Name: Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Naucz się przygotowywać sztuczne dwuwarstwy lipidowe do badań elektrofizjologicznych kanałów jonowych. Film pokazuje krok po kroku montaż komory, elektrod i czyszczenie sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Więcej informacji na temat przygotowywania sztucznych dwuwarstw oraz wykorzystania kanałów gramicydynowych do badania elastyczności błon można znaleźć w serwisie <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">Springer Protocols</a>.

Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, umożliwiają badanie kanałów jonowych w ściśle zdefiniowanym środowisku. Dwuwarstwy te mogą być wykorzystywane w wielu różnych badaniach, takich jak charakterystyka peptydów aktywnych błonowo, rekonstytucja kanałów jonowych czy analizy wpływu zmian właściwości dwuwarstwy lipidowej na funkcję kanałów przebiegających przez dwuwarstwę. W niniejszym materiale pokazujemy, jak utworzyć planarną dwuwarstwę oraz jak izolować z niej małe fragmenty (patche), a w drugim filmie zaprezentujemy procedurę wykorzystującą kanały gramicydyny do określania zmian właściwości sprężystych dwuwarstwy lipidowej. Przedstawiamy również poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób weryfikacji, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, umożliwiają badanie kanałów przewodzących jony w ściśle zdefiniowanym środowisku. Dwuwarstwy te mogą ...

