5.1: Cytometria przepływowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS): izolacja limfocytów B śledziony

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparacji, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie dokładnie wysusz.
3. Przygotuj 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Korzystając z systemu dostarczania dwutlenku węgla, poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zabezpiecz uśpioną mysz na płytce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię podłużną za pomocą nożyczek i kleszczy.
2. Za pomocą kleszczy przesuń jelita i żołądek po prawej stronie brzucha, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka.
3. Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek odpornościowych

1. Umieść śledzionę w sitku do komórek o średnicy 40 μm na tej samej szalce Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby oddzielić ją w tym samym naczyniu.
2. Przenieś zdysocjowaną śledzionę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i odrzucić supernatant, unikając osadu.
4. Zawiesić osad w 2 ml octanu potasu, aby zlizować erytrocyty. Odczekaj 2 minuty, a następnie uzupełnij objętość do 15 ml za pomocą HBSS 2% FCS.
5. Ponownie odwirować probówkę przy 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS.
6. Policz komórki za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do 10⁷ komórek/ml, używając odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Barwienie komórek

1. Przenieś 200 μl zawiesiny komórek do sześciu probówek FACS, oznaczonych od 1 do 6.
2. Odwirować probówki o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i odrzucić supernatant omijając osad.
3. Następnie należy przygotować sześć nowych mieszanek przeciwciał, dodając odpowiednią ilość przeciwciała do 200 μl HBSS 2% FCS zgodnie z tabelą 1.
4. Następnie przenieś te mieszaniny przeciwciał do odpowiednich ponumerowanych probówek FACS.
5. Zawiesiny komórkowe zmieszane z przeciwciałami inkubować przez 20 minut na lodzie w ciemności.
6. Dodaj 1 ml HBSS 2% FCS do każdej probówki, a następnie ponownie odwiruj w temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 10°C.
7. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 200 μl HBSS 2% FCS.
8. Przenieś zawieszone granulki do nowych probówek FACS.

Tabela 1: Skład mieszanki przeciwciał. Na potrzeby eksperymentu przygotowano sześć mieszanek po 200 μl przeciwciała HBSS +. Mix 1 służy do ustawiania PMT, miksy od 2 do 5 służą do ustawień kompensacji, a mix 6 służy do sortowania komórek.

5. Kalibracja FACS

1. Najpierw włącz sorter i wykonaj polecenie "Fluidics Startup."
2. Włącz strumień, a następnie poczekaj 15 minut, aż strumień się ustabilizuje.
3. Dostosuj amplitudę strumienia, aby uzyskać odłączoną kroplę. Następnie kliknij "Sweet Spot", aby zakończyć regulację amplitudy.
4. Umieść filtr o neutralnej gęstości (ND) - 1.0 i otwórz interfejs "CST", który oznacza konfigurację i śledzenie cytometru.
5. Aby przeprowadzić codzienną kontrolę jakości, najpierw rozcieńczyć kulki CST pożywką FACS zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przeprowadzić kontrolę CST.
6. Po zakończeniu kontroli CST wymień filtr ND 1.0 na filtr ND 2.0 na cytometrze.
7. Następnie rozcieńczyć kulki opóźniające kroplę w podłożu FACS zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie załadować do FACS.
8. Aby zapewnić prawidłowe sortowanie, wykonaj Opóźnienie upuszczania-
   1. Najpierw kliknij "Napięcie", a następnie "Filtr optyczny". Prawy kwadrant powinien być równy 100%. W razie potrzeby wyreguluj czerwoną śrubę laserową na cytometrze w lewo lub w prawo, aby uzyskać 100% w prawej ćwiartce.
   2. Następnie wykonaj sortowanie testowe, aby upewnić się, że strumień wpada do probówki zbiorczej. Aby to zrobić, kliknij na "Szuflada na odpady" i uruchom "Test sortowania". Sprawdź, czy strumienie boczne wpadają do probówek zbiorczych. Jeśli tak się nie stanie, dostosuj napięcie, aż to zrobią.
   3. Przejdź do szablonu eksperymentalnego. Następnie otwórz eksperyment "Accudrop Delay " i kliknij "Sorting Layout".
   4. Zmień natężenie przepływu, aby uzyskać od 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.
   5. Kliknij "Napięcie", a następnie "Filtr optyczny". Lewy kwadrant powinien być równy 0, a prawy kwadrant równy 100.
   6. W oknie "Sort Layout" kliknij na "Sort", a następnie kliknij "Cancel". Lewy kwadrant powinien być równy 100, a prawy kwadrant równy 0. Jeśli lewy ćwiartka jest mniejsza niż 95, kliknij "Auto Delay", aby automatycznie go dostosować.

