5.5: Immunohistochemia i immunocytochemia: obrazowanie tkanek za pomocą mikroskopii świetlnej

1. Przygotowanie komórek do immunocytochemii

1. Interesujące komórki nasienne umieszcza się na szkiełkach z komorą lub szkiełkach nakrywkowych z komorą, dodając 0,5 ml zawiesiny komórkowej do dołków 24-dołkowej płytki hodowlanej.
   Uwaga: Niektóre komórki mogą wymagać wzrostu na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu polilizyny. Optymalne warunki leczenia powinny być określone przez użytkownika w zależności od rodzaju użytych komórek.
2. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze CO₂ i pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37°C do 50-70% zlewu.
3. Gdy komórki osiągną optymalną konfluencję, usuń pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, a następnie utrwal komórki, inkubując je w 0,5 ml 4% PFA (rozcieńczonego w 1X PBS) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usuń utrwalacz i umyj studzienki trzykrotnie 1 ml 1X PBS.
5. Następnie przeniknij komórki, dodając 0,5 ml 0,1% Triton-X-100 w 1X PBS do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odessać bufor permeabilacyjny i trzykrotnie przemyć studzienki 1 ml 1X PBS.
7. Komórki na szkiełkach nakrywkowych są teraz utrwalone i przepuszczalne. Przejdź do procedury barwienia pokazanej dla następującego przykładu immunohistochemicznego - z wyjątkiem tego, że inkubacje powinny być wykonywane w studzienkach płytki 24-dołkowej, a nie bezpośrednio na szkiełku do wycinku tkanki.

2. Przygotowanie utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków do barwienia

1. Uzyskać przygotowane skrawki tkanek utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie.

Deparafinowanie

2. Zanurz szkiełka w 100% ksylenie 2 razy na 5 minut każda.

Ponowne nawodnienie

3. Zanurz szkiełka w 100% etanolu 2 razy na 3 minuty każda.
4. Zanurz szkiełka w 95% etanolu na 3 minut.
5. Zanurz szkiełka w 70% etanolu na 3 minut.
6. Zanurz szkiełka w 50% etanolu na 3 minut.

Blokowanie aktywności endogennej peroksydazy

7. Inkubować szkiełka w 100 ml 0,3% H₂O₂ przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Umyj szkiełka 1X PBS 2 razy po 5 minut każde.

Pobieranie antygenu

9. Zanurz szkiełka w buforze cytrynianu IHC (pH 6) i gotuj je przez 20 minut.
10. Preparaty tkankowe są teraz gotowe do barwienia.

3. Przygotowanie świeżo mrożonych, otumanionych skrawków do barwienia

1. Umieść 5 mm świeżej, odizolowanej tkanki w foremce i dodawaj OCT, aż sekcja zostanie całkowicie pokryta.
2. Powoli zanurz blok tkanki w ciekłym azocie, aż do całkowitego zamrożenia. Próbka może być teraz przechowywana w temperaturze -80°C przez okres do 1 roku.
3. Gdy będziesz gotowy do cięcia, przenieś zamrożony blok tkanki do kriostatu i pozwól, aby cały zestaw osiągnął temperaturę -20°C.
4. Wytnij skrawki tkanek o grubości 5-10 μm za pomocą kriostatu i użyj pędzla, aby umieścić skrawki bezpośrednio na szkiełkach zgodnych z IHC.
5. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Preparaty można również przechowywać w temperaturze -80°C.
6. Zanurz szkiełka w 250 ml 4% PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić szkiełka przed barwieniem. Optymalna metoda mocowania powinna być określona przez użytkownika.
7. Zanurz szkiełka w 250 ml 1X PBS 2 razy na 5 minut każde.
8. Zanurz szkiełka w 250 ml 0,3% H₂O₂ na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania jakiejkolwiek aktywności endogennej peroksydazy.
9. Zanurz szkiełka w 250 ml 1X PBS 2 razy na 5 minut każde.
10. Szkiełka są teraz gotowe do barwienia.

4. Barwienie

1. Okrąż tkankę barierą hydrofobową za pomocą pisaka barierowego.

Blokowanie

2. Za pomocą pipety umieścić 100 μL buforu blokującego (surowica końska rozcieńczona w 1X PBS) - na odcinku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety.

Inkubacja przeciwciał pierwotnych

4. Inkubować otoczoną tkankę z rozcieńczonym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego w 100 μl (mysia anty-ludzka cyklina D1 rozcieńczona w stosunku 1:100 w buforze blokującym) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Odcedź przeciwciało pierwszorzędowe z każdego szkiełka i przemyj szkiełka 1X PBS 2 razy przez 5 minut każde.

