane gatunki odpadły z kolumny. Żadna próbka, która wiąże się z kolumną, nie powinna znajdować się w tych popłuczynach, ale próbka, która nie jest związana, zostanie wypłukana w postaci niezachowanej. Wirowanie zapewnia większą siłę do zmycia niezwiązanych materiałów z kolumny.
- Umieść kolumnę w nowej probówce do zbierania wirówek o pojemności 2 ml oznaczonej "Bound 1". Umieścić 0,3 ml buforu elucyjnego (o wysokiej zawartości soli, pH 5,5) na wierzchu kolumny. Odwirowywać powstały eluent przez 10 s przy 1,000 x g.
- Powtórz etap elucji jeszcze 2 razy, umieszczając kolumnę w nowej probówce wirówkowej, dodając 0,3 ml i wirując przez 10 s. Oznacz je jako "Powiązane 2 i 3".
- Zapisz wszelkie zmiany koloru lub obserwacje dotyczące frakcji. Hemoglobina to kolorowe białko, które wygląda na czerwonawo-brązowe, podczas gdy cytochrom C ma czerwonawe zabarwienie.
3. Wyniki: Kationowa wymiana hemoglobiny i cytochromu C
- Cytochrom C ma pI 10,5, a hemoglobina pI 6,8. Tak więc, gdy używany jest bufor równowagi pH 8,1, hemoglobina nie wiąże się z kolumną, ponieważ jest naładowana ujemnie. Cytochrom C jest naładowany dodatnio przy tym pH i wiąże się z kolumną, ponieważ pH < pI.
- Hemoglobina jest obserwowana we frakcjach niezwiązanych, ponieważ nie jest związana z kolumną.
- Cytochrom C obserwuje się we frakcjach związanych, ponieważ był związany z kolumną kationowymienną.
Rysunek 1. Obraz frakcji niezwiązanej (hemoglobina) i frakcji związanej (cytochrom C).
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Chromatografia jonowymienna jest szeroko stosowana w rozdzielaniu i izolacji naładowanych związków, zwłaszcza dużych biomolekuł.
Ten rodzaj chromatografii cieczowej wykorzystuje kolumnę wypełnionych kulek fazy stacjonarnej, zwanych żywicą. Technika ta rozdziela anality na podstawie ich powinowactwa do naładowanej żywicy.
Istnieją dwa główne rodzaje tej techniki. W chromatografii kationowymiennej żywica naładowana ujemnie jest używana do wiązania dodatnio naładowanych analitów. Podobnie w wymianie anionowej ujemnie naładowane anality wiążą się z dodatnio naładowaną żywicą. Niezwiązane związki są przemywane przez kolumnę, a analit może być następnie zebrany w oddzielnym pojemniku.
W tym filmie przedstawimy podstawy chromatografii jonowymiennej i zademonstrujemy technikę rozdzielania mieszaniny białek w laboratorium.
Faza stacjonarna jest kluczowym elementem udanej separacji. Silne żywice kationitowowymienne zazwyczaj zawierają silnie kwasowe grupy funkcyjne, takie jak kwas sulfonowy. Słabe żywice kationitowe zawierają słabe grupy, takie jak kwasy karboksylowe.
Podobnie silne żywice anionowymienne wykorzystują silne zasady, takie jak aminy czwartorzędowe, podczas gdy słabe żywice anionowymienne wykorzystują aminy drugorzędowe lub trzeciorzędowe. Wybór żywicy będzie zależał od właściwości mieszaniny próbki i analitu będącego przedmiotem zainteresowania.
Zastosowane bufory, zwane zbiorczo fazą ruchomą, są również ważne dla separacji, szczególnie pod względem pH. W przypadku białek pH dobiera się na podstawie ich punktu izoelektrycznego lub pI. Przy pH równym pI białka białko jest obojętne. Powyżej pI będzie miał ładunek ujemny netto, podczas gdy poniżej pI będzie miał ładunek dodatni netto. pH buforu musi być tak dobrane, aby białko było odpowiednio naładowane i mogło wiązać się z fazą stacjonarną.
Chromatografia jonowymienna jest na ogół procesem czteroetapowym. Po pierwsze, wypełniona kolumna zawierająca żywicę anionowymienną lub kationową jest równoważona za pomocą buforu. W przypadku kolumn wymieniających aniony polega to na protonowaniu żywicy, zapewniając, że jest ona naładowana dodatnio.
Następnie próbka jest ładowana do kolumny. Bufor musi mieć niską przewodność, ponieważ naładowane gatunki mogą konkurować z próbką o interakcje z żywicą. Związki o przeciwnym ładunku wiążą się z żywicą. Cząsteczki, które nie są naładowane lub mają ten sam ładunek, pozostają niezwiązane.
W trzecim kroku kolumna jest myta dodatkowym buforem w celu usunięcia niezwiązanych komponentów z kolumny, pozostawiając powiązanie w tyle.
Wreszcie czwartym krokiem jest elucja związanego analitu. Osiąga się to albo za pomocą gradientu soli, w którym stężenie soli jest stopniowo zwiększane, albo za pomocą buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli.
Cząsteczki, które są słabo związane, zostaną najpierw wymyte, ponieważ niska sól najłatwiej zakłóci ich wiązanie jonowe z żywicą. Związki, które są silniej związane, będą eluować się przy wyższych stężeniach soli.
Teraz, gdy przedstawiono podstawy chromatografii jonowymiennej, przyjrzyjmy się jej zastosowaniu w rozdzielaniu dwóch białek.
Najpierw, aby przygotować mieszaninę białek do separacji, dodaj 0,2 ml buforu wiążącego i odwiruj, aby dokładnie wymieszać. Następnie odwiruj mieszaninę, aby usunąć pianę. Aby przygotować kolumnę kationitową, zaciśnij ją pionowo na stojaku pierścieniowym i pozwól żywicy osiąść.
Otwórz górną zaślepkę kolumny, a następnie dolną. Pozwól, aby bufor kapał pod wpływem grawitacji do rurki poniżej.
Aby przygotować kolumnę, zrównoważ ją, ładując objętość kolumny buforu, w tym przypadku 0,3 ml. Pozwolić, aby bufor wypłynął z kolumny do fiolki na odpady. Po opuszczeniu objętości kolumny buforu powtórz krok równoważenia.
Aby przeprowadzić eksperyment, umieść 2-mililitrową probówkę wirówkową oznaczoną "Niezwiązany 1" pod kolumną. Ostrożnie załaduj 0,1 ml próbki białka na wierzch kolumny.
Po załadowaniu próbki przemyć ją buforem o objętości kolumny i pozwolić mu przepłynąć przez całą drogę. Powtórz w sumie 5 prań. Zbierz każde pranie do osobnej tuby, oznaczonej "Niezwiązany od 1" do "5".? Przez ostatnie 2 płukania odwirować kolumnę przez 10 sekund, aby upewnić się, że wszystkie niezwiązane gatunki zostały zmyte z kolumny. Umieść kolumnę w nowej probówce do pobierania wirówek o pojemności 2 ml i oznacz ją jako "Bound 1".? Załaduj 1 objętość kolumny buforu elucyjnego na wierzch kolumny. Wirować przez 10 s przy 1,000 x g.
Powtórz etap elucji jeszcze 2 razy, aby zapewnić zebranie związanego analitu. Oznaczyć probówki jako "Bound 2" i "3".? Zapisz wszelkie zmiany koloru lub obserwacje dotyczące frakcji.
W tym przykładzie oddzielono hemoglobinę i cytochrom C. Hemoglobina ma pI 6,8, podczas gdy cytochrom C ma pI 10,5. W buforze o pH 8,1 hemoglobina jest naładowana ujemnie i nie wiąże się z kolumną. I odwrotnie, cytochrom C jest naładowany dodatnio przy pH 8,1 i wiąże się z kolumną.
Hemoglobina, brązowawe białko, została znaleziona we frakcjach niezwiązanych, podczas gdy cytochrom C, czerwonawe białko, zaobserwowano we frakcji związanej.
Istnieje wiele form chromatografii cieczowej, z których każda ma inną zdolność do oddzielania składników mieszaniny.
