Obrazowanie SEM próbek biologicznych

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) jest często używana do obrazowania materiałów biologicznych w skali nano. Mikroskopy optyczne, które wykorzystują światło do obrazowania próbki, są intensywnie wykorzystywane do nieniszczącego obrazowania próbek biologicznych, jednak ich rozdzielczość i głębia ostrości są ograniczone, dlatego stosuje się SEM w celu osiągnięcia wyższej rozdzielczości do jednego nanometra.

W SEM wiązka elektronów jest skupiana przez szereg soczewek kondensatora, które następnie uderzają w próbkę. Kiedy wiązka uderza w próbkę, elektrony na powierzchni są rozpraszane i mierzone przez detektor.

W tym filmie omówimy, jak działa SEM, pokażemy, jak obrazować próbkę biologiczną w laboratorium, a na koniec przedstawimy niektóre techniki stosowane do obrazowania wrażliwych próbek.

Skaningowy mikroskop elektronowy wykorzystuje wiązkę elektronów o wysokiej energii, która jest generowana przez działo elektronowe wyposażone w katodę żarnika. Wygenerowane elektrony są kierowane w kierunku anody, a następnie skupiane za pomocą soczewek kondensatora przed wejściem do soczewki obiektywu. Soczewka obiektywu jest skalibrowana tak, aby skupiała wiązkę na próbce, gdzie jest skanowana raster na powierzchni. Oddziaływania elektronów z atomami w próbce są wykorzystywane do badania topografii, składu pierwiastkowego i krystaliczności próbki. Kiedy padająca wiązka elektronów uderza w powierzchnię, emituje elektrony wtórne i rozproszone wstecznie. Elektrony wtórne to elektrony o niskiej energii, które są emitowane z próbki blisko powierzchni i dostarczają informacji topograficznych.

Z drugiej strony elektrony rozproszone wstecznie odbijają się w kierunku przeciwnym do padającej wiązki. Intensywność oddziaływania wzrasta wraz ze wzrostem masy atomowej, umożliwiając użytkownikowi rozróżnienie różnic kompozycyjnych. Szczególną uwagę należy zwrócić na obrazowanie próbek biologicznych za pomocą SEM, ponieważ SEM wykorzystuje wysoką próżnię, dlatego próbki biologiczne, które zwykle mają wysoką zawartość wody, muszą być najpierw wysuszone. Może to spowodować zapadnięcie się struktury wrażliwych próbek, zwłaszcza komórek. W ten sposób komórki są traktowane utrwalaczem, płukane, a następnie powoli odwadniane poprzez przemywanie zwiększającymi się ilościami etanolu.

W przypadku sztywnych materiałów biologicznych, takich jak rusztowanie tkankowe kolagenowo-hydroksyapatytowe użyte w tej demonstracji, próbka jest suszona przez kilka dni w wysokiej próżni.

Wreszcie, ponieważ typowe obrazowanie SEM wymaga powierzchni przewodzącej, próbki biologiczne są często napylane cienką warstwą metalu przed obrazowaniem. Teraz, gdy omówiliśmy, jak działa SEM i jak przygotować próbkę biologiczną do obrazowania, przyjrzyjmy się, jak przygotować i zobrazować rusztowanie tkankowe kolagenowo-hydroksyapatytowe.

Najpierw zamontuj próbkę biomateriału na króćcu SEM za pomocą przewodzącej taśmy węglowej i upewnij się, że próbka jest sucha i nie ma zanieczyszczeń na powierzchni.

Następnie umieść zamontowaną próbkę w komorze napylarki, przepompuj w dół komory i napylaj próbkę przez około 40 sekund, aby uzyskać cienką powłokę metalu o grubości od czterech do sześciu nanometrów, w tym przypadku złota, o odpowiednim pokryciu. Po pokryciu usuń próbkę i użyj taśmy przewodzącej, aby połączyć króciec z górną częścią próbki, która jest teraz pokryta przewodzącym metalem.

Na koniec zamontuj króciec na stoliku SEM i dokręć śrubę z boku. Teraz próbka jest gotowa do obrazowania za pomocą SEM. Najpierw załaduj stolik do komory SEM i uszczelnij drzwi, a następnie naciśnij przycisk przenoszenia, aby otworzyć przejście z komory załadowczej do próżni. Po otwarciu drzwi wewnętrznych wkręć metalowy pręt w stolik i wepchnij próbkę do komory próżniowej, a następnie odkręć metalowy pręt i całkowicie wsuń go do komory załadunkowej, a następnie naciśnij magazyn, aby zamknąć komorę próżniową.

