Cytometria przepływowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS): izolacja limfocytów B śledziony

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparacji, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie dokładnie wysusz.
3. Przygotuj 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Korzystając z systemu dostarczania dwutlenku węgla, poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zabezpiecz uśpioną mysz na płytce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię podłużną za pomocą nożyczek i kleszczy.
2. Za pomocą kleszczy przesuń jelita i żołądek po prawej stronie brzucha, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka.
3. Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek odpornościowych

1. Umieść śledzionę w sitku do komórek o średnicy 40 μm na tej samej szalce Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby oddzielić ją w tym samym naczyniu.
2. Przenieś zdysocjowaną śledzionę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i odrzucić supernatant, unikając osadu.
4. Zawiesić osad w 2 ml octanu potasu, aby zlizować erytrocyty. Odczekaj 2 minuty, a następnie uzupełnij objętość do 15 ml za pomocą HBSS 2% FCS.
5. Ponownie odwirować probówkę przy 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS.
6. Policz komórki za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do 10⁷ komórek/ml, używając odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Barwienie komórek

1. Przenieś 200 μl zawiesiny komórek do sześciu probówek FACS, oznaczonych od 1 do 6.
2. Odwirować probówki o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i odrzucić supernatant omijając osad.
3. Następnie należy przygotować sześć nowych mieszanek przeciwciał, dodając odpowiednią ilość przeciwciała do 200 μl HBSS 2% FCS zgodnie z tabelą 1.
4. Następnie przenieś te mieszaniny przeciwciał do odpowiednich ponumerowanych probówek FACS.
5. Zawiesiny komórkowe zmieszane z przeciwciałami inkubować przez 20 minut na lodzie w ciemności.
6. Dodaj 1 ml HBSS 2% FCS do każdej probówki, a następnie ponownie odwiruj w temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 10°C.
7. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 200 μl HBSS 2% FCS.
8. Przenieś zawieszone granulki do nowych probówek FACS.

Tabela 1: Skład mieszanki przeciwciał. Na potrzeby eksperymentu przygotowano sześć mieszanek po 200 μl przeciwciała HBSS +. Mix 1 służy do ustawiania PMT, miksy od 2 do 5 służą do ustawień kompensacji, a mix 6 służy do sortowania komórek.

5. Kalibracja FACS

1. Najpierw włącz sorter i wykonaj polecenie "Fluidics Startup."
2. Włącz strumień, a następnie poczekaj 15 minut, aż strumień się ustabilizuje.
3. Dostosuj amplitudę strumienia, aby uzyskać odłączoną kroplę. Następnie kliknij "Sweet Spot", aby zakończyć regulację amplitudy.
4. Umieść filtr o neutralnej gęstości (ND) - 1.0 i otwórz interfejs "CST", który oznacza konfigurację i śledzenie cytometru.
5. Aby przeprowadzić codzienną kontrolę jakości, najpierw rozcieńczyć kulki CST pożywką FACS zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przeprowadzić kontrolę CST.
6. Po zakończeniu kontroli CST wymień filtr ND 1.0 na filtr ND 2.0 na cytometrze.
7. Następnie rozcieńczyć kulki opóźniające kroplę w podłożu FACS zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie załadować do FACS.
8. Aby zapewnić prawidłowe sortowanie, wykonaj Opóźnienie upuszczania-
   1. Najpierw kliknij "Napięcie", a następnie "Filtr optyczny". Prawy kwadrant powinien być równy 100%. W razie potrzeby wyreguluj czerwoną śrubę laserową na cytometrze w lewo lub w prawo, aby uzyskać 100% w prawej ćwiartce.
   2. Następnie wykonaj sortowanie testowe, aby upewnić się, że strumień wpada do probówki zbiorczej. Aby to zrobić, kliknij na "Szuflada na odpady" i uruchom "Test sortowania". Sprawdź, czy strumienie boczne wpadają do probówek zbiorczych. Jeśli tak się nie stanie, dostosuj napięcie, aż to zrobią.
   3. Przejdź do szablonu eksperymentalnego. Następnie otwórz eksperyment "Accudrop Delay " i kliknij "Sorting Layout".
   4. Zmień natężenie przepływu, aby uzyskać od 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.
   5. Kliknij "Napięcie", a następnie "Filtr optyczny". Lewy kwadrant powinien być równy 0, a prawy kwadrant równy 100.
   6. W oknie "Sort Layout" kliknij na "Sort", a następnie kliknij "Cancel". Lewy kwadrant powinien być równy 100, a prawy kwadrant równy 0. Jeśli lewy ćwiartka jest mniejsza niż 95, kliknij "Auto Delay", aby automatycznie go dostosować.