6. Cytometria przepływowa i kontrola czystości

1. Rozpocznij cytometrię przepływową, zaczynając od probówki 1 (niebarwione komórki), aby określić morfologię komórki i ujemne piki fluorochromów. Ustaw rozproszenie do przodu i z boku oraz zdefiniuj napięcia każdego parametru fluorescencyjnego. Umieść ujemną populację w pierwszej dekadzie, używając siatek na każdym wykresie kropkowym.
2. Następnie załaduj probówkę 2 (kontrola pojedynczego koloru) do cytometru. Dostosuj nakładanie się widma, aż ujemna i dodatnia mediana populacji zostaną wyrównane lub użyj oprogramowania do obliczeń automatycznych. Ważne jest, aby sygnał był na odpowiedniej skali. Kontrole kompensacyjne muszą być zgodne z eksperymentalnymi ustawieniami fluorochromów i detektorów. Rekord 10 000 wydarzeń.
3. Powtórz te kroki z rurami 3, 4 i 5 (inne kontrolki pojedynczego koloru).
4. Następnie załaduj rurkę 6 (komórki barwione wielokrotnie) i zdefiniuj interesujące populacje komórek, stosując określoną strategię bramkowania.
5. W oknie Układ sortowania wybierz interesującą nas populację komórek. Wybierz próg komórki w polu "Zdarzenia docelowe" i poziom dokładności w polu "Precision". W tym przypadku sortowana jest tylko jedna populacja, jednak cztery różne populacje mogą być sortowane w tym samym czasie.
6. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij "Sort" i "OK", a następnie poczekaj na sortowanie komórek.
7. Po zakończeniu sortowania komórek należy przeprowadzić kontrolę czystości, najpierw pipetując 10 μl posortowanych komórek do nowej probówki FACS z 90 mikrolitrami HBSS 2% FCS.
8. Następnie załaduj rurkę cytometru. Zapisz i przeanalizuj fenotypy komórek, aby sprawdzić, czy strategia bramkowania zadziałała zgodnie z przeznaczeniem.

7. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie 'FlowJo' i przeciągnij pliki dla każdej probówki w oknie "All sample".
2. Kliknij dwukrotnie plik, aby otworzyć go w nowym oknie.
3. Kliknij na "Polygon" i odtwórz wcześniej używaną strategię bramkowania.
4. Powtórz te kroki ze wszystkimi innymi plikami.
5. Aby wyświetlić wykresy punktowe, kliknij na "Edytor układu" i przeciągnij interesujące populacje z rury 6 i kontroli czystości w zakładce edytora układu. Komórki powinny pojawiać się tylko w populacji będącej przedmiotem zainteresowania w kontroli czystości (patrz Rysunek 2).
6. Aby sprawdzić czystość limfocytów B w posortowanych komórkach, kliknij na "Edytor tabel". Przeciągnij populację limfocytów B z probówki 6 i kontroli czystości w tabeli.
7. W menu "Statistic" wybierz częstotliwość komórek CD45⁺, aby przetestować czystość tej populacji komórek, a następnie kliknij "Utwórz tabelę".
8. Wartości parametrów pojawią się w nowej tabeli. W oknie kontroli czystości sprawdź częstość limfocytów B w komórkach CD45⁺, która powinna być wyższa niż 98% (patrz rysunek 2, dolny panel).

Układ odpornościowy chroni organizm przed inwazją patogenów poprzez wytwarzanie leukocytów, zwanych również białymi krwinkami. Kiedy patogen skutecznie infekuje organizm, aktywowane są różne leukocyty, a ta skoordynowana reakcja nazywana jest odpowiedzią immunologiczną.

Często jest to przydatne dla badaczy, aby móc zidentyfikować konkretny typ i liczbę komórek odpornościowych, które zostały aktywowane w odpowiedzi na patogen. Cytometria przepływowa to technika, która pozwala naukowcom rozdzielać komórki na podstawie określonych epitopów wyrażanych na ich powierzchni. Osiąga się to za pomocą znakowanych fluorochromem przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się ze znanymi epitopami specyficznymi dla komórek odpornościowych, a po wzbudzeniu te związane fluorochromy emitują długość fali światła, którą można wykryć i ocenić za pomocą cytometru przepływowego.

