Name: Test na indukcję neuronalną w zarodku piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj test na indukcję neuronalną w zarodku kurzym, wykorzystujący węzeł Hensena jako organizator tkanki nerwowej. Metoda obejmuje eksplantację, fluorescencyjne znakowanie i hybrydyzację in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.P jest laureatem nagrody Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 przyznanej przez National Institute on Drug Abuse. Praca ta była wspierana przez Margaret M. Alkek Foundation dla RHF.

I. Przegląd schematyczny:
<img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="Schemat eksperymentu hybrydyzacji in situ w układzie nerwowym; transplantacja węzła; układ dawca-biorca; indukcja osi ektopowej." width="460" height="384" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1">
W niniejszym materiale wideo przedstawiono poszczególne etapy badania indukcji neuronalnej w embrionie kurczaka. Najpierw embrion biorcy zostaje wyeksplantowany do nowego medium hodowlanego [NI1]. Następnie embrion dawcy zostaje wyeksplantowany do soli fizjologicznej, a węzeł Hensen’a (pełniący rolę „organizatora” u kurczaka) zostaje oznakowany fluorescencyjnym barwnikiem DiI [NI2]. Węzeł Hensen’a zostaje wycięty z embrionu dawcy [NI3] i przeszczepiony do embrionu biorcy [NI4, NI5]. Embrion biorcy jest następnie hodowany przez maksymalnie 22 hrs, po czym tkanka dawcy indukuje powstanie osi ektopowej w obszarze area opaca embrionu biorcy [NI6]. Po inkubacji embrion biorcy zostaje utrwalony i poddany fotoutlenianiu w obecności DAB: w wyniku tej reakcji chemicznej komórki pochodzące od dawcy, które przed fotoutlenianiem wykazują czerwoną fluorescencję w kanale FITC [NI7], stają się brązowe po reakcji z DAB [NI8]. Następnie embrion zostaje poddany hybrydyzacji in situ z markerem neuronalnym [NI8]; w obecności przeszczepu od dawcy w tkankach biorcy utworzyła się tkanka neuronalna. Tkanka ta przybiera kolor niebieski.
1: Przygotowanie zarodka biorcy do nowej hodowli
<ol>
<li>Niniejszy protokół testu indukcji neuronalnej rozpoczyna się od jaj inkubowanych do stadium Hamburgera i Hamiltona 3+ (lub HH3+). Jaja te były inkubowane w pozycji bocznej w inkubatorze wilgotnościowym przez 13 godzin.</li>
<li>Przygotować embrion gospodarza do hodowli New (kroki 3.1. do 5.59).</li>
<li>Pokryć powierzchnię embrionu gospodarza 200 μl soli fizjologicznej. Ułatwi to późniejszy transfer i pozycjonowanie przeszczepu od dawcy.</li>
<li>Na koniec przykryć cały układ odwróconą szalką hodowlaną Falcon 35 mm.</li>
</ol>
2: Eksplantacja zarodka dawcy w soli fizjologicznej
<ol>
<li>Otwórz jajko, opukując skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty z całego obwodu. Usuń górną część skorupki i ją odrzuć.</li>
<li>Usuń gęste białko pęsetą, a następnie przechyl worek żółtkowy grubą pęsetą tak, aby embrion był skierowany ku górze.</li>
<li>Za pomocą precyzyjnych nożyczek wytnij kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Wyjmij embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu z PBS.</li>
<li>Za pomocą pęsety oddziel embrion dawcy od area pellucida.</li>
<li>Przenieś embrion dawcy do naczynia pokrytego Sylgardem, zawierającego PBS.</li>
</ol>
3: Etykietowanie, wycinanie i przeszczepianie graftu dawcy
<ol>
<li>Za pomocą wyciągacza mikroelektrod przygotować szklane mikropipety kapilarne 50 μl. Pod mikroskopem odciąć końcówkę mikropipety za pomocą precyzyjnej pęsety. Umieścić mikropipetę w szalce Petriego wyłożonej paskiem plasteliny.</li>
