Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR)
Źródło: David C. Powers, Tamara M. Powers, Texas A&M
W tym filmie poznamy podstawowe zasady rządzące elektronowym rezonansem paramagnetycznym (EPR). U…
1. Autooksydacja aldehydu masłowego
- Przygotować roztwór aldehydu masłowego (100 mg) i CoCl2·6H2O (1 mg) w 1,2-dichloroetanie (DCE) (4 ml) w 20 ml fiolki scyntylacyjnej. Dodać mieszadło magnetyczne i dopasować fiolkę do gumowej przegrody.
- Przymocuj cylinder plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml do krótkiego kawałka gumowej rurki. Włóż gumową rurkę do balonu lateksowego i przymocuj balon do rurki za pomocą gumowej opaski i taśmy elektrycznej. Napompuj balon lateksowy za pomocą O2.
- Włożyć igłę balonu O2 do fiolki reakcyjnej. Wprowadzić drugą igłę do przegrody i oczyścić przestrzeń czołową naczynia reakcyjnego za pomocą O2.
- Za pomocą płytki mieszającej mieszaj reakcję w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w atmosferze O2.
- Zagęścić mieszaninę reakcyjną za pomocą wyparki obrotowej i pobrać widmo 1H powstałej oleistej pozostałości w CDCl3.
2. Stosowanie BHT jako przeciwutleniacza do autooksydacji aldehydu masłowego
Ustawić dwie fiolki zgodnie z poniższym opisem. Jeden z nich zostanie wykorzystany do analizy dystrybucji produktu, a drugi zostanie wykorzystany w kroku 3 do spektroskopii EPR.
- Przygotować roztwór aldehydu masłowego (100 mg) i CoCl2·6H2O (1 mg) w DCE (4 ml) w 20 ml fiolce scyntylacyjnej. Dodać BHT (10 mg) do roztworu. Dodać mieszadło magnetyczne i dopasować fiolkę do gumowej przegrody.
- Przymocuj cylinder plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml do krótkiego kawałka gumowej rurki. Włóż gumową rurkę do balonu lateksowego i przymocuj balon do rurki za pomocą gumowej opaski i taśmy elektrycznej. Napompuj balon lateksowy za pomocą O2.
- Włożyć igłę balonu O2 do fiolki reakcyjnej. Wprowadzić drugą igłę do przegrody i oczyścić przestrzeń nad głową naczynia reakcyjnego za pomocą O2.
- Za pomocą płytki mieszającej mieszaj reakcję w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w atmosferze O2.
- Zagęścić mieszaninę reakcyjną za pomocą wyparki obrotowej i pobrać widmo 1H powstałej oleistej pozostałości w CDCl3.
3. Pomiar widm EPR
- Włącz spektrometr EPR i pozwól instrumentowi rozgrzać się przez 30 minut. Skonfiguruj akwizycję EPR z następującymi parametrami: pole środkowe 3,345 G, szerokość przemiatania 100 G, czas przemiatania 55 s, stała czasowa 10 ms, moc MW 5 mW, modulacja 100 kHz i amplituda modulacji 1 G.
- Zmierz widmo EPR pustej probówki EPR, aby upewnić się, że nie ma sygnałów tła ani z lampy EPR, ani z rezonatora instrumentu.
- Przygotuj roztwór BHT w DCE w komorze rękawicowej wypełnionej N2. Przenieść 0,5 ml roztworu do probówki EPR i zmierzyć widmo EPR BHT, korzystając z parametrów akwizycji określonych w kroku 3.1.
- Przenieść 0,5 ml roztworu reakcyjnego z dodatkiem BHT z etapu 2 do probówki EPR i uzyskać widmo EPR przy użyciu parametrów akwizycji określonych w kroku 3.1.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest ważną techniką charakteryzowania związków paramagnetycznych, takich jak związki z niesparowanymi elektronami.
EPR ma wiele ważnych zastosowań w badaniu rodników organicznych, paramagnetycznych kompleksów nieorganicznych i chemii bionieorganicznej.