Wtórna inkubacja przeciwciał

6. Inkubować próbkę ze 100 μl rozcieńczonego biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (biotynylowane przeciw-mysie IgG koni rozcieńczone w stosunku 1:200) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Usuń przeciwciało wtórne, odsączając skrawki i przemyj 1X PBS 2 razy przez 5 minut każdy.

Wywoływanie kolorów

8. Wizualizacja za pomocą HRP: Dodać 100 μl odczynnika kompleksu awidyna-biotyna (ABC) i inkubować skrawki w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej
   Uwaga: Fluorescencyjnie znakowane przeciwciała mogą być również używane i wizualizowane za pomocą odpowiedniego mikroskopu.
9. Umyj szkiełka 1X PBS 2 razy po 5 minut każde.
10. Rozwijaj szkiełka, inkubując sekcje w 100 μl DAB przez maksymalnie 5 minut.
11. Zatrzymaj rozwój, dodając wodę destylowaną (dH₂O) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Przeciwbarwienie (w razie potrzeby)

12. Zanurz szkiełka na krótko w roztworze hematoksyliny Harris (lub 0,5% zieleni metylowej w 0,1 M octanie sodu (pH 4,2)) na 10 minut.
13. Spłucz plamę, myjąc szkiełka w dH₂O dwa razy po 5 minut każde.

Odwodnienie

14. Zanurz szkiełka w 95% etanolu 2 razy na 5 minut każda.
15. Zanurz szkiełka w 100% etanolu 2 razy na 5 minut każda.
16. Zanurz szkiełka w 100% ksylenie 2 razy na 5 minut każda.
17. Osusz szkiełka ręcznikiem papierowym.

Montaż i nakładanie szkiełek nakrywkowych

18. Dodaj kroplę podłoża montażowego, takiego jak Organo-Limonene Mount do szkiełek i umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach.

Analiza mikroskopowa

19. Obserwuj poplamione skrawki pod odpowiednim mikroskopem w celu analizy. Tutaj do obserwacji użyto standardowego mikroskopu świetlnego, a do obrazowania użyto zamontowanej kamery cyfrowej.

Immunocytochemia i immunohistochemia to metody barwienia białka będącego przedmiotem zainteresowania odpowiednio w hodowanych komórkach i tkankach. Podstawowa zasada obu powiązanych technik polega na użyciu specyficznych przeciwciał oznaczonych systemem wykrywania w celu identyfikacji i wizualizacji białka oraz określenia jego lokalizacji w komórkach i tkankach, a także względnych poziomów. Proces w każdym eksperymencie rozpoczyna się od przygotowania próbki.

W przypadku immunocykltochemii, która specyficznie wizualizuje lokalizacje białek lub antygenów w komórkach, obejmuje to trzy etapy. Pierwszym krokiem jest posiew, który polega na hodowli komórek w pożywce wzrostowej na szkiełku nakrywkowym lub szkiełku, zazwyczaj w dołkach płytki hodowlanej. Następnie następuje utrwalenie, w którym do komórek dodaje się środek wytrącający lub sieciujący, taki jak paraformaldehyd, aby zachować integralność strukturalną białek i zapobiec ich degradacji przez aktywność enzymów. Ostatnim krokiem jest przepuszczalność, która polega na dodaniu detergentu, aby błony komórkowe były przepuszczalne dla barwienia.

W metodzie odpowiednika, immunohistochemii, białka lub antygeny są wizualizowane w tkankach, a przygotowanie próbki składa się z pięciu etapów. Najpierw cała tkanka poddawana jest utrwalaniu, zwykle za pomocą paraformaldehydu. Następnie zanurza się tkankę w bloku parafiny, a następnie kroi ten blok za pomocą maszyny zwanej mikrotomem w celu pocięcia tkanki na cienkie plasterki, które można umieścić na szkiełkach. Następnie preparaty poddawane są deparafinowaniu, czyli usunięciu parafiny z okolic wycinka tkanki. Następnie można wykonać opcjonalny etap pobierania antygenu. Można to zrobić za pomocą ciepła lub enzymów, aby zdemaskować epitopy, które zostały usieciowane podczas utrwalania, umożliwiając im wiązanie przeciwciał. Po odpowiednim przygotowaniu próbki do próbki komórki lub tkanki dodaje się przeciwciało pierwszorzędowe specyficzne dla celu. To pierwszorzędowe przeciwciało powinno wiązać się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie dodaje się przeciwciało drugorzędowe, które wykrywa i wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym. To drugorzędowe przeciwciało jest sprzężone z enzymem zwanym HRP lub może się z nim wiązać. Po dodaniu specyficznego substratu, DAB, HRP przekształca go w nierozpuszczalny, brązowy osad. Ta brązowa plama oznacza lokalizację docelowego białka. Szkiełka są również barwione hematoksyliną, która oznacza jądra na niebiesko i stanowi przestrzenny punkt odniesienia do określenia lokalizacji subkomórkowej. Następnie do szkiełka dodaje się materiał montażowy, a następnie szkiełko nakrywkowe w celu uszczelnienia i konserwacji zabarwionej próbki. Na koniec preparaty można zobrazować pod mikroskopem świetlnym.