<li>Przygotować roztwór barwnika, który zostanie użyty do znakowania przeszczepu przed transplantacją: barwnik karbocyjaninowy DiI (perchloran 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine): Najpierw przygotować roztwór stokowy DiI w 1ml absolutnego etanolu w stężeniu 0.5%. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20C w ciemności. W łaźni wodnej ustawionej na 42°C zmieszać uprzednio ogrzane 40 μl roztworu stokowego DiI z 360μl 0.3M sacharozy. Temperatura łaźni wodnej jest niezbędna, aby zapobiec wytrącaniu się DiI i tworzeniu nierozpuszczalnych kryształów. Krótko odwirować roztwór w miniwirówce (przez 5-10 sekund). Roztwór DiI jest teraz gotowy do użycia.</li>
<li>Za pomocą szpilek entomologicznych unieruchomić embrion dawcy na dnie naczynia pokrytego Sylgardem.</li>
<li>Wypełnić mikropipetę roztworem DiI od tyłu. Wywierając delikatny nacisk za pomocą zestawu rurki aspiracyjnej, nanieść niewielką dawkę DiI na węzeł Hensena. Należy upewnić się, że cały węzeł Hensena został oznakowany.</li>
<li>Za pomocą mikropipety kapilarnej lub mikro skalpela wyciąć węzeł Hensena („organizer”, przeszczep dawcy).</li>
<li>Oznaczyć stronę brzuszna oraz koniec tylny przeszczepu karminem. Zapewni to właściwą orientację grzbietowo-brzuszną przeszczepu w kroku 4.3.</li>
<li>Za pomocą pipety Gilsona 200μl przenieść przeszczep do embrionu biorcy.</li>
</ol>
4: Mocowanie przeszczepu i hodowla embrionu gospodarza
<ol>
<li>Usunąć sól fizjologiczną z zarodka biorcy, upewniając się, że przeszczep pozostaje w bliskim sąsiedztwie miejsca biorcy.</li>
<li>Za pomocą pipety mikrokapilarnej lub noża do mikrodisekcji wykonać małe nacięcie (80-100μm) w obrębie granicy area pellucida/area opaca, na poziomie węzła Hensen’a zarodka biorcy.</li>
<li>Za pomocą pipety mikrokapilarnej lub noża do mikrodisekcji ustawić przeszczep tak, aby strona brzuszna była skierowana w stronę operatora, a koniec tylny znajdował się równolegle do odpowiadającego mu regionu w zarodku biorcy.</li>
<li>Usunąć pozostałą sól fizjologiczną i poddać zarodek biorcy hodowli New przez 81-22 hr (kroki 6.1 do 6.69).</li>
<li>Następnie zarodek biorcy należy utrwalić przez noc w temperaturze 4°C (kroki 7.1 do 7.79).</li>
</ol>
5: Fotoutlenianie przeszczepu pod wpływem fluorescencji
<ol>
<li>W dygestorium przygotować roboczy roztwór DAB w buforze Tris: rozpuścić substrat DAB (3,3’-diaminobenzydynę tetrahydrochlorek) w buforze Tris (100mM Tris-HCl, pH 7.4) do stężenia 500μg/ml; roztwór przechowywać w ciemności, w lodzie.</li>
<li>Przepłukać embrion dwukrotnie w PBS przez 5 mn każdorazowo oraz raz w buforze Tris przez 5 mn.</li>
<li>Przenieść embrion na szkiełko z wgłębieniem zawierające 1 ml buforu Tris.</li>
<li>Zastąpić bufor Tris 1.5 ml roztworu DAB. Zużytą końcówkę do pipety Eppendorf wyrzucić do pojemnika z 10% roztworem wybielacza w celu dekontaminacji DAB. Nałożyć szkiełko nakrywkowe na szkiełko z wgłębieniem.</li>
<li>W fluorescencji FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) ustawić ostrość obiektywu mikroskopu na przeszczep (komórki donora będą widoczne jako czerwone fluorescencyjne) i naświetlać fluorescencją FITC do momentu, aż wszystkie czerwone fluorescencyjne komórki staną się brązowe (następuje to w wyniku fotokonwersji fluorochromu DiI w nierozpuszczalne brązowe kryształy pod wpływem długości fali wzbudzenia FITC (488nm) w obecności DAB). Proces ten trwa od 20 mn do 2 godzin.</li>
<li>Po zakończeniu reakcji fotoutleniania usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety precyzyjnej. Przenieść embrion do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej PBTw (lub PBS z 0.1% Tween-20).</li>
<li>Zneutralizować DAB ze szkiełka nakrywkowego i szkiełka z wgłębieniem poprzez inkubację w 10% roztworze wybielacza.</li>
</ol>
6: Przygotowanie zarodka do hybrydyzacji in situ, fotografowania i sekcjonowania
<ol>
<li>Przeprowadzić hybrydyzację in situ (kroki 3.7 do 6.59), inkubując zarodek wyłącznie z sondą znakowaną DIG.</li>