Ten film zilustruje podstawowe zasady stojące za elektronowym rezonansem paramagnetycznym, zastosowaniem EPR do badania dibutylohydroksytoluenu i jego zachowania przeciwutleniającego w autooksydacji aldehydów alifatycznych oraz omówi kilka zastosowań.
EPR to technika spektroskopowa, która służy do badania cząsteczek z niesparowanymi elektronami poprzez pomiar przejść spinowych elektronów.
Elektron ma spinową liczbę kwantową równą 1/2, która ma składniki magnetyczne +1/2 lub -1/2.
W przypadku braku pola magnetycznego energia dwóch stanów spinowych jest równoważna. Jednak w obecności przyłożonego pola magnetycznego moment magnetyczny elektronu wyrównuje się z przyłożonym polem magnetycznym, a stany spinowe stają się niezdegenerowane.
Różnica energii między stanem spinu zależy od natężenia pola magnetycznego. Nazywa się to efektem Zeemana.
W danym polu magnetycznym różnica energii między dwoma stanami spinowymi jest określona przez ?E.
Elektron porusza się między dwoma stanami spinowymi po emisji lub absorpcji fotonu o energii ?E. Jednak równanie to odnosi się do pojedynczego, swobodnego elektronu i nie uwzględnia faktu, że elektrony w cząsteczkach nie zachowują się w taki sam sposób, jak izolowany elektron.
Gradient pola elektrycznego cząsteczki wpłynie na efektywne pole magnetyczne, które, jeśli zostanie podłączone do tego równania, definiuje współczynnik g dla niesparowanego elektronu w danej cząsteczce w tym uproszczonym ogólnym równaniu.
Podczas eksperymentu EPR częstotliwość jest zamiatana, podczas gdy pole jest utrzymywane na stałym poziomie, co pozwala na obliczenie współczynnika g dostarczającego informacji o strukturze elektronowej cząsteczki paramagnetycznej.
W tym eksperymencie spektroskopia EPR jest używana do badania przeciwutleniaczy. Tlen, który jest silnym utleniaczem, jest trypletem stanu podstawowego i dlatego reaguje dość wolno z większością cząsteczek organicznych. Jedną z ważnych, choć często niepożądanych, reakcji zachodzących pod wpływem tlenu jest autooksydacja, w której O2 inicjuje rodnikowe procesy łańcuchowe.
Może to prowadzić do szybkiego zużycia cząsteczek organicznych i rozkładu wielu materiałów organicznych, takich jak tworzywa sztuczne. Dlatego identyfikacja skutecznych przeciwutleniaczy hamujących autooksydację stała się ważną dziedziną badań.
Jednym z mechanizmów, dzięki którym przeciwutleniacze mogą funkcjonować, jest reakcja z rodnikowymi produktami pośrednimi w celu zahamowania radykalnych procesów łańcuchowych. Ponieważ rodniki mają niesparowane spiny, EPR jest cennym narzędziem do zrozumienia chemii przeciwutleniaczy.
Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób spektroskopia EPR jest wykorzystywana do zbadania roli dibutylohydroksytopoluenu jako przeciwutleniacza w autooksydacji aldehydów alifatycznych.
Zacznijmy od autooksydacji aldehydu masłowego przy braku przeciwutleniacza. Używając 20 ml fiolki scyntylacyjnej, rozpuść 125 ml aldehydu masłowego i 1 mg CoCl2?6H2O?w 4 ml 1,2-dichloroetanu. Dodać mieszadło magnetyczne i zamknąć fiolkę gumową przegrodą.
Przymocuj cylinder plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml do krótkiego kawałka gumowej rurki. Włóż gumową rurkę do lateksowego balonu i zabezpiecz gumką i taśmą izolacyjną. Następnie napompuj balon gazowym tlenem.
Wprowadzić igłę balonu wypełnionego tlenem do fiolki. Włóż drugą igłę przez przegrodę i przepłucz roztwór tlenem gazowym przez pięć minut. Po oczyszczeniu wyjąć drugą igłę i umieścić fiolkę na płytce do mieszania, mieszając reakcję przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu reakcji zagęścić mieszaninę za pomocą wyparki obrotowej. Następnie wysuszyć pozostałość na linii wysokopróżniowej przez 1 godzinę i uzyskać 1H-NMR w deuterowanym chloroformie.