W tym filmie przyjrzysz się technice przygotowania próbek do posiałek komórkowych i skrawków tkanek, a następnie barwienia immunologicznego skrawków tkanek.

Po pierwsze, interesujące komórki muszą zostać osadzone na szkiełkach nakrywkowych. Aby to zrobić, pracując w kapturze do hodowli tkankowych, umieść pojedyncze szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowej płytki. Następnie zamknij skrzydło i włącz światło UV, aby sterylizować szkiełka nakrywkowe przez co najmniej 15 minut. Następnie wyłącz światło UV. Aby podnieść interesujące komórki z 10-centymetrowego naczynia, odessać pożywkę, krótko przemyć PBS i dodawać trypsynę do komórek przez 2 minuty. Następnie postukaj w bok płytki, aby upewnić się, że komórki się odczepiły i zneutralizuj trypsynę za pomocą pożywki. Następnie dodaj 0. 5 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe zostały przykryte. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze CO2 i pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż zlewają się w 50-70%.

Gdy komórki osiągną optymalne zbieganie, odessaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, a następnie utrwal komórki, inkubując je w . 5 ml 4% paraformaldehydu rozcieńczonego w 1X PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu utrwalacza przepłucz komórki, dodając 1 ml 1X PBS na każde szkiełko nakrywkowe. Natychmiast zassać PBS, a następnie powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy, w sumie 3 prania.

Teraz przeniknij komórki, dodając 0,5 ml 0,1% Triton X-100 w 1X PBS do każdej studzienki. Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 15 minut. Odessać bufor permeabilizacyjny, a następnie przepłukać komórki, dodając 1 ml 1X PBS do każdej studzienki. Natychmiast odessać PBS i powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy, co daje w sumie 3 prania. Teraz, gdy komórki na szkiełkach nakrywkowych są utrwalone i przepuszczalne, należy przejść do procedury barwienia pokazanej dla następującego przykładu immunohistochemicznego, z wyjątkiem tego, że inkubacje powinny być wykonywane w dołkach 24-dołkowej płytki, a nie bezpośrednio na szkiełku do wycinka tkanki.

Na początek należy zaopatrzyć się w przygotowane, utrwalone formaliną, zatopione w parafinie skrawki tkanki. Odparafinować szkiełka, umieszczając je w stojaku na szkiełka, a następnie całkowicie zanurzając je w 250 ml 100% ksylenu. Pozostawić szkiełka do inkubacji przez 5 minut w ksylenie. Następnie wyjmij szkiełka z pojemnika, wytrzyj je ręcznikiem papierowym i umieść je w nowej kąpieli ksylenowej w nowym pojemniku na kolejne 5 minut.

Następnie ponownie uwodnij sekcje w serii stopniowanych roztworów etanolu, zaczynając od 100% etanolu przez 3 minuty. Wytrzyj stojak na szkiełka ręcznikiem papierowym i przenieś szkiełka do nowego pojemnika ze 100% etanolem na kolejne 3 minuty. Kontynuuj ten cykl mycia, suszenia ręcznikiem papierowym i przenoszenia szkiełek do nowej kąpieli zgodnie ze wskazanymi stężeniami etanolu przez określony czas. Po ostatnim myciu etanolem wytrzyj stojak ręcznikiem papierowym i inkubuj szkiełka w 100 ml 3% nadtlenku wodoru przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania jakiejkolwiek aktywności endogennej peroksydazy. Myć szkiełka w 250 ml 1X PBS przez 5 minut. Powtórz to pranie w pojemniku ze świeżym 1X PBS przez dodatkowe 5 minut.

