Wytwarzanie przeciwciał: wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych za pomocą hybrydomy

Uwaga: Technika sterylnej hodowli komórek powinna być zachowana podczas obchodzenia się z komórkami hybrydoma i pożywką w sterylny sposób (np. w komorze bezpieczeństwa biologicznego) do momentu etapu oczyszczania przeciwciał.

1. Rozmrażanie zamrożonych komórek hybrydomy

1. Inkubować fiolkę zawierającą zamrożone komórki hybrydoma w łaźni wodnej o temperaturze 37°C do momentu rozmrożenia (około 2 minuty).
2. Dodaj rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pełnego RPMI (RPMI uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 1x aminokwasy endogenne, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 10 mM HEPES).
3. Wirować przez 5 minut przy 1200 obr./min, aby wypłukać wszelkie zanieczyszczające media zamrażające.
4. Po odwirowaniu wyrzuć ciekły supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 ml świeżego pełnego RPMI. Następnie dodaj komórki do kolby do hodowli tkankowej T75 zawierającej 15 ml całkowitego RPMI (końcowa objętość RPMI to 20 ml).
5. Hoduj komórki w standardowym inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO₂. Komórki nie przylegają do ciała podczas hodowli.

2. Ekspansja hybrydomy

1. Pozwól komórkom rozszerzać się przez około 3 dni, aż kolba będzie zlewać się w ~80%.
   Uwaga: Ten czas może się różnić w zależności od początkowej liczby komórek, jak również od nieodłącznych różnic w tempie wzrostu różnych komórek. Ważne jest, aby komórki znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego.
2. Gdy początkowa kolba osiągnie ~80% konfluencji, usuń komórki z tej początkowej kolby T75, umieść w stożkowej probówce wirówkowej i wiruj (1200 obr./min przez 5 minut), aby osadzać komórki.
3. Ponownie zawiesić komórki w 6 ml pełnego RPMI, a następnie rozprowadzić zawiesinę komórek do trzech nowych kolb T75 (2 ml / kolba zawierająca 18 ml RPMI). Inkubuj te trzy kolby T75 w temperaturze 37°C z 5% CO₂, aż osiągną ~80% zlewania się (powinno to zająć około 3 dni).

3. Produkcja przeciwciał w podłożu wolnym od surowicy

Uwaga: W tym momencie komórki są gotowe do kontynuowania wzrostu w pożywce bez surowicy, przeznaczonej do wzrostu linii komórkowych hybrydoma. W tym protokole stosujemy gotową do użycia, dostępną na rynku pożywkę HB Basal Liquid zawierającą Produkt Uzupełniający HB101.

1. Komórki z każdej z trzech kolb T75 (przy ~80% konfluencji) są zbierane i odwirowywane (1200 obr./min przez 5 min).
2. Osad komórkowy z każdej kolby T75 zawiesza się ponownie w 10 ml uzupełnionej pożywki bez surowicy HB101, a następnie dodaje się do dwóch kolb T225 uzupełnionych pożywką bez surowicy HB101 (tj. 5 ml zawiesiny komórek do każdej z 6 kolb zawierających ~220-240 ml HB101 w każdej kolbie).
3. Kontynuuj hodowlę komórek w kolbach T225 i pożywce HB101 w temperaturze 37°C z 5% CO₂ przez trzy tygodnie lub do momentu, gdy komórki zaczną umierać. Komórki wytwarzają mAb w ciągu tych 3 tygodni i wydzielają go do pożywki hodowlanej. Gdy komórki zaczynają obumierać, nie wytwarzają już żadnego mAb.

4. Oczyszczanie przeciwciał - Dzień 1

Uwaga: W tym momencie sterylność nie musi być utrzymywana, więc obchodzenie się z pożywką w sterylny sposób (np. w komorze bezpieczeństwa biologicznego) nie jest wymagane. Co więcej, hybrydomy nie są uważane za środek "na poziomie BSL2".

