Immunohistochemia i immunocytochemia: obrazowanie tkanek za pomocą mikroskopii świetlnej

1. Przygotowanie komórek do immunocytochemii

1. Interesujące komórki nasienne umieszcza się na szkiełkach z komorą lub szkiełkach nakrywkowych z komorą, dodając 0,5 ml zawiesiny komórkowej do dołków 24-dołkowej płytki hodowlanej.
   Uwaga: Niektóre komórki mogą wymagać wzrostu na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu polilizyny. Optymalne warunki leczenia powinny być określone przez użytkownika w zależności od rodzaju użytych komórek.
2. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze CO₂ i pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37°C do 50-70% zlewu.
3. Gdy komórki osiągną optymalną konfluencję, usuń pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, a następnie utrwal komórki, inkubując je w 0,5 ml 4% PFA (rozcieńczonego w 1X PBS) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usuń utrwalacz i umyj studzienki trzykrotnie 1 ml 1X PBS.
5. Następnie przeniknij komórki, dodając 0,5 ml 0,1% Triton-X-100 w 1X PBS do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odessać bufor permeabilacyjny i trzykrotnie przemyć studzienki 1 ml 1X PBS.
7. Komórki na szkiełkach nakrywkowych są teraz utrwalone i przepuszczalne. Przejdź do procedury barwienia pokazanej dla następującego przykładu immunohistochemicznego - z wyjątkiem tego, że inkubacje powinny być wykonywane w studzienkach płytki 24-dołkowej, a nie bezpośrednio na szkiełku do wycinku tkanki.

2. Przygotowanie utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków do barwienia

1. Uzyskać przygotowane skrawki tkanek utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie.

Deparafinowanie

2. Zanurz szkiełka w 100% ksylenie 2 razy na 5 minut każda.

Ponowne nawodnienie

3. Zanurz szkiełka w 100% etanolu 2 razy na 3 minuty każda.
4. Zanurz szkiełka w 95% etanolu na 3 minut.
5. Zanurz szkiełka w 70% etanolu na 3 minut.
6. Zanurz szkiełka w 50% etanolu na 3 minut.

Blokowanie aktywności endogennej peroksydazy

7. Inkubować szkiełka w 100 ml 0,3% H₂O₂ przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Umyj szkiełka 1X PBS 2 razy po 5 minut każde.

Pobieranie antygenu

9. Zanurz szkiełka w buforze cytrynianu IHC (pH 6) i gotuj je przez 20 minut.
10. Preparaty tkankowe są teraz gotowe do barwienia.

3. Przygotowanie świeżo mrożonych, otumanionych skrawków do barwienia

1. Umieść 5 mm świeżej, odizolowanej tkanki w foremce i dodawaj OCT, aż sekcja zostanie całkowicie pokryta.
2. Powoli zanurz blok tkanki w ciekłym azocie, aż do całkowitego zamrożenia. Próbka może być teraz przechowywana w temperaturze -80°C przez okres do 1 roku.
3. Gdy będziesz gotowy do cięcia, przenieś zamrożony blok tkanki do kriostatu i pozwól, aby cały zestaw osiągnął temperaturę -20°C.
4. Wytnij skrawki tkanek o grubości 5-10 μm za pomocą kriostatu i użyj pędzla, aby umieścić skrawki bezpośrednio na szkiełkach zgodnych z IHC.
5. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Preparaty można również przechowywać w temperaturze -80°C.
6. Zanurz szkiełka w 250 ml 4% PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić szkiełka przed barwieniem. Optymalna metoda mocowania powinna być określona przez użytkownika.
7. Zanurz szkiełka w 250 ml 1X PBS 2 razy na 5 minut każde.
8. Zanurz szkiełka w 250 ml 0,3% H₂O₂ na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania jakiejkolwiek aktywności endogennej peroksydazy.
9. Zanurz szkiełka w 250 ml 1X PBS 2 razy na 5 minut każde.
10. Szkiełka są teraz gotowe do barwienia.

4. Barwienie

1. Okrąż tkankę barierą hydrofobową za pomocą pisaka barierowego.

Blokowanie

2. Za pomocą pipety umieścić 100 μL buforu blokującego (surowica końska rozcieńczona w 1X PBS) - na odcinku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety.

Inkubacja przeciwciał pierwotnych

4. Inkubować otoczoną tkankę z rozcieńczonym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego w 100 μl (mysia anty-ludzka cyklina D1 rozcieńczona w stosunku 1:100 w buforze blokującym) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Odcedź przeciwciało pierwszorzędowe z każdego szkiełka i przemyj szkiełka 1X PBS 2 razy przez 5 minut każde.

Wtórna inkubacja przeciwciał

6. Inkubować próbkę ze 100 μl rozcieńczonego biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (biotynylowane przeciw-mysie IgG koni rozcieńczone w stosunku 1:200) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Usuń przeciwciało wtórne, odsączając skrawki i przemyj 1X PBS 2 razy przez 5 minut każdy.

Wywoływanie kolorów

8. Wizualizacja za pomocą HRP: Dodać 100 μl odczynnika kompleksu awidyna-biotyna (ABC) i inkubować skrawki w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej
   Uwaga: Fluorescencyjnie znakowane przeciwciała mogą być również używane i wizualizowane za pomocą odpowiedniego mikroskopu.
9. Umyj szkiełka 1X PBS 2 razy po 5 minut każde.
10. Rozwijaj szkiełka, inkubując sekcje w 100 μl DAB przez maksymalnie 5 minut.
11. Zatrzymaj rozwój, dodając wodę destylowaną (dH₂O) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Przeciwbarwienie (w razie potrzeby)

12. Zanurz szkiełka na krótko w roztworze hematoksyliny Harris (lub 0,5% zieleni metylowej w 0,1 M octanie sodu (pH 4,2)) na 10 minut.
13. Spłucz plamę, myjąc szkiełka w dH₂O dwa razy po 5 minut każde.

Odwodnienie

14. Zanurz szkiełka w 95% etanolu 2 razy na 5 minut każda.
15. Zanurz szkiełka w 100% etanolu 2 razy na 5 minut każda.
16. Zanurz szkiełka w 100% ksylenie 2 razy na 5 minut każda.
17. Osusz szkiełka ręcznikiem papierowym.

Montaż i nakładanie szkiełek nakrywkowych

18. Dodaj kroplę podłoża montażowego, takiego jak Organo-Limonene Mount do szkiełek i umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach.

Analiza mikroskopowa

19. Obserwuj poplamione skrawki pod odpowiednim mikroskopem w celu analizy. Tutaj do obserwacji użyto standardowego mikroskopu świetlnego, a do obrazowania użyto zamontowanej kamery cyfrowej.