Następnie wykonaj pobieranie antygenu, zanurzając szkiełka w 250 ml buforu cytrynianu IHC o pH 6,0 i gotując je przez 20 minut. Następnie przejdź do protokołu barwienia.

Aby rozpocząć proces barwienia dla IHC, zakreśl sekcje pisakiem hydrofobowym, aby określić minimalny obszar, który bufor musi pokryć. Następnie za pomocą pipety umieść 100 mikrolitrów buforu blokującego, który w tym eksperymencie jest surowicą końską rozcieńczoną w 1X PBS, na przekroju. Inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń bufor blokujący za pomocą pipety.

Następnie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało i bufor blokujący w rozcieńczeniu 1:100, dodając 990 mikrolitrów surowicy końskiej rozcieńczonej w 1X PBS do 1. 5 ml probówki Eppendorfa, a następnie 10 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego. Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej sekcji i inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Gdy zabrzmi minutnik, odcedź przeciwciało pierwszorzędowe z każdego szkiełka, a następnie umyj je w 250 ml 1X PBS przez 5 minut. Powtórz to pranie jeszcze raz, używając świeżego 1X PBS.

Podczas mycia szkiełek w 1X PBS, rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe do rozcieńczenia 1:200, dodając 995 mikrolitrów buforu blokującego do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie 5 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego, którym w tym przypadku jest biotynylowany anty-mysi IGG dla koni. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej sekcji, a następnie inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach usuń przeciwciało wtórne, odsączając je z sekcji, a następnie umyj szkiełka w 250 ml 1X PBS przez 5 minut. Powtórz to pranie, używając świeżego 1X PBS.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów odczynnika kompleksu awidyny-biotyny i inkubuj sekcje w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka, zanurzając je w 250 ml 1X PBS na 5 minut. Podobnie jak w poprzednich krokach prania, powtórz to pranie jeszcze raz, używając świeżego 1X PBS. Następnie opracuj szkiełka, inkubując sekcje w 100 mikrolitrach DAB przez maksymalnie 5 minut. Zatrzymaj rozwój, zanurzając skrawki w 250 ml wody destylowanej na 5 minut.

Teraz prowadnice można w razie potrzeby zabarwić. Aby to zrobić, zanurz na krótko szkiełka w 250 ml roztworu hematoksyliny Harrisa. Spłucz plamę, myjąc szkiełka w 250 ml wody destylowanej przez 5 minut. Powtórz to pranie jeszcze 1 raz, używając świeżej wody destylowanej. Następnie odwodnij sekcje. Aby to zrobić, najpierw inkubuj szkiełka w 95% etanolu przez 5 minut. Osusz szkiełka na ręczniku papierowym i przenieś je do nowego pojemnika ze świeżym 95% etanolem na kolejne 5 minut. Kontynuuj cykl mycia, osuszania ręcznikiem papierowym i przenoszenia szkiełek do nowej kąpieli, postępując zgodnie ze wskazanymi roztworami przez 5 minut każde.

Po końcowej inkubacji osusz szkiełka ręcznikiem papierowym, a następnie dodaj do nich kroplę podłoża montażowego, takiego jak mocowanie organo-limonenowe. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach, uważając, aby nie zatrzymać pęcherzyków powietrza. Szkiełka są teraz gotowe do obserwacji pod mikroskopem w celu analizy.

Aby obserwować zabarwione fragmenty, użyj standardowego mikroskopu świetlnego do wizualizacji plamy oraz kamery cyfrowej do uchwycenia obrazu. W tym konkretnym przykładzie IHC tkanki śledziony myszy typu dzikiego i spontanicznego, podwójnie transgenicznego lub DTG są porównywane w celu zbadania ekspresji dykliny D1 w chłoniaku. Tkanki zostały zatopione w parafinie, pocięte i wybarwione przeciwciałem antycyklinowym D1 i zobrazowane w 20-krotnym powiększeniu. Komórki wykazujące ekspresję cykliny D1 są oznaczone czerwonawo-brązowym kolorem na niebieskim tle tkanki. Porównując intensywność barwienia między obrazami z różnych myszy, niepowiększone śledziony mają stosunkowo niską ekspresję cykliny D1, niezależnie od genotypu myszy. W przeciwieństwie do tego, powiększona śledziona myszy DTG wykazuje zwiększone czerwono-brązowe zabarwienie, co wskazuje na korelację między rozwojem raka a ekspresją cykliny D1 w tym modelu myszy.