Porównajmy teraz reakcję, jeśli jest przeprowadzana w obecności przeciwutleniacza dibutylohydroksytoluenu lub BHT. Przygotować dwie identyczne próbki, rozpuszczając CoCl2?6H2O i aldehyd masłowy w 1,2-dichloroetanie za pomocą 20-ml fiolki scyntylacyjnej. Dodaj przeciwutleniacz do każdego roztworu, a następnie mieszadło i dopasuj każdą fiolkę do gumowej przegrody.
Podobnie jak w poprzedniej reakcji, użyj balonu, aby przepłukać roztwór w fiolkach tlenem, a następnie mieszaj reakcje w atmosferze tlenu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po 4 godzinach zagęścić jedną z mieszanin za pomocą parownika obrotowego dla 1H-NMR. Wysuszyć próbkę w wysokiej próżni i użyć tej próbki do uzyskania 1H-NMR. Druga reakcja zostanie wykorzystana w przypadku EPR.
Włącz spektrometr EPR i pozwól instrumentowi rozgrzać się przez 30 minut. W komputerze dostrój pustą wnękę instrumentu EPR, aby upewnić się, że w instrumencie nie ma zanieczyszczeń.
Skonfiguruj akwizycję EPR z parametrami podanymi w tekście. Zmierz widmo EPR pustej probówki EPR, aby upewnić się, że nie ma sygnałów tła ani z lampy EPR, ani z rezonatora instrumentu.
Następnie użyj BHT i przygotuj roztwór 1,2-dichloroetanu w komorze rękawicowej wypełnionej N2. Przenieść 0,5 ml roztworu do probówki EPR o średnicy 2 mm, przykrywając ją plastikową nakrętką z probówki EPR. Zmierz widmo EPR BHT za pomocą wcześniej ustawionych parametrów akwizycji.
Teraz użyj reakcji zawierającej BHT i przygotuj roztwór EPR zgodnie z tą samą procedurą, co dla próbki BHT. Pozyskaj widmo EPR, korzystając z wcześniej ustawionych parametrów nabycia.
Porównajmy teraz reakcje z przeciwutleniaczem BHT i bez niego, korzystając z danych NMR i EPR.
Autoksydacja aldehydu masłowego daje kwas masłowy. Widmo 1H-NMR uzyskane z reakcji wskazuje na brak aldehydowego rezonansu C-H oraz obecność rezonansów oczekiwanych od kwasu masłowego.
Natomiast NMR uzyskany z mieszaniny reakcyjnej z dodatkiem BHT wykazuje sygnały zgodne z aldehydem masłowym, bez obecności kwasu masłowego. Z tych danych wynika, że BHT służył jako przeciwutleniacz w autooksydacji aldehydów.
Rola BHT w hamowaniu autooksydacji aldehydów jest naświetlona przez widma EPR uzyskane z BHT i BHT dodanych do reakcji autooksydacji aldehydów.
BHT jest diamagnetyczną cząsteczką organiczną, co oznacza, że nie ma niesparowanych elektronów. W związku z tym widmo EPR BHT nie wyświetla żadnych sygnałów. W przeciwieństwie do tego, widmo EPR reakcji autooksydacji, w której dodano BHT, wykazuje silny czteroliniowy wzór, zgodny z rodnikiem organicznym.
Widmo to powstaje, ponieważ wiązanie O-H BHT jest słabe. W obecności rodników powstających podczas autooksydacji, transfer wodoru z BHT wygasza mechanizm łańcucha rodnikowego i generuje stabilny rodnik skoncentrowany na tlenie.
Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego jest metodą analityczną, która jest często stosowana w chemii organicznej i nieorganicznej w celu uzyskania dodatkowych informacji, oprócz popularnych metod, takich jak spektroskopia NMR lub IR.