Cytometry przepływowe składają się z trzech systemów. Układ fluidyczny transportuje komórki w strumieniu tak, że przechodzą one przed laserem jedna po drugiej. Układ optyczny składa się z laserów i detektorów, które rozpoznają obecność lub brak fluoroforów. Na koniec system elektroniczny przekształca zebrane dane optyczne w pliki elektroniczne do analizy.

Rozszerzeniem cytometrii przepływowej jest sorter komórek aktywowany fluorescencją (FACS), który pozwala na wzbogacenie określonych populacji komórek, dzięki czemu można je badać niezależnie. Sortowanie komórek odbywa się za pomocą dyszy wibracyjnej w strumieniu fluidyki, która tworzy mikrokropelki, z których każda zawiera pojedynczą komórkę. Następnie detektor określa, czy z każdej kropli emitowane jest światło fluorescencyjne, i na podstawie tych informacji elektromagnes nadaje każdej komórce ładunek ujemny lub dodatni. Następnie silne pole elektryczne sortuje różnie naładowane kropelki do oddzielnych pojemników. Docelowo jeden z pojemników będzie zawierał jednorodną populację komórek opartą na ekspresji określonej cząsteczki na powierzchni komórki.

W tym filmie dowiesz się, jak używać cytometrii przepływowej do izolowania leukocytów z tkanki śledziony myszy i FACS do selekcji limfocytów B.

Na początek załóż rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną. Następnie umyj nożyczki i kleszcze preparacyjne najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie osusz je czystym ręcznikiem papierowym.

Następnie dodaj 49 mililitrów Hank's Balanced Salt Solution lub HBSS do 50-mililitrowej probówki. Dodaj jeden mililitr płodowej surowicy cielęcej lub FCS, aby utworzyć 2% roztwór HBSS FCS i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę iw dół około 10 razy.

Następnie umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej na płycie sekcyjnej. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj laparotomię podłużną, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Użyj kleszczy, aby przesunąć jelita po prawej stronie brzucha na jedną stronę, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka. Następnie za pomocą pipety umieść pięć mililitrów HBSS 2% FCS na szalce Petriego. Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść śledzionę na szalce Petriego.

Aby wyizolować komórki odpornościowe, najpierw umieść śledzionę na sitku do komórek o grubości 40 mikronów na szalce Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby oddzielić ją od naczynia. Następnie pipetować zdysocjowaną śledzionę i płyn z szalki Petriego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę pod ciśnieniem 370 razy g przez siedem minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza, a następnie ostrożnie wyjąć probówkę, aby nie naruszyć osadu.

Teraz usuń supernatant, unikając osadu, i wyrzuć płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady. Następnie dodaj dwa mililitry buforu lizującego ACK do probówki wirówkowej w celu ponownego zawieszenia i lizy erytrocytów. Odczekaj dwie minuty, a następnie dodaj HBSS 2% FCS, aby uzyskać całkowitą objętość 15 mililitrów. Powtórzyć wirowanie. Ostrożnie wyjąć probówkę i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulat w pięciu mililitrach HBSS 2% FCS.

Aby policzyć zawieszone komórki, rozcieńczyć pięć mikrolitrów zawiesiny komórek pięcioma mikrolitrami błękitu trypanowego. Następnie delikatnie umieść pięciomikrolitrową kroplę tej rozcieńczonej zawiesiny komórkowej między szkłem nakrywkowym a szkiełkiem Malasseza. Teraz, pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu, policz liczbę obecnych komórek. Następnie dostosuj stężenie komórek do 10 do siódmych komórek na mililitr, dodając odpowiednią objętość HBSS 2% FCS.

Aby zabarwić komórki odpornościowe, zacznij od oznaczenia sześciu probówek FACS od jednej do sześciu. Następnie przenieś 200 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdej z sześciu probówek. Odwirować te probówki w temperaturze 370 razy g przez siedem minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza i usunąć supernatant.

Następnie oznacz sześć nowych probówek FACS jako od jednej do sześciu i odpipetuj 200 mikrolitrów HBSS 2% FCS do każdej. Przygotować sześć nowych mieszanin przeciwciał, dodając odpowiednią ilość przeciwciał do każdej probówki zgodnie z tabelą pierwszą. Mieszanka pierwsza jest przeznaczona dla niebarwionych komórek bez dodatku przeciwciał. Mieszaniny od dwóch do pięciu zawierają różne pojedyncze przeciwciała do ustawień kompensacji. Mix six zawiera wszystkie cztery przeciwciała dla komórek barwionych wielobarwnie, które mają być użyte do sortowania.

