Question 1

Dlaczego SEM jest lepszy od mikroskopii optycznej w obrazowaniu próbek biologicznych?

Accepted Answer

SEM osiąga rozdzielczość do 0,5 nanometra, w porównaniu z limitem 200 nanometrów w mikroskopii optycznej. Ta wyższa rozdzielczość wynika z faktu, że wiązka elektronów ma długość fali wynoszącą 1 nanometr, podczas gdy światło widzialne ma długość fali około 500 nanometrów. SEM zapewnia również większą głębię ostrości, co czyni go idealnym narzędziem do wizualizacji trójwymiarowych struktur biologicznych oraz nanostruktur, których mikroskopy optyczne nie są w stanie wyraźnie rozdzielić.

Question 2

Co dzieje się, gdy wiązka elektronów uderza w próbkę biologiczną w SEM?

Accepted Answer

Wiązka elektronów powoduje dwa rodzaje emisji elektronów: emisję elektronów wtórnych oraz elektronów wstecznie rozproszonych. Elektrony wtórne to elektrony o niskiej energii emitowane z powierzchni próbki, które dostarczają informacji topograficznych o strukturze. Elektrony wstecznie rozproszone odbijają się w kierunku przeciwnym do wiązki padającej, a ich intensywność rośnie wraz z masą atomową, co umożliwia analizę składu oraz rozróżnianie różnic materiałowych.

Question 3

Dlaczego próbki biologiczne muszą zostać wysuszone przed obrazowaniem za pomocą SEM?

Accepted Answer

SEM pracuje w środowisku wysokiej próżni, co jest niezgodne z wysoką zawartością wody w próbkach biologicznych. Woda szybko odparowuje w próżni, co powoduje zapadanie się struktur próbki, szczególnie w przypadku delikatnych komórek. Próbki są poddawane działaniu utrwalaczy, płukane, a następnie powoli odwadniane przy użyciu rosnących stężeń etanolu, aby zachować natywną strukturę podczas usuwania wody.

Question 4

Czym jest napylanie i dlaczego jest ono niezbędne w obrazowaniu SEM?

Accepted Answer

Napylanie warstwy metalicznej pozwala na osadzenie na próbkach biologicznych cienkiej warstwy metalu, zazwyczaj złota o grubości od czterech do sześciu nanometrów. Ponieważ materiały biologiczne są nieprzewodzące, metalowa powłoka zapobiega akumulacji ładunku wywołanego przez wiązkę elektronów, co mogłoby zniekształcić obrazy. Przewodząca powierzchnia umożliwia dokładną detekcję elektronów i poprawia jakość obrazu podczas analizy SEM.

Question 5

Czym różni się skaningowa mikroskopia elektronowa w warunkach środowiskowych (environmental SEM) od konwencjonalnej mikroskopii SEM w obrazowaniu próbek wrażliwych?

Accepted Answer

Skaningowy mikroskop elektronowy z funkcją środowiskową (ESEM) utrzymuje środowisko gazowe w komorze z preparatem, co umożliwia obrazowanie mokrych lub niepowlekanych próbek bez konieczności ich suszenia. Dwie przysłony oddzielają komorę działa elektronowego o wysokiej próżni od komory z preparatem. Mimo że cząsteczki gazu rozpraszają wiązkę elektronów, energia wiązki pozostaje wystarczająca do obrazowania, co pozwala zachować niezapadnięte struktury komórkowe i umożliwia wizualizację uwodnionych próbek biologicznych.

Question 6

Jakie etapy przygotowania są krytyczne dla obrazowania delikatnych struktur biologicznych, takich jak tkanki roślinne?

Accepted Answer

Delikatne tkanki wymagają fiksacji za pomocą roztworów takich jak formalina/kwas octowy w celu stabilizacji struktury. Następnie tkanki są preparowane w etanolu, umieszczane w pojemnikach z siatką i odwadniane w serii stężeń etanolu: 70%, 80%, 90% i 100%. Na koniec, poprzez suszenie w punkcie krytycznym, usuwa się pozostały rozpuszczalnik bez powodowania zapadnięcia się struktury, a następnie przeprowadza się napylanie metalem przed obrazowaniem za pomocą SEM.

Question 7

Jakie informacje na temat materiałów biologicznych może ujawnić SEM, których nie są w stanie dostarczyć inne techniki?

Accepted Answer

SEM ujawnia trójwymiarowe, porowate struktury z cechami włóknistymi mniejszymi niż 25 mikronów, które są trudne do wizualizacji podczas obrazowania próbek biologicznych za pomocą mikroskopii optycznej i konfokalnej ze względu na ograniczoną głębię ostrości. SEM zapewnia również szczegółowe informacje topograficzne, dane o składzie pierwiastkowym oraz stopniu krystaliczności dzięki analizie elektronów wtórnych i wstecznie rozproszonych, co umożliwia kompleksową charakterystykę nanostruktur i mikrostruktur.

Obrazowanie SEM próbek biologicznych - Quiz oceniający