1. Wlać pożywkę z kolb do probówek dla wirnika o stałym kącie. Obracaj probówki w wirówce z wirnikiem o stałym kącie obrotowym z prędkością 10 000 obr./min przez 8 minut. Ten etap ma na celu usunięcie resztek komórkowych z supernatantu hodowli.
   Uwaga: Rozmiary rur mogą się różnić w zależności od użytego wirnika. Ważną rzeczą do zapamiętania jest to, aby mieć taką samą objętość w probówkach, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przed wirowaniem. Jest prawdopodobne, że cała objętość pożywki nie zmieści się w wirówce za jednym razem. Pozostałe pożywki zostaną odwirowane później (krok 4.5) przy użyciu tych samych probówek.
2. Przygotuj plastikową zlewkę o pojemności 2 l z mieszadłem w wiadrze otoczonym lodem. Umieść na talerzu do mieszania.
3. Przymocuj nasadkę filtra o pojemności 500 ml na butelce o pojemności 1 l. Przymocuj filtr górny do butelki do odkurzacza domowego za pomocą odpowiedniej rurki.
4. Wlać supernatant z kroku 4.1 (który nadal zawiera mAb wytwarzany przez komórki hybrydomy) do górnej części filtra.
5. Kontynuuj używanie tego samego zestawu probówek do osadzania resztek komórek z podłoża (granulka będzie się nadal budować). Poczekaj z uruchomieniem próżni, aż górna część filtra będzie pełna i kolejna partia supernatantu będzie gotowa do wlania. Nie pozwól, aby filtr wyschł, ponieważ filtrowanie stanie się bardzo powolne.
6. Gdy butelka o pojemności 1 l jest prawie pełna, zdejmij pokrywę filtra i wlej supernatant do zlewki o pojemności 2 litrów przygotowanej w kroku 4.2. Ponownie załóż górną część filtra. Śledź głośność.
7. Powtarzaj etapy wirowania i filtracji, aż wszystkie media zostaną przetworzone.
8. Odmierz 295 g siarczanu amonu na 1 litr przefiltrowanego supernatantu. Mieszając, powoli dodawaj siarczan amonu do supernatantu przez następne kilka godzin (~25 g co 15 minut), aby zapobiec miejscowemu wysokiemu stężeniu soli siarczanu amonu, które może powodować wytrącanie się niepożądanych białek.
9. Po dodaniu całego siarczanu amonu przykryć zlewkę folią i przesunąć za pomocą płytki mieszającej do temperatury 4°C (np. w lodówce lub chłodni). Mieszaj przez noc. Ciągłe mieszanie roztworu jest wymagane do rozpuszczenia soli, ale długotrwałe mieszanie może prowadzić do denaturacji białek w roztworze na granicy powierzchni/powietrza.
10. Umyj rurki za pomocą wirnika o stałym kącie.

5. Oczyszczanie przeciwciał - Dzień 2

1. Wlać siarczan amonu zawierający supernatant ze zlewki o pojemności 2 l do probówek na wirnik o stałym kącie. Wirówka wirowa z wirnikiem o stałym kącie obrotu przy 6500 obr./min przez 20 minut bez hamulca.
2. Odessać próżniowo supernatant, uważając, aby nie zassać osadu, ponieważ będzie miękki. Kontynuować używanie tego samego zestawu probówek do zbierania osadu z siarczanu amonu zawierającego supernatant.
3. Po ostatniej aspiracji ponownie zamieszaj każdą osadkę (która zawiera przeciwciała) w ~1 ml PBS.
4. Usunąć siarczan amonu z wytrąconego roztworu mAb przez dializę przeciwko dużym objętościom PBS. Aby to zrobić, najpierw przeciąć około 1 cala rurki dializacyjnej (np. Membra-Cel MD25-14 MWCO 12 000-14 000 Dalton odcięty celulozowy rurka do dializy) na każdy ml roztworu mAb. Zwilż rurkę dH₂O. Zawiąż węzeł na jednym końcu rurki i napełnij dH₂O, aby sprawdzić, czy węzeł nie przecieka. Opróżnij dH₂O z rurki.
5. Odpipetować PBS/roztwór przeciwciał do rurki. Przepłukać probówki dodatkowym 0,25 ml PBS i przenieść do rurki.
6. Przymocuj górną część rurki jak najbliżej roztworu za pomocą pomarańczowego klipsa do dializy.
7. Przyklej górną część rurki do zewnętrznej górnej części zlewki o pojemności 4 litrów. Pozwól, aby wypełniona część rurki zwisała w zlewce. Napełnij zlewkę PBS i dodaj mieszadło.
8. Mieszaj przez noc przez ~8 godzin w temperaturze 4°C.
9. Zastąp PBS w zlewce świeżym PBS i mieszaj jeszcze dwa razy przez ~8 godzin.
10. Przenieść przeciwciało z rurki do stożkowych probówek o pojemności 15 lub 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 1200 obr./min, aby usunąć wszelkie osady, które mogły się utworzyć. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
11. Rozcieńczyć podwielokrotność przeciwciała w stosunku 1:20 PBS (5 μl przeciwciała + 95 μl PBS). Oznaczyć ilościowo stężenie przeciwciał za pomocą spektrofotometru (ślepej próby z PBS) przy długości fali 280 nm. Użyj współczynnika ekstynkcji (ε) wynoszącego 1,43. Stężenie oblicza się jako
    
    
12. Podać dowielokrotnienie przeciwciała do fiolek z nakrętką i przechowywać w temperaturze -80°C.