Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Niniejszy film przedstawia poszczególne etapy testu indukcji neuronalnej w embrionie kurczaka. Najpierw embrion biorcy zostaje wypreparowany do nowej hodowli, a embrion dawcy zostaje wypreparowany do roztworu soli fizjologicznej, po czym węzeł Hensena zostaje oznakowany barwnikiem fluorescencyjnym. Następnie węzeł Hensena zostaje wycięty z embrionu dawcy i przeszczepiony do embrionu biorcy.

Zarodek gospodarza jest hodowany przez 24 godziny, utrwalany i przygotowywany do fotoutleniania w fluorescencji przy użyciu dab. Następnie zarodek jest poddawany hybrydyzacji in situ z zastosowaniem markera neuronalnego.

Witam, jestem Delphine z Laboratorium Fennella w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomicznej na Uniwersytecie Texas A&M w Houston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeprowadzania testów indukcji neuralnej w embrionie kurczaka. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wpływu leków przeciwpadaczkowych na właściwości indukujące układ nerwowy węzła Hensego.

Zacznijmy zatem. Do testu indukcji neuronalnej należy przygotować jaja. Powinny one być inkubowane w pozycji bocznej w inkubatorze wilgotnościowym przez 13 godzin, aż do osiągnięcia stadium Hamburgera i Hamiltona 3+ lub HH 3+.

Następnie przygotuj embrion gospodarza, stosując nową metodę hodowli, która została zaprezentowana wcześniej. W JoVE pokryj powierzchnię embrionu gospodarza 200 µL soli fizjologicznej. Ułatwi to późniejszy transfer i pozycjonowanie przeszczepu dawcy.

Na koniec przykryj zestaw odwróconą szalką hodowlaną Falcon 35 mm. Aby wydobyć embrion donora, otwórz jajo, delikatnie stukając pęsetą w skorupkę. Usuń górną część skorupki i wyrzuć ją.

Za pomocą pęsety usuń gęste albuminy, a następnie za pomocą pęsety grubiej końcówkowej przechyl worek żółtkowy tak, aby zarodek był skierowany ku górze. Po usunięciu albuminy, użyj precyzyjnych nożyczek, aby wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół zarodka. Wyjmij zarodek z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu zawierającym PBS.

Następnie za pomocą pęsety oddziel embrion dawcy od żółtka i area lucida. Po oddzieleniu przenieś embrion dawcy do naczynia z pokrywką typu SIL guard zawierającego PBS w celu oznakowania i przeszczepienia graftu. Użyj wyciągarki do mikroelektrod, aby pod mikroskopem przygotować szklane mikrokapilary o pojemności 50 µL.

Odetnij końcówkę mikropipety za pomocą precyzyjnej pęsety. Umieść mikropipetę w szalce Petriego wyłożonej wałeczkiem plasteliny. Następnie przygotuj roztwór barwnika, który zostanie wykorzystany do znakowania przeszczepu przed transplantacją.

Najpierw należy przygotować roztwór zapasowy barwnika Dye Eye w 1 mL absolutnego etanolu o stężeniu 0,5%. Roztwór zapasowy ten można przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności. Następnie w bloku grzejnym ustawionym na 45 °C zmieszaj uprzednio ogrzane 10 µL roztworu zapasowego Dye Eye z 90 µL 0,3 M sacharozy. Taka temperatura jest niezbędna, aby zapobiec wytrącaniu się Dye Eye i tworzeniu nierozpuszczalnych kryształów.

Krótko odwiruj roztwór w miniwirówce SPECT przez 5 do 10 sekund. Roztwór DAI jest teraz gotowy do użycia; za pomocą szpilek entomologicznych przymocuj embrion donora do dna naczynia z osłoną progu, stroną grzbietową do góry. Po przymocowaniu embrionu wypełnij mikropipetę roztworem D eye, przykładając delikatny nacisk.

Przy użyciu zestawu rurki aspiracyjnej podać mały bolus barwnika do węzła Hensona. Powtórzyć czynność, upewniając się, że cały węzeł Hensona został oznakowany.

Używając pipety mikrokapilarnej lub mikroskalpela, należy wyciąć węzeł Hensona; stronę grzbietową węzła można odróżnić od strony brzusznej po tym, że tworzy ona bruzdę, podczas gdy strona brzuszna węzła jest płaska. W razie potrzeby należy zaznaczyć stronę grzbietową przeszczepu proszkiem karminowym. Zapewni to odpowiednią orientację grzbietowo-brzuszną podczas pozycjonowania przeszczepu.

Za pomocą pipety Gilson o pojemności 10 µL przenieś przeszczep do zarodka biorcy, używając mikropipety kapilarnej. Przystaw przeszczep blisko area opaca, nieprzezroczystego obszaru granicznego na wysokości węzła Hensona zarodka biorcy. Następnie, używając mikropipety kapilarnej lub mikro skalpela, wykonaj w tym obszarze niewielkie nacięcie o długości od 80 do 100 µm.