Następnie przenieś te mieszaniny przeciwciał do odpowiednich ponumerowanych probówek FACS. Inkubować te roztwory przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie w ciemności. Następnie dodaj jeden mililitr HBSS 2% FCS do każdej probówki, a następnie ponownie odwiruj. Wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach HBSS 2% FCS. Na koniec przenieś zawieszone granulki do nowych oznaczonych probówek FACS.

Aby wykonać FACS, najpierw włącz sorter. Następnie wybierz menu cytometru i kliknij uruchamianie fluidics. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

Na karcie strumienia kliknij czerwony krzyżyk, aby włączyć transmisję, a następnie poczekaj 15 minut, aż strumień się ustabilizuje. Dostosuj amplitudę strumienia, aż na karcie strumienia pojawi się wyraźny, odłączony spadek. Następnie kliknij słodki punkt, aby zakończyć regulację amplitudy. Umieść filtr o neutralnej gęstości (ND) 1.0 przed laserem.

Otwórz menu cytometru u góry ekranu i wybierz CST, co oznacza konfigurację i śledzenie cytometru. Aby przeprowadzić codzienną kontrolę jakości, najpierw rozcieńczyć kulki CST medium FACS w probówce FACS zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie załaduj probówkę do maszyny i wykonaj kontrolę CST, klikając uruchom na karcie CST.

Po zakończeniu kontroli CST wymień filtr ND 1.0 na filtr ND 2.0 na cytometrze. Następnie rozcieńczyć kulki opóźniające kroplę w podłożu FACS zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie załadować rurkę do FACS. Aby zapewnić prawidłowe sortowanie, wykonaj opóźnienie upuszczania, klikając najpierw napięcie, a następnie filtr optyczny. Prawy kwadrant filtra optycznego powinien być równy 100%, co oznacza, że 100% kropli jest rejestrowanych przez maszynę. W razie potrzeby wyreguluj czerwoną śrubę laserową na cytometrze w lewo lub w prawo, aby uzyskać 100% w prawej ćwiartce. Ważne jest, aby upewnić się, że strumień wpada do rurki zbiorczej. W tym celu należy przeprowadzić sortowanie testowe, klikając szufladę na odpady, a następnie sortować testowo. Sprawdź, czy strumienie boczne wpadają do probówek zbiorczych. Jeśli tak się nie stanie, dostosuj napięcie na karcie sortowania, aż to zrobią.

Przejdź do szablonu eksperymentalnego, wybierając kartę przeglądarki i klikając widok współdzielony. Następnie otwórz eksperyment Accudrop_DROP DELAY i kliknij przycisk sortowania układu. Teraz zmień szybkość progową na pulpicie nawigacyjnym pozyskiwania, manipulując natężeniem przepływu, aż osiągnie 3 000 zdarzeń na sekundę. Kliknij pozycję napięcie, a następnie kliknij pozycję filtr optyczny. Lewy kwadrant powinien być równy zero, a prawy kwadrant równy 100.

Na koniec w oknie układu sortowania kliknij przycisk sortuj, a następnie kliknij przycisk Anuluj. Lewy kwadrant powinien być równy 100, a prawy kwadrant równy zero. Jeśli lewy kwadrant jest mniejszy niż 95, kliknij automatyczne opóźnienie, aby poinstruować oprogramowanie, aby automatycznie zwiększało napięcie, aby uzyskać 100% spadków w lewym kwadrancie.

Aby rozpocząć cytometrię przepływową, najpierw użyjemy niebarwionych komórek do zdefiniowania morfologii komórek i ujemnych pików fluorochromów. W tym celu należy umieścić w urządzeniu probówkę pierwszą zawierającą niezabarwione komórki i na karcie pulpitu nawigacyjnego pobierania kliknąć przycisk Załaduj. Na karcie cytometru dostosuj napięcia rozproszenia do przodu i boku, aż zobaczysz populację komórek jako gęste skupisko kropek na ekranie. Limfocyty są małymi komórkami, więc będą miały niskie rozproszenie do przodu i niskie rozproszenie boczne.

Następnie usuń fluorescencję tła, dostosowując napięcie dla fluorochromów na karcie cytometru, aż populacje komórek na ujemnym poziomie znajdą się w pierwszej dekadzie na karcie arkusza globalnego. W menu cytometru kliknij wyświetl konfigurację i sprawdź, czy wszystkie fluorochromy są obecne. Następnie umieść probówkę drugą w cytometrze i kliknij załadunek. Dostosuj nakładanie się widma na karcie cytometru, aż ujemne i dodatnie mediany populacji zostaną wyrównane na karcie arkusza globalnego. Na karcie akwizycji ustaw parametr Zdarzenia do rekordu na 10 000 i kliknij przycisk rekord. Powtórz te kroki z rurkami trzecią, czwartą i piątą.