Witam, jestem dr Olaf Anderson z Katedry Fizjologii i Biofizyki na Weill Cornell Medical College w Nowym Jorku. Witam, nazywam się Ruchi Kaur, jestem studentką studiów MD PhD w laboratorium dr Olafa Andersona. Witam, nazywam się John Kim.Jestem technikiem badawczym. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przygotować się do eksperymentów z pojedynczym kanałem w czystych dwuwarstwach lipidowych. Pokażemy, jak przygotować komorę oraz jak przygotować elektrody typu Bilayer Punch.W celu przeprowadzenia pomiarów izolujemy niewielkie obszary błony. Zacznijmy zatem. Nasz układ elektrofizjologiczny składa się z następujących elementów: stołu antywibracyjnego zawieszonego w powietrzu w celu zminimalizowania drgań mechanicznych, klatki Faradaya służącej do ekranowania przed szumami elektrycznymi, dźwiękiem i wibracjami oraz statywu.W przypadku komory dwuwarstwowej stosujemy cyrkulacyjną płaszcz wodny do kontroli temperatury, w której umieszczona jest komora, oraz mikromanipulator do montażu głowicy wzmacniacza patch-clamp. Jednostka filtra elektronicznego służy do dalszego filtrowania sygnału wyjściowego ze wzmacniacza patch-clamp przy częstotliwości 500 Hz. W celu wizualizacji przejść prądowych wykorzystuje się oscyloskop do wyświetlania sygnału prądowego, zarówno z wyjścia wzmacniacza patch-clamp, jak i z filtra elektronicznego.Na koniec, niezbędny będzie komputer z systemem akwizycji danych, który cyfryzuje sygnał z techniki patch clamp. Przy częstotliwości próbkowania 20 kilohertz korzystamy z oprogramowania opracowanego wewnętrznie do zapisu i analizy danych. Wszystkie urządzenia są włączane na 20 minut przed rozpoczęciem pracy.Następnie przygotujemy komorę, w której przeprowadzane są eksperymenty. Komora jest podzielona na dwie połowy za pomocą przegrody (septum), wykonanej z cienkiej arkusza teflonowego o grubości około 100 mikronów i wypełnionej roztworem elektrolitu. Tworzymy dwuwarstwę w otworze przegrody, co zapewnia połączenie między roztworami elektrolitu.Otwór powinien mieć średnicę od 1 do 1,5 mm. Używając wazeliny jako uszczelniacza, umieść szklane okienko w przedniej połowie komory teflonowej, a następnie przełóż śruby ze stali nierdzewnej przez jeden metalowy wspornik i cztery otwory w tylnej połowie komory. Stosując wazelinę jako uszczelniacz, umieść okrągłą przegrodę teflonową w taki sposób, aby znalazła się ona pomiędzy dwiema połowami zmontowanej komory.Upewnij się, że otwór w przegrodzie znajduje się w centrum. Nałóż wazelinę na obie strony przegrody, aby zapewnić szczelność komór z elektrolitem oraz ich izolację elektryczną. Kontynuuj wkręcanie śrub przez przednią część komory i przedni metalowy wspornik.Dokręć zespół, aby upewnić się, że wszystkie elementy są mocno utrzymane na miejscu, ale nie rób tego zbyt mocno, aby umożliwić oczyszczenie komory i usunięcie wazeliny. Pipetę Pasteura należy wypalić, wypolerować i zgiąć pod kątem prostym. Wypalenie i polerowanie końcówki pipety na gładko pomaga uniknąć zarysowania szkła lub teflonu.Następnie oczyść komorę mieszaniną chloroformu i metanolu w stosunku dwa do jednego lub roztworem fch. Za pomocą pipety usuń nadmiar wazeliny roztworem fch, uważając, aby nie rozmazać jej po teflonie i szkle. Użyj co najmniej 10 objętości fch.Po wykonaniu tej czynności do komór dodaje się mieszadła magnetyczne. Następnie komorę należy oczyścić 95% etanolem, a na koniec wodą o wysokiej czystości – wodą destylowaną, wodą UE lub jej odpowiednikiem.Podobnie jak poprzednio, użyj wypalanej pipety do odessania cieczy. Na koniec powtórz czyszczenie za pomocą etanolu i wody. Następnie użyj wody, etanolu i fol.Obecnie wykonamy szklaną mikro pipetę z elektrodą, która będzie służyć jako połączenie elektryczne z tylną komorą urządzenia. Używając wyciągacza mikro pipet P 97 od Sutter Instruments, wyciągnięto kapilarę szklaną, aby stworzyć dwie mikro pipety, z których każda posiada ostry i krótki stożek. Stosujemy kapilary wykonane ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 0,8 mm i średnicy wewnętrznej 0,5 mm. Kapilara szklana zostaje umieszczona w wyciągaczu i zamocowana w celu przygotowania do procesu wyciągania włókna.Elektroda powinna być wykonana z platyny, ponieważ inne rozwiązania nie przyniosły sukcesu. Po wyciągnięciu pipet w elektrodach polarnych z włóknami wolframowymi, kolejne kilka kroków zostanie wykonanych w mikropiecu z włóknem platynowym. Przed użyciem mikropieca należy upewnić się, że włókno jest dobrze pokryte