<li>Przejść do fotografowania (krok 8.2 9) oraz sekcjonowania (kroki 8.3 i 8.49).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
W poniższym przykładzie testu indukcji neuronalnej pokazano, że przeszczep dawcy indukuje ekspresję markera neuronalnego Tailless w tkance pochodzącej od biorcy. W tym konkretnym przykładzie oceniano nabycie zdolności indukcji neuronalnej przez regiony embrionalne, które normalnie nie posiadają właściwości „organizatora”: przeszczep dawcy pochodzi z embrionu, w którym region „organizatora” został chirurgicznie usunięty w stadium 3+. Po ablacji embrion dawcy rozwija się w kulturze New, aż do momentu zagojenia się ubytku i uformowania struktury przypominającej węzeł Hensen’a. Struktura ta zostaje następnie oznakowana barwnikiem DiI, wycięta z embrionu dawcy i przeszczepiona na granicę area pellucida/area opaca embrionu biorcy. Po inkubacji w kulturze New, obok embrionu biorcy tworzy się miniaturowa oś: oś ta składa się z pręta czerwonych komórek (pochodzących od dawcy) i struktury przypominającej głowę (pochodzącej od biorcy). Na obrazie (A) pokazano komórki pochodzące od dawcy, oznakowane DiI, przed utrwaleniem, obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym FITC. Komórki te proliferowały, tworząc miniaturową strunę grzbietową, która widoczna jest jako pręt czerwonych komórek. (B) Po fotokonwersji DiI komórki pochodzące od dawcy przybierają brązowy kolor. Przeszczep dawcy zindukował powstanie tkanki neuronalnej z organizmu biorcy: tkanka ta składa się z prekursorów mózgu, co zostało wykazane poprzez ekspresję markera Tailless w badaniu hybrydyzacji in situ [reprodukcja z 6].
<img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure%202.png" alt="Wykres porównawczy histologii fluorescencji tkanki pod mikroskopem; intensywne czerwone barwienie na obrazie A." width="230" height="154" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="rycina 2">
Uwaga: W niniejszej procedurze zastosowano komórki znakowane DiI, aby odróżnić tkankę dawcy indukującą neurulację (czerwona/brązowa) od „neuralnej” tkanki pochodzącej od biorcy (niebieska). Zamiast stosowania przeszczepu dawcy pochodzącego od kurczaka i znakowanego DiI, niektórzy autorzy wykorzystują tkankę dawcy pochodzącą z embrionów przepiórki zamiast kurczaka [np. 6]. Ta alternatywna metoda również pozwala na odróżnienie tkanki dawcy od tkanki biorcy. W tym przypadku przeszczep (tkanka dawcy) pochodzi z jaj przepiórki zamiast z jaj kurzych. Po kroku 4.5 tkanka biorcy jest poddawana immunohistochemii całego preparatu z użyciem przeciwciała specyficznego dla tkanki przepiórki (QCP1), a kroki od 3.1 do 3.4 oraz od 5.1 do 5.7 są pomijane w protokole. Przykład tej alternatywnej procedury przedstawiono poniżej: W tym przypadku zastosowano tę samą procedurę eksperymentalną co w A,B, ale użyto tkanki dawcy pochodzącej od przepiórki (co wykazano poprzez ekspresję przeciwciała QCPN [brązowa]): Zregenerowany węzeł pochodzący z embrionu przepiórki zindukował ekspresję pan-neuralnego markera Sox2 u biorcy [przedrukowano z 6]:
<img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure%203.png" alt="Mikroskopia chromoplastów roślinnych z zaznaczoną lokalizacją pigmentów." width="154" height="230" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 3">

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

Niniejszy film prezentuje poszczególne etapy przeprowadzania testu indukcji neuronalnej. Test ten jest zasadniczo wykorzystywany do charakteryzacji potencjalnych cząsteczek indukujących neurony u kurczaka i w związku z tym może być stosowany w szerokim zakresie aplikacji, od embriologicznych mikromanipulacji 1-4; 6 po wyjaśnianie nowych kaskad sygnałowych 7,8, a wszystko to w celu zrozumienia początkowego etapu formowania się mózgu i pozostałej części układu nerwowego.