6. Cytometria przepływowa i kontrola czystości

1. Rozpocznij cytometrię przepływową, zaczynając od probówki 1 (niebarwione komórki), aby określić morfologię komórki i ujemne piki fluorochromów. Ustaw rozproszenie do przodu i z boku oraz zdefiniuj napięcia każdego parametru fluorescencyjnego. Umieść ujemną populację w pierwszej dekadzie, używając siatek na każdym wykresie kropkowym.
2. Następnie załaduj probówkę 2 (kontrola pojedynczego koloru) do cytometru. Dostosuj nakładanie się widma, aż ujemna i dodatnia mediana populacji zostaną wyrównane lub użyj oprogramowania do obliczeń automatycznych. Ważne jest, aby sygnał był na odpowiedniej skali. Kontrole kompensacyjne muszą być zgodne z eksperymentalnymi ustawieniami fluorochromów i detektorów. Rekord 10 000 wydarzeń.
3. Powtórz te kroki z rurami 3, 4 i 5 (inne kontrolki pojedynczego koloru).
4. Następnie załaduj rurkę 6 (komórki barwione wielokrotnie) i zdefiniuj interesujące populacje komórek, stosując określoną strategię bramkowania.
5. W oknie Układ sortowania wybierz interesującą nas populację komórek. Wybierz próg komórki w polu "Zdarzenia docelowe" i poziom dokładności w polu "Precision". W tym przypadku sortowana jest tylko jedna populacja, jednak cztery różne populacje mogą być sortowane w tym samym czasie.
6. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij "Sort" i "OK", a następnie poczekaj na sortowanie komórek.
7. Po zakończeniu sortowania komórek należy przeprowadzić kontrolę czystości, najpierw pipetując 10 μl posortowanych komórek do nowej probówki FACS z 90 mikrolitrami HBSS 2% FCS.
8. Następnie załaduj rurkę cytometru. Zapisz i przeanalizuj fenotypy komórek, aby sprawdzić, czy strategia bramkowania zadziałała zgodnie z przeznaczeniem.

7. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie 'FlowJo' i przeciągnij pliki dla każdej probówki w oknie "All sample".
2. Kliknij dwukrotnie plik, aby otworzyć go w nowym oknie.
3. Kliknij na "Polygon" i odtwórz wcześniej używaną strategię bramkowania.
4. Powtórz te kroki ze wszystkimi innymi plikami.
5. Aby wyświetlić wykresy punktowe, kliknij na "Edytor układu" i przeciągnij interesujące populacje z rury 6 i kontroli czystości w zakładce edytora układu. Komórki powinny pojawiać się tylko w populacji będącej przedmiotem zainteresowania w kontroli czystości (patrz Rysunek 2).
6. Aby sprawdzić czystość limfocytów B w posortowanych komórkach, kliknij na "Edytor tabel". Przeciągnij populację limfocytów B z probówki 6 i kontroli czystości w tabeli.
7. W menu "Statistic" wybierz częstotliwość komórek CD45⁺, aby przetestować czystość tej populacji komórek, a następnie kliknij "Utwórz tabelę".
8. Wartości parametrów pojawią się w nowej tabeli. W oknie kontroli czystości sprawdź częstość limfocytów B w komórkach CD45⁺, która powinna być wyższa niż 98% (patrz rysunek 2, dolny panel).