Następnie załaduj rurkę szóstą, która zawiera wielokrotnie barwione komórki. Aby wyizolować limfocyty B, najpierw ustaw parametry sortowania komórek na podstawie ich morfologii. W pierwszym oknie wykreśl obszar rozproszenia do przodu FSC-A na osi y i obszar rozproszenia bocznego SSC-A na osi x. Na wykresie punktowym każda kropka reprezentuje komórkę. Kliknij bramę wielokątną w globalnym arkuszu, a następnie wybierz populację z niskim rozproszeniem do przodu i pośrednim rozproszeniem bocznym. W nowym oknie wykresu kropkowego kliknij prawym przyciskiem myszy okno i wybierz z menu opcję pokaż populacje, a następnie kliknij P1.

Następnie, w nowym oknie, bramkują żywotne komórki dodatnie CD45, wykreślając żywotność na osi y i CD45 na osi x. Użyj bramki wielokątnej, aby zakreślić komórki o niskiej żywotności i wysokim sygnale CD45, a następnie wybierz P2, aby wyświetlić wybrane komórki w nowym oknie. W następnym oknie bramka dla leukocytów CD45-dodatnich, z wyłączeniem limfocytów T. Z CD45 na osi x i CD3 na osi y, zakreśl populację z wysokim sygnałem CD45 i niskim ujemnym sygnałem CD3 i wybierz P3. Wreszcie, brama dla komórek CD19-dodatnich, które identyfikują limfocyty B. Z CD19 na osi y i CD3 na osi x, zakreśl populację z wysokim sygnałem CD19 i niskim ujemnym sygnałem CD3 i wybierz P4.

Wszystkie parametry sortowania są teraz ustawione. Następnie w oknie układu sortowania wybierz interesującą Cię populację komórek - P4, która jest czwartą populacją, która została zablokowana, i mówi maszynie, aby sortowała tylko limfocyty B. Ustaw zdarzenia docelowe na 10 000 komórek i ustaw precyzję na czystość. Sortujemy tylko jedną populację. Jednak w tym samym czasie można sortować do czterech różnych populacji. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij sortuj i OK. Następnie poczekaj na sortowanie komórek.

Po zakończeniu sortowania komórek należy przeprowadzić kontrolę czystości, pipetując 10 mikrolitrów posortowanych komórek do nowej probówki FACS z 90 mikrolitrami HBSS 2% FCS. Umieść probówkę w cytometrze, kliknij załaduj, a następnie kliknij rekord, aby przeanalizować fenotypy komórek w celu sprawdzenia, czy strategia bramkowania zadziałała zgodnie z przeznaczeniem.

Teraz przeanalizujemy posortowane komórki, aby określić procent limfocytów B wśród leukocytów, które zostały wyizolowane ze śledziony myszy. Aby rozpocząć, kliknij dwukrotnie ikonę FlowJo i przeciągnij pliki dla każdej probówki do okna wszystkich próbek.

Kliknij wielokąt i odtwórz strategie bramkowania, które zostały użyte w poprzedniej sekcji. Następnie kliknij edytor układu i przeciągnij interesujące nas populacje limfocytów B z probówki szóstej i kontroli czystości na kartę edytora układu. Pojawią się wykresy kropkowe reprezentujące limfocyty B. W tym przykładzie wykres w prawym górnym rogu przedstawia posortowane limfocyty B z całkowitej zawiesiny komórek śledziony, a wykres w prawym dolnym rogu to kontrola czystości. Komórki powinny pojawiać się tylko w populacji będącej przedmiotem zainteresowania w ramach kontroli czystości.

Aby sprawdzić czystość limfocytów B w posortowanych komórkach, kliknij edytor tabel. Przeciągnij populację limfocytów B z probówki szóstej i kontroli czystości w tabeli. W menu statystyk wybierz częstotliwość komórek CD45-dodatnich, aby przetestować czystość tej populacji komórek. Następnie kliknij utwórz tabelę. Wartości parametrów pojawią się w nowej tabeli. W oknie kontroli czystości sprawdź częstość występowania limfocytów B w komórkach CD45-dodatnich, która powinna być wyższa niż 98%.