<table><tbody><tr><td>Jaja</td><td>Zwierzę</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td>Zapłodnione, stadium HH3+ (14 h)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 lub podobne</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hybrydyzacji</td><td>Sprzęt</td><td>Robbins Scientific, SciGene</td><td>M1000</td><td>Stosować z odwróconą szalką Pyrex i 500 ml ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Zlewka</td></tr><tr><td>Automatyczny inkubator Marsh</td><td>Sprzęt</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>naczynie Pyrex </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zegarmistrz&amp;rsquo;szkło 50 mm</td><td>Narzędzie</td><td>VWR International</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie szklane</td><td>Narzędzie</td><td>Zaplecze techniczne budynku</td><td></td><td>odciąć fragmenty rurki szklanej o grubości 4 mm (średnica zewnętrzna 27 mm, średnica wewnętrzna 25 mm). Nie polerować wykończeniowo.</td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona (1)</td><td>Narzędzie</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta (2)</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>zaobtuszowane za pomocą kamienia ostrzącego i 100 $\mu$l oleju mineralnego</td></tr><tr><td>Nożyczki precyzyjne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia plastikowe</td><td>Narzędzie</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Gruszka gumowa</td><td>Narzędzie</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rurki aspiracyjnej</td><td>Narzędzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikro&amp;#8211;wyciągacz elektrod</td><td>Sprzęt</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Mikropipeta do wypalania/brązowienia P-97 firmy Sutter Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarna pipeta Pasteura</td><td>Narzędzie</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>70950-12</td><td>zaokrąglenie krawędzi nad płomieniem</td></tr><tr><td>Komora hodowlana</td><td>Narzędzie</td><td>Pioneer Plastics</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara mikrokapilarna</td><td>Narzędzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do mikrosekcji</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Służy do nakłuwania jam przed hybrydyzacją in situ</td></tr><tr><td>piny minutowe o średnicy 0,2 mm</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Wymieszać utwardzacz w proporcji 1:9 z bazą; pozostawić przez noc w temperaturze 37°C</td></tr><tr><td>Węglan dwuetylowopirokarbonianu (depc)</td><td>Odczynnik</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Utwardzacz i baza elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td></td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>Wymieszać 1 część utwardzacza z 9 częściami bazy; pozostawić na noc w temperaturze 37°C</td></tr><tr><td>Węglan dwuetylowopirokarbonianu (depc)</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>Dodać 1 ml DEPC do 1 l PBS; wstrząsnąć; autoklawować</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td></td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Embrio kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach wczesnego rozwoju embrionalnego. Jego przezroczystość, łatwość dostępu i manipulacji czynią go idealnym narzędziem do badania formowania i wstępnego wzorowania układu nerwowego. W niniejszym filmie pokazano, jak przeszczepić tkankę organizatora do gospodarza, metodę, w której węzeł Hensena (organizator w embrionie kurczaka) jest przeszczepiany do kompetentnej egzodermu gospodarza. Przeszczep organizatora nakazuje pokrywającej go tkance naiwnej przyjęcie losu nerwowego za pośrednictwem sygnałów indukujących rozwój układu nerwowego. Mechanizm ten nazywany jest indukcją nerwową i stanowi pierwszy krok w formowaniu mózgu i rdzenia kręgowego u amniontów. Metodę tę stosuje się przede wszystkim do charakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek indukujących rozwój układu nerwowego u kurczaka. Wideo to demonstruje poszczególne etapy testu indukcji nerwowej; najpierw embrion dawcy jest eksplantowany i przypinany do szalki. Następnie przygotowuje się embrion gospodarza do hodowli New. Przeszczep jest wycinany i przeszczepiany do brzegu obszaru pellucida gospodarza. Gospodarz jest hodowany przez 18–22 godziny. Zestaw jest utrwalany i przygotowywany do dalszych zastosowań (np. hybrydyzacji in situ). Metodę tę pierwotnie opracowali Waddington1,2i Gallera3,4.

