Biodystrybucja nośników nanoleków: zastosowania SEM

1. Wstrzykiwanie nanocząstek i grabież narządów

1. Wstrzyknij dożylnie nanocząsteczki znieczulonej myszy, aby umożliwić pasywne celowanie.
2. W pożądanych punktach czasowych, tj. 1, 4 i 8 tygodni po wstrzyknięciu, humanitarnie poddaj myszy eutanazji zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynaryjnych (AVMA).
3. Otwórz jamę ciała i chirurgicznie usuń interesujące Cię narządy. Umieść narządy w 10% buforowanej fosforanie formalinie w pojemniku polipropylenowym do czasu przygotowania próbki.

2. Przygotowanie próbki tkanki

1. Użyj kleszczy, aby przenieść tkankę myszy z utrwalacza do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Kołysz próbką przez 30 minut, wymieniając PBS co 10 minut.
2. Usuń chusteczkę i osusz chusteczką kimwipe. Następnie umieść go w plastikowej foremce zawierającej związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C.
3. Następnego dnia przenieś próbkę do kriostatu i ustaw temperaturę na -23 °C.
4. Oznacz szkiełka podstawowym typem narządu i rozmiarem nanocząstek, a następnie umieść je na półce w kriostacie.
5. Przykryj uchwyt kriostatu OCT i umieść próbkę na wierzchu. Opuść tłok ekstraktora nad próbkę i pozwól mu się zrównoważyć przez 3-5 minut.
6. Zamontuj uchwyt na uchwycie próbki i ustaw go tak, aby ostrze mogło ciąć prosto w poprzek zamrożonej próbki. Zbliż próbkę do ostrza, aby uzyskać zgrubne licowanie. Ustaw grubość na 30 μm i pokrój kilka sekcji, aż powstanie równomiernie pokrojony plasterek.
7. Przejdź do planowania dokładnego, zmniejszając grubość przekroju do 7-8 μm. Zbierz pokrojoną część, naciskając na nią oznakowane szklane szkiełko. Umieść dwa szkiełka na każdym szkiełku i przechowuj je w stojaku na slajdy. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
8. Po wyschnięciu próbki należy odwodnić, zanurzając stojak na szkiełka w 50% etanolu na 3 minuty w celu usunięcia OCT. Następnie przenieś stojak na 80% etanolu na 3 minuty przed umieszczeniem stojaka w stosunku 1:1 zimnego metanolu do acetonu na 10 minut w temperaturze -20 °C.
9. Wyjmij stojak na szkiełka i odcedź nadmiar rozpuszczalnika na ręczniku papierowym. Po 20–30 minutach umieścić szkiełka w pudełku na szkiełka i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu wykonania obrazowania.

3. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą SEM i EDS

1. Przygotuj próbkę zgodnie z opisem w "Obrazowanie SEM próbek biologicznych". Następnie załaduj próbkę do SEM.
2. Włącz SEM i dostosuj odległość roboczą do około 5 mm, a napięcie przyspieszające i prąd wiązki do 25 keV, co normalnie byłoby zbyt wysokie dla próbki biologicznej. Jednak próbka jest powlekana w celu zapewnienia przewodności i ochrony.
3. Rozpocznij obrazowanie i powiększ do około 1000-2000 powiększeń, aby zobaczyć struktury, które zawierałyby nanocząstki. Zauważ, że bez detekcji rozproszenia wstecznego (BSD) nie można ich rozróżnić poniżej pewnej głębokości.
4. Wstaw BSD pod tymi samymi parametrami i przesuń stolik w kierunku z na tę samą odległość roboczą co poprzednio.
5. Rozpocznij obrazowanie przy mniej więcej tym samym powiększeniu i sprawdź, czy jesteś w stanie zobaczyć wysoki kontrast w obecności nanocząstek. Zapisz obrazy.
6. Użyj różnych konfiguracji BSD (w których ładunki na detektorze są wyrównane), aby wybrać tę, która wykazuje najwyższy kontrast dla nanocząstek.
7. Powiększ obszar o wysokim kontraście przedstawiający nanocząstkę lub zlepek nanocząstek.
8. Otwórz kamerę 2^nd komory i obserwuj, jak wkładasz EDS do systemu, naciskając przycisk w dół na załączniku SEM. Gdy EDS znajdzie się blisko, ale nie dotyka BSD ani pistoletu, zwolnij przycisk.
9. Otwórz program Aztec na komputerze EDS (nadal na stacji roboczej) i pobierz obraz z SEM. Użyj metody "wyceluj i strzelaj", aby kliknąć na obszar o bardzo gęstym kontraście i nanocząsteczkach.
10. EDS pokaże widmo charakterystycznego promieniowania rentgenowskiego od tego punktu. Poszukaj zarówno pików baru, jak i tytanu, które mają zostać zidentyfikowane na wykresie. To potwierdza, że to, na co patrzysz, to rzeczywiście nanocząsteczki, a nie jakiekolwiek zanieczyszczenie.
11. Wróć do próbki i użyj oprogramowania Atlas, aby odwzorować granice narządu na szkiełku. Wybierz protokół "Organ" do stworzenia mozaikowego obrazu obszaru i pozwól mu działać (może to potrwać najwyżej kilka godzin).
12. Po utworzeniu i zszyciu obrazu kompozytowego przez oprogramowanie, wyeksportuj go jako plik TIF.
13. Otwórz plik Tif w ImageJ, oprogramowaniu typu open source, i dostosuj wartości progowe kontrastu, aby podświetlić obszary o bardzo wysokim kontraście (tj. nanocząsteczki). Użyj wbudowanych funkcji, aby określić ilościowo objętość nanocząstek przy użyciu rozmiaru piksela zdefiniowanego w protokole Organ (powinien wynosić około 100 nm).
14. Chociaż ta procedura odnosi się tylko do 1-tygodniowej próbki płuc myszy, procedura ta jest powtarzana z próbkami z innych tygodni i innych narządów w celu sporządzenia wykresu pokazującego dystrybucję.
15. Po obliczeniu biodystrybucji dla każdego narządu dla każdego tygodnia, wykresy biodystrybucji pokażą zmiany w biodystrybucji i stężeniu nanocząstek w ciągu 8 tygodni. Pokazują one szczytowe stężenie, a także dostarczają informacji o tym, ile czasu zajmuje usunięcie nanocząstek z narządu.