Na przykład EPR może być używany do badania systemów biologicznych, takich jak metabolizm sinic. Sinice są zawieszone w roztworze zawierającym rodnik trytylowy i umieszczane w sondzie obrazującej. Próbkę naświetla się światłem, a stężenie rodników mierzy się w odniesieniu do czasu.
Badanie to wykazało, że stężenie trytilu zmniejszyło się w świetle, ale pozostało stałe w ciemności, co pokazuje, że aktywność metaboliczna jest zależna od światła.
Cząsteczki z niesparowanymi elektronami mogą być trudne do scharakteryzowania tylko za pomocą NMR, dlatego spektroskopia EPR jest często używana do bardziej szczegółowej analizy rodników organicznych. Eksperymentalne widma EPR wyznaczają współczynnik g niesparowanego elektronu, dostarczając informacji o strukturze elektronowej centrum paramagnetycznego.
Ponadto spiny jądrowe jąder z niesparowanym elektronem, a także sąsiednich jąder, wpływają na moment magnetyczny elektronu, powodując dodatkowe rozszczepienie stanów spinowych i wiele linii w widmie EPR. Powstałe w ten sposób sprzężenie nadsubtelne i supernadsubtelne dostarcza dalszych informacji na temat struktury elektronowej cząsteczki
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Powinieneś być teraz zaznajomiony z zasadami EPR, autooksydacji, reakcji autooksydacji i różnymi zastosowaniami spektroskopii EPR. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are unpaired electrons and why do they matter in EPR spectroscopy?
Unpaired electrons are electrons with a spin quantum number of 1/2, existing in magnetic states of +1/2 or -1/2. EPR spectroscopy specifically targets molecules containing unpaired electrons by measuring electron spin transitions. These electrons are paramagnetic and respond to applied magnetic fields, making them detectable through EPR analysis.
Q2: How does the Zeeman effect influence EPR spectroscopy?
The Zeeman effect describes how an applied magnetic field causes electron spin states to become non-degenerate, creating an energy difference between them. In the absence of a magnetic field, the two spin states have equivalent energy. The magnitude of this energy difference depends on magnetic field strength, allowing EPR to measure electron transitions by sweeping frequency while holding the field constant.
Q3: What is the g-factor and what does it reveal about a paramagnetic molecule?
The g-factor is a dimensionless parameter that accounts for how the electric field gradient of a molecule influences the effective magnetic field experienced by an unpaired electron. During EPR experiments, the g-factor is calculated by sweeping frequency at constant magnetic field, providing information about the electronic structure of the paramagnetic center and its chemical environment.
Q4: How does autoxidation occur and why is it problematic?
Autoxidation is a radical chain process initiated by oxygen, a ground state triplet that reacts slowly with most organic molecules under normal conditions. Once initiated, autoxidation leads to rapid consumption of organic molecules and decomposition of materials like plastics. This undesired reaction highlights the importance of identifying effective antioxidants to inhibit radical chain processes.
Q5: How does BHT function as an antioxidant in aldehyde autoxidation?
Dibutylhydroxy toluene (BHT) inhibits autoxidation through hydrogen transfer from its weak O-H bond. When radicals are generated during autoxidation, BHT donates hydrogen to quench the radical chain mechanism, generating a stable oxygen-centered radical. EPR spectroscopy reveals this mechanism by detecting the characteristic four-lined pattern of the BHT-derived radical.
Q6: Why is EPR superior to NMR for studying organic radicals?
Molecules with unpaired electrons are challenging to characterize using NMR alone because NMR detects nuclear spins, not electron spins. EPR spectroscopy directly measures electron spin transitions and provides detailed information about paramagnetic species. Additionally, hyperfine and super-hyperfine coupling in EPR spectra reveal electronic structure details that NMR cannot access.
Q7: What applications does EPR spectroscopy have beyond studying antioxidants?
EPR is widely used in organic and inorganic chemistry to study biological systems, such as cyanobacteria metabolism. In these applications, trityl radicals suspended in solution serve as probes, and radical concentration is measured over time under different light conditions. This demonstrates that EPR can monitor metabolic activity and light-dependent processes in living organisms.