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Zarodek kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach nad wczesnym rozwojem embrionalnym. Jego przejrzystość, dostępność i łatwość manipulacji sprawiają, że jest on ...

Niniejszy film przedstawia poszczególne etapy testu indukcji neuronalnej w embrionie kurczaka. Najpierw embrion biorcy zostaje wypreparowany do nowej hodowli, a embrion dawcy zostaje wypreparowany do roztworu soli fizjologicznej, po czym węzeł Hensena zostaje oznakowany barwnikiem fluorescencyjnym. Następnie węzeł Hensena zostaje wycięty z embrionu dawcy i przeszczepiony do embrionu biorcy.Zarodek gospodarza jest hodowany przez 24 godziny, utrwalany i przygotowywany do fotoutleniania w fluorescencji przy użyciu dab. Następnie zarodek jest poddawany hybrydyzacji in situ z zastosowaniem markera neuronalnego.Witam, jestem Delphine z Laboratorium Fennella w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomicznej na Uniwersytecie Texas A&M w Houston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeprowadzania testów indukcji neuralnej w embrionie kurczaka. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wpływu leków przeciwpadaczkowych na właściwości indukujące układ nerwowy węzła Hensego.Zacznijmy zatem. Do testu indukcji neuronalnej należy przygotować jaja. Powinny one być inkubowane w pozycji bocznej w inkubatorze wilgotnościowym przez 13 godzin, aż do osiągnięcia stadium Hamburgera i Hamiltona 3+ lub HH 3+.Następnie przygotuj embrion gospodarza, stosując nową metodę hodowli, która została zaprezentowana wcześniej. W JoVE pokryj powierzchnię embrionu gospodarza 200 µL soli fizjologicznej. Ułatwi to późniejszy transfer i pozycjonowanie przeszczepu dawcy.Na koniec przykryj zestaw odwróconą szalką hodowlaną Falcon 35 mm. Aby wydobyć embrion donora, otwórz jajo, delikatnie stukając pęsetą w skorupkę. Usuń górną część skorupki i wyrzuć ją.Za pomocą pęsety usuń gęste albuminy, a następnie za pomocą pęsety grubiej końcówkowej przechyl worek żółtkowy tak, aby zarodek był skierowany ku górze. Po usunięciu albuminy, użyj precyzyjnych nożyczek, aby wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół zarodka. Wyjmij zarodek z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu zawierającym PBS.Następnie za pomocą pęsety oddziel embrion dawcy od żółtka i area lucida. Po oddzieleniu przenieś embrion dawcy do naczynia z pokrywką typu SIL guard zawierającego PBS w celu oznakowania i przeszczepienia graftu. Użyj wyciągarki do mikroelektrod, aby pod mikroskopem przygotować szklane mikrokapilary o pojemności 50 µL.Odetnij końcówkę mikropipety za pomocą precyzyjnej pęsety. Umieść mikropipetę w szalce Petriego wyłożonej wałeczkiem plasteliny. Następnie przygotuj roztwór barwnika, który zostanie wykorzystany do znakowania przeszczepu przed transplantacją.Najpierw należy przygotować roztwór zapasowy barwnika Dye Eye w 1 mL absolutnego etanolu o stężeniu 0,5%. Roztwór zapasowy ten można przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności. Następnie w bloku grzejnym ustawionym na 45 °C zmieszaj uprzednio ogrzane 10 µL roztworu zapasowego Dye Eye z 90 µL 0,3 M sacharozy. Taka temperatura jest niezbędna, aby zapobiec wytrącaniu się Dye Eye i tworzeniu nierozpuszczalnych kryształów.Krótko odwiruj roztwór w miniwirówce SPECT przez 5 do 10 sekund. Roztwór DAI jest teraz