szkłem.Można zastosować miękkie szkło sodowo-wapniowe lub twarde szkło borokrzemowe. Należy dostosować temperaturę w mikrokuźni tak, aby szkło płynęło gładko i równomiernie pokrywało filament cienką warstwą. Następnie należy zamocować mikropipetę w mikrokuźni i odłamać końcówkę.Osiągamy to poprzez delikatne zmiękczenie szklanej powłoki włókna w stosunkowo niskiej temperaturze. Następnie powoli przesuwamy końcówkę mikropipety w stronę szklanej powłoki włókna, tak aby oba elementy stopiły się ze sobą; po czym wyłączamy ogrzewanie włókna, które kurczy się, powodując odłamanie końcówki pipety. W ten sposób otrzymujemy ostry i równomierny otwór o średnicy około 30 mikronów.Ponownie, używając mikrokuźni, wykonaj zgięcie pod kątem prostym w mikropipecie w odległości trzech do czterech milimetrów od końcówki, umieść pipetę kilkaset mikronów nad włóknem, a następnie włącz ogrzewanie, aż włókno rozżarzy się na czerwono. Włókno przesunie się wskutek rozszerzalności termicznej. Następnie delikatnie opuść pipetę na włókno, co spowoduje jego zgięcie.Stopień zgięcia kontroluje się za pomocą temperatury włókna. Gdy kąt zgięcia wyniesie około 80 stopni, należy szybko przesunąć pipetę w górę i do przodu. Wymaga to pewnej koordynacji.Celem jest uzyskanie zgięcia pod kątem 90 stopni przy zastosowaniu tych samych ustawień. Należy wypolerować końcówkę mikropipety ogniowo, aby filament pozostał pokryty szkłem. Następnie końcówkę pipety silylowano za pomocą 10% roztworu trioktylosilanu w benzenie.Dzięki temu powierzchnia pipety staje się hydrofobowa, co zapewnia odpowiednią interakcję z membraną. Pozostaw roztwór, aby wciągnął się na kilka milimetrów do wnętrza pipety dzięki działaniu kapilarnemu. Odparuj ciecz za pomocą mikrokuźni w niskiej temperaturze i procedura jest zakończona.W tej części pokażemy, jak przygotować elektrodę srebrową. Należy odciąć pięciocentymetrowy odcinek drutu srebrowego o średnicy około 1 mm. Następnie należy go zwinąć trzy lub cztery razy w cewkę o średnicy wewnętrznej od 2 do 3 mm.Pozostałą część pozostaw jako ogonek, który należy zgiąć pod kątem prostym do helisy. Pokryj ogonek oraz przyległe od pięciu do 10 milimetrów srebrnego drutu stopionym chlorkiem srebra. Następnie przygotuj roztwór do tworzenia dwuwarstwy.W naszym przypadku lipidem była fosfatydylocholina w dekatanie. Lipid jest przechowywany w szklanych probówkach w temperaturze -40 °C w postaci 150 µL aliquotów lipidów i chloroformu. Należy wyjąć szklaną probówkę z zamrażarki, pozostawić ją do osiągnięcia temperatury pokojowej, a następnie odparować chloroform pod strumieniem suchego azotu.W dygestorium dodać 50 µL decanu i wymieszać w wstrząsaczu typu vortex. Aby zapewnić dobry kontakt między roztworem tworzącym dwuwarstwę a teflonem otaczającym otwór, nad którym tworzona jest dwuwarstwa, ponownie malujemy przegrodę teflonową wokół otworu. Najpierw oczyścić wypaloną pipetę pasterską za pomocą fch.Następnie zanurz oczyszczoną pipetę w 2,5% fosfolipidach w n-dekanie, pozwalając lipidom wznieść się w pipecie na około jeden milimetr. Nanieś kroplę lipidów w formie filmu na otwór w teflonowej przegrodzie. Pozostaw lipidy do wyschnięcia na około 10 do 15 minut i powtórz czynność. Witaj.W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak przygotować dwuwarstwy lipidowe do eksperymentów nad pojedynczymi kanałami. W towarzyszącym filmie pokażemy, jak izolować małe fragmenty błony, jak rejestrować aktywność pojedynczych kanałów, jak modyfikować tę aktywność za pomocą małych cząsteczek oraz jak analizować wyniki. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Miękkie, biomolekularne memrystory o niskiej mocy wykorzystują podobny skład, strukturę i mechanizmy przełączania biosynaps. Przedstawiono protokół składania i charakterystyki memrystorów biomolekularnych otrzymywanych z izolacji dwuwarstw lipidowych powstałych pomiędzy kropelkami wody w oleju. Włączenie aktywowanych napięciem peptydów alametycyny powoduje memrystywne przewodnictwo jonowe w poprzek błony.

Montaż i charakterystyka memrystorów biomolekularnych składających się z błon lipidowych domieszkowanych kanałami jonowymi

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.

Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Naucz się przygotowywać sztuczne dwuwarstwy lipidowe do badań elektrofizjologicznych kanałów jonowych. Film pokazuje krok po kroku montaż komory, elektrod i czyszczenie sprzętu.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów