5.6: Wytwarzanie przeciwciał: wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych za pomocą hybrydomy

Uwaga: Technika sterylnej hodowli komórek powinna być zachowana podczas obchodzenia się z komórkami hybrydoma i pożywką w sterylny sposób (np. w komorze bezpieczeństwa biologicznego) do momentu etapu oczyszczania przeciwciał.

1. Rozmrażanie zamrożonych komórek hybrydomy

1. Inkubować fiolkę zawierającą zamrożone komórki hybrydoma w łaźni wodnej o temperaturze 37°C do momentu rozmrożenia (około 2 minuty).
2. Dodaj rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pełnego RPMI (RPMI uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 1x aminokwasy endogenne, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 10 mM HEPES).
3. Wirować przez 5 minut przy 1200 obr./min, aby wypłukać wszelkie zanieczyszczające media zamrażające.
4. Po odwirowaniu wyrzuć ciekły supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 ml świeżego pełnego RPMI. Następnie dodaj komórki do kolby do hodowli tkankowej T75 zawierającej 15 ml całkowitego RPMI (końcowa objętość RPMI to 20 ml).
5. Hoduj komórki w standardowym inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO₂. Komórki nie przylegają do ciała podczas hodowli.

2. Ekspansja hybrydomy

1. Pozwól komórkom rozszerzać się przez około 3 dni, aż kolba będzie zlewać się w ~80%.
   Uwaga: Ten czas może się różnić w zależności od początkowej liczby komórek, jak również od nieodłącznych różnic w tempie wzrostu różnych komórek. Ważne jest, aby komórki znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego.
2. Gdy początkowa kolba osiągnie ~80% konfluencji, usuń komórki z tej początkowej kolby T75, umieść w stożkowej probówce wirówkowej i wiruj (1200 obr./min przez 5 minut), aby osadzać komórki.
3. Ponownie zawiesić komórki w 6 ml pełnego RPMI, a następnie rozprowadzić zawiesinę komórek do trzech nowych kolb T75 (2 ml / kolba zawierająca 18 ml RPMI). Inkubuj te trzy kolby T75 w temperaturze 37°C z 5% CO₂, aż osiągną ~80% zlewania się (powinno to zająć około 3 dni).

3. Produkcja przeciwciał w podłożu wolnym od surowicy

Uwaga: W tym momencie komórki są gotowe do kontynuowania wzrostu w pożywce bez surowicy, przeznaczonej do wzrostu linii komórkowych hybrydoma. W tym protokole stosujemy gotową do użycia, dostępną na rynku pożywkę HB Basal Liquid zawierającą Produkt Uzupełniający HB101.

1. Komórki z każdej z trzech kolb T75 (przy ~80% konfluencji) są zbierane i odwirowywane (1200 obr./min przez 5 min).
2. Osad komórkowy z każdej kolby T75 zawiesza się ponownie w 10 ml uzupełnionej pożywki bez surowicy HB101, a następnie dodaje się do dwóch kolb T225 uzupełnionych pożywką bez surowicy HB101 (tj. 5 ml zawiesiny komórek do każdej z 6 kolb zawierających ~220-240 ml HB101 w każdej kolbie).
3. Kontynuuj hodowlę komórek w kolbach T225 i pożywce HB101 w temperaturze 37°C z 5% CO₂ przez trzy tygodnie lub do momentu, gdy komórki zaczną umierać. Komórki wytwarzają mAb w ciągu tych 3 tygodni i wydzielają go do pożywki hodowlanej. Gdy komórki zaczynają obumierać, nie wytwarzają już żadnego mAb.

4. Oczyszczanie przeciwciał - Dzień 1

Uwaga: W tym momencie sterylność nie musi być utrzymywana, więc obchodzenie się z pożywką w sterylny sposób (np. w komorze bezpieczeństwa biologicznego) nie jest wymagane. Co więcej, hybrydomy nie są uważane za środek "na poziomie BSL2".

1. Wlać pożywkę z kolb do probówek dla wirnika o stałym kącie. Obracaj probówki w wirówce z wirnikiem o stałym kącie obrotowym z prędkością 10 000 obr./min przez 8 minut. Ten etap ma na celu usunięcie resztek komórkowych z supernatantu hodowli.
   Uwaga: Rozmiary rur mogą się różnić w zależności od użytego wirnika. Ważną rzeczą do zapamiętania jest to, aby mieć taką samą objętość w probówkach, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przed wirowaniem. Jest prawdopodobne, że cała objętość pożywki nie zmieści się w wirówce za jednym razem. Pozostałe pożywki zostaną odwirowane później (krok 4.5) przy użyciu tych samych probówek.
2. Przygotuj plastikową zlewkę o pojemności 2 l z mieszadłem w wiadrze otoczonym lodem. Umieść na talerzu do mieszania.
3. Przymocuj nasadkę filtra o pojemności 500 ml na butelce o pojemności 1 l. Przymocuj filtr górny do butelki do odkurzacza domowego za pomocą odpowiedniej rurki.
4. Wlać supernatant z kroku 4.1 (który nadal zawiera mAb wytwarzany przez komórki hybrydomy) do górnej części filtra.
5. Kontynuuj używanie tego samego zestawu probówek do osadzania resztek komórek z podłoża (granulka będzie się nadal budować). Poczekaj z uruchomieniem próżni, aż górna część filtra będzie pełna i kolejna partia supernatantu będzie gotowa do wlania. Nie pozwól, aby filtr wyschł, ponieważ filtrowanie stanie się bardzo powolne.
6. Gdy butelka o pojemności 1 l jest prawie pełna, zdejmij pokrywę filtra i wlej supernatant do zlewki o pojemności 2 litrów przygotowanej w kroku 4.2. Ponownie załóż górną część filtra. Śledź głośność.
7. Powtarzaj etapy wirowania i filtracji, aż wszystkie media zostaną przetworzone.
8. Odmierz 295 g siarczanu amonu na 1 litr przefiltrowanego supernatantu. Mieszając, powoli dodawaj siarczan amonu do supernatantu przez następne kilka godzin (~25 g co 15 minut), aby zapobiec miejscowemu wysokiemu stężeniu soli siarczanu amonu, które może powodować wytrącanie się niepożądanych białek.
9. Po dodaniu całego siarczanu amonu przykryć zlewkę folią i przesunąć za pomocą płytki mieszającej do temperatury 4°C (np. w lodówce lub chłodni). Mieszaj przez noc. Ciągłe mieszanie roztworu jest wymagane do rozpuszczenia soli, ale długotrwałe mieszanie może prowadzić do denaturacji białek w roztworze na granicy powierzchni/powietrza.
10. Umyj rurki za pomocą wirnika o stałym kącie.