gotowy do użycia; za pomocą szpilek entomologicznych przymocuj embrion donora do dna naczynia z osłoną progu, stroną grzbietową do góry. Po przymocowaniu embrionu wypełnij mikropipetę roztworem D eye, przykładając delikatny nacisk.Przy użyciu zestawu rurki aspiracyjnej podać mały bolus barwnika do węzła Hensona. Powtórzyć czynność, upewniając się, że cały węzeł Hensona został oznakowany.Używając pipety mikrokapilarnej lub mikroskalpela, należy wyciąć węzeł Hensona; stronę grzbietową węzła można odróżnić od strony brzusznej po tym, że tworzy ona bruzdę, podczas gdy strona brzuszna węzła jest płaska. W razie potrzeby należy zaznaczyć stronę grzbietową przeszczepu proszkiem karminowym. Zapewni to odpowiednią orientację grzbietowo-brzuszną podczas pozycjonowania przeszczepu.Za pomocą pipety Gilson o pojemności 10 µL przenieś przeszczep do zarodka biorcy, używając mikropipety kapilarnej. Przystaw przeszczep blisko area opaca, nieprzezroczystego obszaru granicznego na wysokości węzła Hensona zarodka biorcy. Następnie, używając mikropipety kapilarnej lub mikro skalpela, wykonaj w tym obszarze niewielkie nacięcie o długości od 80 do 100 µm.Wyznacz nieprzezroczystą granicę obszaru Lucita na poziomie węzła Hensona zarodka gospodarza. Używając mikrokapilary lub mikro skalpela do sekcji, ustaw przeszczep tak, aby strona brzuszna była skierowana w Twoją stronę, a koniec tylny znajdował się równolegle do odpowiadającego mu regionu w zarodku gospodarza O. Po ustawieniu usuń sól fizjologiczną z zarodka gospodarza, upewniając się, że przeszczep pozostaje w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca w zarodku gospodarza, a następnie poddaj zarodek gospodarza nowej hodowli przez 18 do 22 godzin, zgodnie z opisem w naszej poprzedniej publikacji.Po 24 godzinach inkubacji zarodek zostaje wyjęty z inkubatora i unieruchomiony szpilkami w szalce typu cigar dish. Roztwór PBS zostaje usunięty i zastąpiony 4% paraformaldehydem. Następnie zarodek jest utrwalany przez 24 godziny.Utworzony fiksaty należy zutylizować w odpowiednim pojemniku na odpady niebezpieczne, a następnie dodać PBS do naczynia z fiksatywem. Po wyjęciu szpilek entomologicznych należy je usunąć za pomocą pęsety. Używając pipety Pasteura z tępym końcem, przenieść zarodek do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBS.Przemyj embrion dwukrotnie w PBS po pięć minut każdy oraz raz w buforze Tris przez pięć minut. Po przemyciu przenieś embrion na szkiełko z wgłębieniem zawierające 0,1 ml buforu Tris. Zastąp roztwór buforu Tris 0,1 ml roztworu DAB. Zużytą końcówkę wyrzuć do pojemnika z roztworem wybielacza.Aby odbarwić DAB, należy umieścić szkiełko nakrywkę na szkiełku z wgłębieniem pod wpływem fluorescencji izotiocyjanianu fluoresceiny FEI. Obiektyw mikroskopu skierowany na komórki dawcy przeszczepu wykaże czerwoną fluorescencję i będzie eksponowany na fluorescencję FEI, aż wszystkie komórki wykazujące czerwoną fluorescencję staną się brązowe. Dzieje się tak w wyniku fotokonwersji fluorochromu do nierozpuszczalnych brązowych kryształów pod wpływem długości fali wzbudzenia FEI.4 88 nanometrów w obecności dab. Proces ten trwa od 20 minut do dwóch godzin. Po zakończeniu reakcji fotoutleniania należy usunąć szkiełko nakrywkę za pomocą precyzyjnej pęsety.Przenieść zarodek do fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej PBTW lub PBS z 0,1% tween 