What are the four stages of the rodent estrous cycle?

The rodent estrous cycle lasts 4-5 days and consists of four stages: metestrus, diestrus, proestrus, and estrus. Estrus is the ovulatory phase when females are ready to conceive. Proestrus immediately precedes estrus and also indicates fertility. These stages can be identified through visual examination of the vaginal opening or more accurately through vaginal cytology analysis.

How is vaginal cytology used to determine estrous cycle stage?

Vaginal cytology involves collecting cell samples via lavage or swabbing. Lavage uses a sterile pipette tip with water to gently flush the vaginal canal 4-5 times. Swabbing uses a moistened cotton applicator rolled against the vaginal wall. Cells are transferred to a glass slide, dried, stained with Wright-Giemsa stain, and examined microscopically to identify the cycle stage based on cell type and appearance.

What is a copulatory plug and why is it important in rodent breeding?

A copulatory plug is a whitish mass of vaginal fluid and semen that persists 12-24 hours after mating. It can be detected by visual inspection or by gently inserting a blunt probe into the vaginal opening, where it will impede advancement within 0.5 cm. The plug's presence confirms mating occurred, though it does not guarantee pregnancy. Finding a plug establishes embryonic day zero for pregnancy dating.

What are the differences between intensive and non-intensive breeding schemes?

In intensive breeding, males remain with females and pups, allowing immediate conception after birth. This maximizes breeding output but causes continuous lactation and gestation stress on females. Non-intensive breeding separates pregnant females from males until pups are weaned, reducing female stress. Weaning timing differs: non-intensive at 21-28 days, intensive at day 20 to prevent older pups from meeting the next litter.

How do inbreeding and genetic modifications affect rodent breeding performance?

Outbred animals are more hardy and vigorous, producing larger and stronger litters compared to inbred animals. Genetically modified animals tend to be less hardy and fertile, with some mutations causing pup lethality before or shortly after birth. Environmental factors like temperature, humidity, lighting, noise, and vibrations also significantly reduce breeding efficiency in laboratory rodent colonies.

What care is needed for newly weaned rodent pups?

Newly weaned pups should be checked daily to ensure they are thriving. Male and female pups must be separated at weaning since rodents can mate as young as 8 weeks. Pups should not be housed singly when possible; single pups should be grouped with same-gender pups from other litters. Food should be placed on the cage floor for 7-10 days to aid transition to solid chow, and water bottles should be provided to prevent dehydration.

How do researchers use in-house breeding to study genetic and developmental effects?

In-house breeding enables researchers to develop homozygous knockout mice by selectively breeding animals with altered genes. It also allows study of prenatal exposure effects; for example, researchers can administer test compounds during specific embryonic days and examine resulting fetal tissues. Additionally, controlled breeding facilitates investigation of postpartum disorders by manipulating maternal stress and observing effects on maternal aggression and care behaviors.

Podstawy hodowli i odsadzania

0 wyświetleń15:00 min.

1. Informacje potrzebne przy parowaniu zwierząt obejmują szczep/stado zwierzęcia z zastosowaniem właściwej nomenklatury, daty urodzenia samca i samicy hodowcy oraz datę założenia. Dokładne prowadzenie dokumentacji jest niezbędne w przypadku rodzin hodowlanych.

2. Określenie płci myszy i szczurów odbywa się poprzez porównanie odległości odbytu i narządów płciowych. U samic odległość między odbytem a zewnętrznymi narządami płciowymi jest krótsza niż u mężczyzn. Obecność worka mosznowego u samców jest kolejnym wskaźnikiem płci.

3. Wybór i ustawienie schematu krycia

UWAGA: Istnieją dwa schematy łączenia, które można zastosować.

Krycie w czasie ruj/rui: Ta metoda polega na parowaniu samic z samcami w punkcie maksymalnej receptywności i płodności.
1. Cykl rujowy u samic musi być monitorowany albo poprzez wizualne badanie zewnętrznych narządów płciowych pod kątem zmian wskazujących na ruję i ruję, albo poprzez cytologię wydzieliny z pochwy (patrz poniżej).
2. Kiedy samica zostanie uznana za ruję lub ruję, jest łączona w parę z samcem pod koniec dnia, ponieważ zwierzęta zazwyczaj łączą się w pary w nocy.
3. Następnego ranka samica jest badana pod kątem czopa kopulacyjnego (patrz poniżej). Jeśli nie ma wtyczki, samica może pozostać z samcem w ciągu dnia i sprawdzić, czy pod koniec dnia nie ma korka kopulacyjnego. Alternatywnie, jeśli zostanie stwierdzone, że nie znajduje się już w rui lub rui, usuwa się ją z klatki hodowlanej.
Losowe krycie w czasie: Ta metoda opiera się na fakcie, że cykl rujowy gryzoni jest bardzo krótki, trwa 4-5 dni.
1. W przypadku tej metody krycia można ustawić w dowolnym momencie, a samice są następnie sprawdzane pod kątem czopów kopulacyjnych każdego ranka i wieczoru, aż do zaobserwowania czopki.
2. Samica jest sparowana z samcem wieczorem.
3. Na początku i na końcu każdego dnia sprawdza się ją pod kątem czopa kopulacyjnego, aż do momentu zaobserwowania czopka. Zwykle potrzeba 3 lub więcej dni, aby wtyczka była widoczna podczas korzystania z tej metody.

4. Przewidywanie ciąży

Ponieważ badanie palpacyjne szczeniąt jest trudne do późnego okresu ciąży, około 10-12 dnia, opracowano komercyjne systemy ultrasonograficzne dla gryzoni; Jednak niewiele ośrodków badawczych na zwierzętach dysponuje tą technologią. Dlatego wizualizacja czopów krzepliwych, obserwacja zmian w pochwie lub cytologia pochwy są powszechnie stosowane, aby pomóc w przewidywaniu, kiedy samica poczęła miot (patrz poniżej). Jednak żadna z tych metod nie jest w stanie potwierdzić ciąży. Po zaobserwowaniu czopa kopulacyjnego samica powinna być monitorowana pod kątem objawów ciąży, takich jak przyrost masy ciała.

5. Określenie etapu cyklu rujowego

Oględziny
UWAGA: W przypadku krycia rujowego myszy i szczurów obserwacja wzrokowa pochwy pod kątem zmian wskazujących na ruję i ruję jest najszybszą metodą określenia etapu cyklu rujowego i nie wymaga specjalnego sprzętu.
1. Podczas oceny cyklu rujowego za pomocą metody wizualnej ważne jest, aby przeprowadzić oględziny w tym samym obszarze w odniesieniu do oświetlenia pomieszczenia, ponieważ źródło światła może zmienić postrzegany kolor tkanek pochwy i utrudnić ocenę. Na przykład fioletowy odcień rzucany przez światła LED utrudnia wykrywanie wizualne.
2. Aby ocenić stadium cyklu rujowego za pomocą obserwacji wzrokowej, każda mysz musi być ręcznie przytrzymywana przez ogon, z przednimi łapami spoczywającymi na pokrywie klatki.
3. Otwór pochwy każdej kobiety ocenia się na podstawie stanu tkanki otaczającej obszar pochwy i wielkości otworu pochwy. ²
  1. Podczas rui otwór pochwy jest szeroki i charakteryzuje się obrzękiem otaczającej tkanki. Tkanka jest koloru różowego i bardzo wilgotna. Często występują zmarszczki lub prążki wzdłuż grzbietowych i brzusznych krawędzi otworu.
  2. Podczas rui obrzęk tkanek otaczających otwór pochwy ulega zmniejszeniu, a tkanki nie są tak wilgotne i różowe.
  3. Podczas metestrus otwór pochwy jest minimalny, a obrzęk jest znikomy.
  4. Podczas diestrus nie dochodzi do obrzęku tkanek wokół obszaru pochwy, a otwór pochwy jest mały i zamknięty.
Cytologia pochwy
Ponieważ zarówno myszy, jak i szczury są wielorujowe, długość cyklu rui jest bardzo krótka i wynosi od 4 do 5 dni. Czasami konieczne jest zidentyfikowanie wszystkich czterech stadiów rui: proestrus, estrus, metestrus i diestrus. Cytologia pochwy jest bardzo dokładną metodą określania tych etapów. Istnieją również dwie metody pobierania próbek: nieinwazyjna metoda płukania pochwy oraz inwazyjna metoda wymazu z kanału pochwy.
1. Płukanie pochwy
  1. Potrzebne materiały to sterylne końcówki do pipet o pojemności 200 μl, gruszki lateksowe, sterylna woda podwójnie destylowana (ddH₂0) oraz czyste szkiełka podstawowe.
  2. Umieść lateksową bańkę na końcu sterylnej końcówki o pojemności 200 μl. Pobrać około 100 μl sterylnego ddH₂O do pipety.
  3. Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na górze klatki z drucianego pręta ogonem do siebie.
  4. Mocno chwyć ogon i podnieś tylne kończyny myszy. Mysz będzie teraz miała tylko przednie łapy chwytające pokrywę.
  5. Jeśli mysz oddaje mocz, poczekaj, aż oddawanie moczu ustanie. Jeśli przy wejściu do kanału pochwy pozostał mocz, otwór można przepłukać niewielką ilością ddH₂O. Zmień końcówkę, która była używana do płukania.
  6. Umieść koniec końcówki wypełnionej ddH₂O-wypełnionej O, w otworze kanału pochwy, nie penetrując otworu.
  7. Delikatnie wciśnij bańkę, aby usunąć od jednej czwartej do połowy objętości wody (~25-50 μl) przy ujściu kanału pochwy. Płyn spontanicznie zasysa się do kanału bez wkładania końcówki. Powoli zmniejszaj nacisk wywierany na żarówkę. Płyn cofnie się z powrotem do końcówki.
  8. Unikaj zbyt szybkiego zwalniania ciśnienia, aby zapobiec zasysaniu płynu do bańki. Do tego celu może przydać się końcówka z filtrem.
  9. Powtórz poprzedni krok 4-5 razy, używając tej samej końcówki, bańki i płynu, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek w jednej próbce.
  10. Umieść płyn na szkiełku podstawowym i pozostaw rozmaz do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  11. Użyj nowej pipety dla każdej myszy.
  12. Po wyschnięciu te rozmazy rujowe można natychmiast zabarwić lub przechowywać i barwić w późniejszym terminie. Barwienie Wright-Giemsa jest najczęściej stosowane do barwienia szkiełek. Ta plama jest dostępna w handlu jako jednoetapowa plama, która nie wymaga mocowania szkiełka, aby zapobiec zmywaniu komórek podczas procesu barwienia. Szkiełko umieszcza się w plamie na 45-60 sekund, zgodnie z instrukcją producenta.
  13. Szkiełka są następnie badane pod mikroskopem, a widziane komórki odpowiadają etapowi cyklu: 1) jeśli samica jest w proestrusie, komórki są widziane jako skupiska okrągłych, dobrze uformowanych jądrzastych komórek nabłonkowych z jądrem, które barwi się ciemniej niż cytoplazma; 2) jeśli samica jest w rui, większość komórek to zrogowaciałe płaskonabłonkowe komórki nabłonkowe, które nie mają jądra, mają kanciasty wygląd i występują w gęsto upakowanych skupiskach; 3) jeśli samica jest w Metestrus, komórki są zazwyczaj białymi krwinkami (w szczególności neutrofilami z obecnymi zrogowaciałymi komórkami nabłonka płaskiego) z ciemno zabarwionymi jądrami, które mają kształt dwóch połączonych ze sobą kiełbasek; 4) Podczas diestrus obecne komórki są zwykle białymi krwinkami z występowaniem kilku jądrzastych komórek nabłonka.
2. Wymaz z pochwy
  1. Potrzebne materiały to sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką z końcówką o średnicy 2 mm, czyste szklane szkiełka mikroskopowe i sterylna sól fizjologiczna.
  2. Zwilż aplikator z bawełnianą końcówką solą fizjologiczną.
  3. Włóż końcówkę aplikatora do pochwy skrępowanej myszy.
  4. Delikatnie obróć i obróć końcówkę o ścianę pochwy. Ostrożnie wyjmij wacik.
  5. Komórki przenosi się na suche szkiełko podstawowe, przesuwając wacik po szkiełku.
  6. Po wyschnięciu szkiełka można je zabarwić barwnikiem Wright-Giemsa.
    Wymazy są uważane za stresującą procedurę, a gdy są zestresowane, myszy mogą mieć zakłócone cykle rujowe. Stymulacja pochwy i szyjki macicy spowodowana pobraniem wymazu może wywołać ciążę rzekomą. Powtarzające się wymazy z błony śluzowej pochwy mogą spowodować uszkodzenie, jeśli nie są wykonywane delikatnie, z odpowiednią powściągliwością i przy użyciu wacików bawełnianych o odpowiednim rozmiarze. ^3,4

Rysunek 2. Cytologia pochwy -- różne etapy cyklu rui gryzoni

6. Wizualizacja korka kopulacyjnego

Czop ten składa się z płynu pochwowego i nasienia i utrzymuje się w pochwie przez 12-24 godziny po kopulacji. Obecność zatyczki potwierdza krycie, ale nie gwarantuje, że samica jest w ciąży. Jeśli zatkana samica jest w ciąży, za pierwszy dzień ciąży uważa się dzień po znalezieniu wtyczki.

Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na górze klatki z drucianego pręta ogonem do siebie.
Ustaw mysz, wywierając nacisk tuż nad ogonem, aby wygiąć plecy w łuk, aby umożliwić lepszą prezentację otworu pochwy.
Obserwuj jej otwór pochwy pod kątem białawej masy. Korek kopulacyjny może nie być wizualnie oczywisty, ale można go potwierdzić za pomocą tępej sondy.
Za pomocą końcówki sondy delikatnie włóż ją do otworu pochwy. Obecność czopa kopulacyjnego utrudni przesuwanie sondy w promieniu 0,5 cm od otworu pochwy.
Sondę należy zdezynfekować alkoholem i całkowicie wysuszyć przed każdym użyciem.

Ponieważ samica ma mioty, należy odnotować datę urodzenia, wielkość miotu, liczbę urodzonych, liczbę odsadzonych od piersi, stosunek młodych samców do samic oraz stosunek genotypów. Jeżeli genotypy w miocie nie odpowiadają genotypom rodziców, należy przeprowadzić ponowne badanie w celu zweryfikowania prawdziwego genotypu.

7. Odstawienie od piersi

Ciąża myszy i szczurów trwa około 21 dni. Młode są odsadzane od piersi w wieku 21-28 dni. Zarówno myszy, jak i szczury mogą rozmnażać się już w wieku 8 tygodni, dlatego konieczne jest, aby młode zostały rozdzielone według płci w młodym wieku. Intensywna hodowla wymaga, aby młode z każdego miotu były odsadzone od piersi w 20 dniu, aby zapobiec obecności starszych szczeniąt przy narodzinach następnego miotu. W przypadku hodowli nieintensywnej młode mogą być pozostawione z matką po 20 dniu życia, często do 28 dnia życia. Może to być bardzo korzystne dla wielu genetycznie modyfikowanych szczepów, ponieważ szczenięta mogą nie być tak energiczne jak zwierzęta niemodyfikowane lub typu dzikiego.

Młode płci męskiej i żeńskiej są rozdzielane po odsadzeniu. Jeśli to możliwe, świeżo odsadzone szczenięta nie powinny być trzymane pojedynczo. W przypadku, gdy w miocie znajduje się tylko jedno młode danej płci, należy podjąć starania o trzymanie tego młodego z innymi młodymi osobnikami tej samej płci. Możliwe opcje utrzymania to: 1) pojedyncze młode samice mogą pozostać z matką, jeśli nie w klatce intensywnie hodowlanej; 2) pojedyncze młode płci żeńskiej lub męskiej może być umieszczone z innymi młodymi tej samej płci z innego miotu w tym samym wieku; 3) jeśli rodzice są parą monogamiczną, samica może zostać usunięta z klatki, aby umożliwić jednemu młodemu samcowi trzymanie się z ojcem; oraz 4) pojedynczy samiec może być trzymany z rodzeństwem płci żeńskiej do 5 tygodnia życia. Płeć szczeniąt powinna być weryfikowana tydzień po odsadzeniu, aby zapobiec niechcianym miotom z powodu niewłaściwej segregacji szczeniąt.

Myszy i szczury odsadzone od piersi powinny być codziennie sprawdzane, aby upewnić się, że dobrze się rozwijają. Chociaż Przewodnik dotyczący opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych⁵ stwierdza, że pokarm musi być podawany zwierzętom w taki sposób, aby zapobiec zabrudzeniu go kałem i moczem, nowo odsadzonym myszom należy zapewnić niewielką ilość jedzenia (jedna granulka na mysz) umieszczoną w szklanym naczyniu (szalce Petriego) na podłodze klatki. Zachęci to zwierzęta do przejścia na karmę dla gryzoni jako jedyne źródło pożywienia. Nawet w przypadku zwierząt trzymanych na stojakach, które dostarczają wodę do klatek za pomocą automatycznego systemu pojenia, do klatki można dodać butelkę z wodą, jeśli myszy wydają się być odwodnione.

Nazwa	Typ kolonii	Opis
ICR	Niekrewniaczy	Albinos
Szwajcarski-Webster	Niekrewniaczy	Albinos
Balb/c	Wsobny	Albinos
FVB	Wsobny	Albinos
C57BL/6	Wsobny	Czarny kolor sierści
C₃H	Wsobny	Brązowy kolor sierści
DBA/2	Wsobny	Brązowo-szary kolor sierści
Akty atymiczne (nu/nu)	Wsobny	Bezwłosy
SCID	Wsobny	Ciężkie połączone myszy z niedoborem odporności - różne kolory sierści

Tabela 1. Powszechnie używane plamy i kolby po myszach.

Nazwa	Typ kolonii	Opis
Sprague-Dawley	Niekrewniaczy	Albinos
Wistar	Niekrewniaczy	Albinos
Rybak 344	Wsobny	Albinos
Lewis	Wsobny	Albinos
Długi Evans	Wsobny	Bluza z kapturem, czarno-biała