Wyznacz nieprzezroczystą granicę obszaru Lucita na poziomie węzła Hensona zarodka gospodarza. Używając mikrokapilary lub mikro skalpela do sekcji, ustaw przeszczep tak, aby strona brzuszna była skierowana w Twoją stronę, a koniec tylny znajdował się równolegle do odpowiadającego mu regionu w zarodku gospodarza O. Po ustawieniu usuń sól fizjologiczną z zarodka gospodarza, upewniając się, że przeszczep pozostaje w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca w zarodku gospodarza, a następnie poddaj zarodek gospodarza nowej hodowli przez 18 do 22 godzin, zgodnie z opisem w naszej poprzedniej publikacji.

Po 24 godzinach inkubacji zarodek zostaje wyjęty z inkubatora i unieruchomiony szpilkami w szalce typu cigar dish. Roztwór PBS zostaje usunięty i zastąpiony 4% paraformaldehydem. Następnie zarodek jest utrwalany przez 24 godziny.

Utworzony fiksaty należy zutylizować w odpowiednim pojemniku na odpady niebezpieczne, a następnie dodać PBS do naczynia z fiksatywem. Po wyjęciu szpilek entomologicznych należy je usunąć za pomocą pęsety. Używając pipety Pasteura z tępym końcem, przenieść zarodek do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBS.

Przemyj embrion dwukrotnie w PBS po pięć minut każdy oraz raz w buforze Tris przez pięć minut. Po przemyciu przenieś embrion na szkiełko z wgłębieniem zawierające 0,1 ml buforu Tris. Zastąp roztwór buforu Tris 0,1 ml roztworu DAB. Zużytą końcówkę wyrzuć do pojemnika z roztworem wybielacza.

Aby odbarwić DAB, należy umieścić szkiełko nakrywkę na szkiełku z wgłębieniem pod wpływem fluorescencji izotiocyjanianu fluoresceiny FEI. Obiektyw mikroskopu skierowany na komórki dawcy przeszczepu wykaże czerwoną fluorescencję i będzie eksponowany na fluorescencję FEI, aż wszystkie komórki wykazujące czerwoną fluorescencję staną się brązowe. Dzieje się tak w wyniku fotokonwersji fluorochromu do nierozpuszczalnych brązowych kryształów pod wpływem długości fali wzbudzenia FEI.

4 88 nanometrów w obecności dab. Proces ten trwa od 20 minut do dwóch godzin. Po zakończeniu reakcji fotoutleniania należy usunąć szkiełko nakrywkę za pomocą precyzyjnej pęsety.

Przenieść zarodek do fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej PBTW lub PBS z 0,1% tween 20. Na koniec zdezaktywować DAB z szkiełka podstawnego, nakrywek i wgłębienia szkiełka. Przesunąć, inkubując w roztworze wybielacza, aby przygotować zarodek do wizualizacji.

Przeprowadzić hybrydyzację in situ, inkubując zarodek wyłącznie z sondą znakowaną DIG. Następnie rozpocząć fotografowanie i sekcjonowanie zgodnie z opisem w filmie JoVideo dwa. Poniżej znajduje się przykład testu indukcji neuronalnej.

Początkowo przeszczep jest umieszczany na granicy między obszarem lucita a obszarem alpaca embrionu gospodarza. Zarówno embriony dawcy, jak i gospodarza znajdują się w stadium trzy plus. Po dziewięciu godzinach inkubacji przeszczep zaczyna się różnicować i indukować strukturę przypominającą miniaturową głowę w stadium osiem minus.

Po 24 godzinach hodowli indukcja neuronalna zostaje zakończona po utrwaleniu. Embrion jest przygotowywany do fotoutleniania. Początkowo wykazano, że komórki pochodzące od dawcy, znakowane barwnikiem, proliferowały, tworząc miniaturowe Noor, co widać tutaj na czerwono.

Po fotoutlenianiu komórki te przybierają brązowy kolor. Następnie zarodek poddawany jest hybrydyzacji in situ w preparacie całkowitym w celu wykrycia markera neuronalnego. O otx two opracowano w laboratorium dr. Bonelliego.

Wykazano, że przeszczep od dawcy indukuje ekspresję OTX2 w tkankach pochodzących od biorcy. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia testu indukcji neuronalnej w zarodku kurczaka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby po transplantacji usunąć za pomocą pipety cały płyn z obszaru otaczającego przeszczep.

Zapewni to stabilne umiejscowienie przeszczepu i zapobiegnie jego przesunięciu względem zarodka gospodarza podczas hodowli. To wszystko. Dziękuję za uwagę i powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.