20. Na koniec zdezaktywować DAB z szkiełka podstawnego, nakrywek i wgłębienia szkiełka. Przesunąć, inkubując w roztworze wybielacza, aby przygotować zarodek do wizualizacji.Przeprowadzić hybrydyzację in situ, inkubując zarodek wyłącznie z sondą znakowaną DIG. Następnie rozpocząć fotografowanie i sekcjonowanie zgodnie z opisem w filmie JoVideo dwa. Poniżej znajduje się przykład testu indukcji neuronalnej.Początkowo przeszczep jest umieszczany na granicy między obszarem lucita a obszarem alpaca embrionu gospodarza. Zarówno embriony dawcy, jak i gospodarza znajdują się w stadium trzy plus. Po dziewięciu godzinach inkubacji przeszczep zaczyna się różnicować i indukować strukturę przypominającą miniaturową głowę w stadium osiem minus.Po 24 godzinach hodowli indukcja neuronalna zostaje zakończona po utrwaleniu. Embrion jest przygotowywany do fotoutleniania. Początkowo wykazano, że komórki pochodzące od dawcy, znakowane barwnikiem, proliferowały, tworząc miniaturowe Noor, co widać tutaj na czerwono.Po fotoutlenianiu komórki te przybierają brązowy kolor. Następnie zarodek poddawany jest hybrydyzacji in situ w preparacie całkowitym w celu wykrycia markera neuronalnego. O otx two opracowano w laboratorium dr. Bonelliego.Wykazano, że przeszczep od dawcy indukuje ekspresję OTX2 w tkankach pochodzących od biorcy. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia testu indukcji neuronalnej w zarodku kurczaka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby po transplantacji usunąć za pomocą pipety cały płyn z obszaru otaczającego przeszczep.Zapewni to stabilne umiejscowienie przeszczepu i zapobiegnie jego przesunięciu względem zarodka gospodarza podczas hodowli. To wszystko. Dziękuję za uwagę i powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

assay-for-neural-induction-in-the-chick-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena indukcji neuronalnej w zarodku kurczaka

Różnorodne czynniki wzrostu i białka oddziałują na siebie, indukując komórki do przyjmowania różnych przeznaczeń komórkowych podczas rozwoju. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie preparacji in ovo w celu zbadania możliwych oddziaływań między różnymi białkami w rozwoju, poprzez umieszczanie kulek w embrionach kurzych w stadium E2.5.

Umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Ten film demonstruje metodę izolowania neuronów z przodomózgowia zarodka pisklęcia we wczesnym stadium i hodowli ich na matrycy mikroelektrod w celu utworzenia sieci neuronalnej.

Izolowanie i hodowla neuronów embrionalnych piskląt na matrycy wieloelektrodowej

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Tutaj informujemy o podwójnym znakowaniu komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych za pomocą wewnątrzgatunkowego szczepienia rurki nerwowejGFP w połączeniu z wewnątrznaczyniowym wstrzyknięciem DiI. Ta eksperymentalna technika pozwala nam jednocześnie wizualizować i badać rozwój układu nerwowego (jelitowego) wywodzącego się z NCC i układu naczyniowego podczas organogenezy.

Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Poznaj test na indukcję neuronalną w zarodku kurzym, wykorzystujący węzeł Hensena jako organizator tkanki nerwowej. Metoda obejmuje eksplantację, fluorescencyjne znakowanie i hybrydyzację in situ.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Przeglądaj więcej filmów