W tym przykładzie chromatografia kolumnowa została użyta do oddzielenia mieszaniny jedno- i dwuniciowego DNA. Hydroksyapatyt lub HA jest krystaliczną formą fosforanu wapnia powszechnie stosowaną jako faza stacjonarna ze względu na dodatnio naładowane jony wapnia. W tym przypadku kolumna HA była idealna do separacji DNA, ponieważ może wiązać się z ujemnie naładowanym szkieletem DNA.
Inną formą chromatografii kolumnowej często stosowaną do rozdzielania białek jest chromatografia z immobilizowanym powinowactwem do metalu lub IMAC. W IMAC faza stacjonarna posiada ligand z jonem metalu, który wiąże się ze znacznikiem histydyny na białku będącym przedmiotem zainteresowania.
Wszystkie pozostałe składniki mieszaniny opuszczają kolumnę. Białko jest następnie eluowane roztworem imidazolu, który ma podobną strukturę do histydyny i silniej wiąże się z jonem metalu.
Powszechnym zastosowaniem chromatografii kolumnowej jest wysokosprawna chromatografia cieczowa lub HPLC. HPLC jest szeroko stosowana w chemii analitycznej zarówno do identyfikacji, jak i rozdzielania związków biologicznych i niebiologicznych w mieszaninie.
HPLC jest podobna do chromatografii kolumnowej pokazanej w tym filmie, z tą różnicą, że jest zautomatyzowana i działa przy bardzo wysokich ciśnieniach. Umożliwia to stosowanie mniejszych kulek fazy stacjonarnej, o wyższym stosunku powierzchni do objętości. W ten sposób możliwe są lepsze interakcje między fazą stacjonarną a komponentami w fazie mobilnej.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do chromatografii jonowymiennej. Powinieneś teraz zrozumieć koncepcje, które za tym stoją, 4 związane z tym kroki i niektóre powiązane techniki.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between cation-exchange and anion-exchange chromatography?
Cation-exchange chromatography uses negatively-charged resin to bind positively-charged analytes, while anion-exchange chromatography uses positively-charged resin to bind negatively-charged analytes. The choice depends on the charge properties of your sample mixture and the analyte of interest. Selection of the appropriate resin type is critical for successful separation.
Q2: How does pH affect protein binding in ion-exchange chromatography?
Protein charge depends on pH relative to its isoelectric point (pI). At pH equal to the pI, the protein is neutral and won't bind. Above the pI, proteins are negatively charged; below it, they are positively charged. Buffer pH must be selected so the protein has the correct charge to bind to the resin effectively.
Q3: What are the four main steps in an ion-exchange chromatography procedure?
First, equilibrate the column with buffer to charge the resin. Second, load the sample in low-conductivity buffer so analytes bind based on charge. Third, wash with buffer to remove unbound components. Fourth, elute bound analytes using a salt gradient or high-salt buffer to recover the purified sample.
Q4: Why does salt concentration matter during elution in ion-exchange chromatography?
Salt ions compete with analytes for binding sites on the resin. Weakly bound molecules elute first at low salt concentrations, while strongly bound compounds require higher salt concentrations to disrupt ionic interactions and elute from the column. This allows selective recovery of analytes based on binding strength.
Q5: What types of resin are used in strong versus weak ion-exchange chromatography?
Strong cation-exchange resins feature sulfonic acid groups, while weak cation-exchange resins use carboxylic acids. Strong anion-exchange resins utilize quaternary amines, and weak anion-exchange resins use secondary or tertiary amines. Selection depends on sample properties and the desired separation outcome for your analyte.
Q6: How does ion-exchange chromatography compare to other separation techniques?
Ion-exchange chromatography separates based on charge and is more general than affinity chromatography, which requires specific antibodies for each analyte. Unlike high-performance liquid chromatography, which operates at high pressures with automated systems, ion-exchange uses gravity-driven flow and can be adapted for many proteins with different eluting conditions.
Q7: What is the role of buffer conductivity when loading samples onto an ion-exchange column?
Low-conductivity buffer is essential during sample loading because high salt concentrations cause charged species to compete with the sample for interactions with the resin. This competition reduces binding efficiency and separation quality, so the loading buffer must have minimal salt content to maximize analyte capture on the column.