Teraz zobrazujmy próbkę za pomocą SEM.

Najpierw przesuń stolik za pomocą kontrolera i nawiguj próbkę w polu widzenia, a następnie przesuń próbkę w pionie, aż odległość robocza wyniesie od pięciu do 10 milimetrów. Włącz wiązkę elektronów i wybierz detektor elektronów wtórnych, początkowo ustaw wiązkę na pięć kiloelektronowoltów, a następnie zwiększ do 20 do 30 kiloelektronowoltów w razie potrzeby. Jeśli obraz nie jest wyraźny, obracaj pokrętłami ostrości, jasności i kontrastu, aż pojawi się wyraźny obraz.

Użyj nawigacji na stole montażowym oraz wskazówek X i Y, aby zlokalizować nowe miejsce na próbce, a następnie zwiększaj powiększenie, aż pożądane cechy będą widoczne. Dostosuj ostrość, kontrast i jasność zgodnie z potrzebami, aby poprawić jakość obrazu. Może być konieczne zmniejszenie szybkości skanowania i włączenie uśredniania liniowego w celu uzyskania lepszego obrazu, a następnie zapisanie obrazu.

Obrazy SEM ukazują wysoce trójwymiarową i porowatą strukturę o elementach włóknistych mniejszych niż 25 mikronów. Cechy te byłyby trudne do uwidocznienia za pomocą mikroskopii optycznej, ponieważ mikroskopia optyczna ma znacznie mniejszą głębię ostrości.

Istnieje wiele wyzwań związanych z obrazowaniem struktur biologicznych za pomocą SEM, w tym zapadanie się struktury lub uszkodzenie przez wiązkę elektronów o wysokiej energii. Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób ogólna technika SEM jest stosowana do tego typu wrażliwych próbek. Delikatne struktury biologiczne, takie jak młode tkanki roślinne lub te o dużej zawartości wody, muszą być poddane procesowi utrwalania przed obrazowaniem.

Te merystemy kwiatowe zostały natychmiast potraktowane świeżo przygotowanym roztworem utrwalającym formalinę/kwas octowy. Utrwalona tkanka została wycięta w etanolu, umieszczona w siatkowym pojemniku i odwodniona za pomocą serii etanolu 70%, 80%, 90% i 100% etanolu. Na koniec tkanki roślinne wysuszono za pomocą suszarki w punkcie krytycznym, zamontowano i napylono cienką metalową powłoką.

Po obrazowaniu SEM jasne jest, że nieobrobione struktury zostały poważnie uszkodzone w procesie suszenia i wykazały znaczne zapadnięcie się struktury, podczas gdy te, które zostały utrwalone, zachowały swoją naturalną strukturę. Alternatywnie, komórki i inne próbki o wysokiej zawartości wody mogą być obrazowane za pomocą środowiskowego SEM lub ESEM. ESEM wykorzystuje wiązkę elektronów o wysokiej energii, która jest skanowana rastrowo nad próbką, podobnie jak w przypadku konwencjonalnego SEM, jednak umożliwia obrazowanie próbek mokrych lub niepowlekanych poprzez utrzymanie środowiska gazowego w komorze.

Odbywa się to poprzez oddzielenie komory wysokiej próżni zawierającej działo elektronowe od komory na próbki za pomocą dwóch otworów. Wiązka elektronów ponosi znaczne straty z powodu rozpraszania przez cząsteczki gazu, ale zazwyczaj jest wystarczająco wysoką energią do obrazowania. W tym przypadku komórki hodowano na chipie krzemowym, funkcjonalizowano kropkami kwantowymi i utrwalano za pomocą protokołu utrwalania aldehydu glutarowego. Komórki zostały zobrazowane w wodzie i pokazują niezapadniętą strukturę komórki z pojedynczymi kropkami kwantowymi widocznymi na powierzchni komórki.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do wizualizacji biomateriałów za pomocą SEM. Powinieneś teraz zrozumieć, jak działa SEM, jak próbki biologiczne są przygotowywane i obrazowane, a także jakie są zastosowania tej techniki dla wrażliwych struktur.

Dzięki za oglądanie!