5. Oczyszczanie przeciwciał - Dzień 2

1. Wlać siarczan amonu zawierający supernatant ze zlewki o pojemności 2 l do probówek na wirnik o stałym kącie. Wirówka wirowa z wirnikiem o stałym kącie obrotu przy 6500 obr./min przez 20 minut bez hamulca.
2. Odessać próżniowo supernatant, uważając, aby nie zassać osadu, ponieważ będzie miękki. Kontynuować używanie tego samego zestawu probówek do zbierania osadu z siarczanu amonu zawierającego supernatant.
3. Po ostatniej aspiracji ponownie zamieszaj każdą osadkę (która zawiera przeciwciała) w ~1 ml PBS.
4. Usunąć siarczan amonu z wytrąconego roztworu mAb przez dializę przeciwko dużym objętościom PBS. Aby to zrobić, najpierw przeciąć około 1 cala rurki dializacyjnej (np. Membra-Cel MD25-14 MWCO 12 000-14 000 Dalton odcięty celulozowy rurka do dializy) na każdy ml roztworu mAb. Zwilż rurkę dH₂O. Zawiąż węzeł na jednym końcu rurki i napełnij dH₂O, aby sprawdzić, czy węzeł nie przecieka. Opróżnij dH₂O z rurki.
5. Odpipetować PBS/roztwór przeciwciał do rurki. Przepłukać probówki dodatkowym 0,25 ml PBS i przenieść do rurki.
6. Przymocuj górną część rurki jak najbliżej roztworu za pomocą pomarańczowego klipsa do dializy.
7. Przyklej górną część rurki do zewnętrznej górnej części zlewki o pojemności 4 litrów. Pozwól, aby wypełniona część rurki zwisała w zlewce. Napełnij zlewkę PBS i dodaj mieszadło.
8. Mieszaj przez noc przez ~8 godzin w temperaturze 4°C.
9. Zastąp PBS w zlewce świeżym PBS i mieszaj jeszcze dwa razy przez ~8 godzin.
10. Przenieść przeciwciało z rurki do stożkowych probówek o pojemności 15 lub 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 1200 obr./min, aby usunąć wszelkie osady, które mogły się utworzyć. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
11. Rozcieńczyć podwielokrotność przeciwciała w stosunku 1:20 PBS (5 μl przeciwciała + 95 μl PBS). Oznaczyć ilościowo stężenie przeciwciał za pomocą spektrofotometru (ślepej próby z PBS) przy długości fali 280 nm. Użyj współczynnika ekstynkcji (ε) wynoszącego 1,43. Stężenie oblicza się jako
    
    
12. Podać dowielokrotnienie przeciwciała do fiolek z nakrętką i przechowywać w temperaturze -80°C.

Przeciwciała są potężnym narzędziem do badań i diagnozy, co oznacza, że często konieczne jest wytwarzanie ich w dużych ilościach.

Pierwszym krokiem do wytworzenia przeciwciał jest wstrzyknięcie interesującego antygenu zwierzęciu-gospodarzowi. Antygen aktywuje limfocyty B gospodarza, które następnie wytwarzają i uwalniają przeciwciała specyficzne dla tego antygenu. Następnie przeprowadza się regularne badania przesiewowe surowic odpornościowych zwierzęcia żywiciela na obecność przeciwciała docelowego, stosując test ELISA lub inną metodę wykrywania. Po wykryciu śledziona zwierzęcia gospodarza, która zawiera limfocyty B, jest usuwana. Jeśli wszystkie limfocyty B ze śledziony są teraz wyizolowane, powinno to obejmować populację, która wydziela przeciwciała przeciwko badanemu antygenowi. Nazywamy tę populację poliklonalną, ponieważ każda komórka prawdopodobnie wiązała się z innym epitopem antygenu, a zatem generowała swoje własne, indywidualne i unikalne przeciwciało.

Aby wytworzyć przeciwciała monoklonalne, przeciwciała podniesione w celu rozpoznania jednego określonego epitopu, należy najpierw wyizolować i wyhodować pojedynczą komórkę B, która wytwarza pożądane przeciwciało. Niestety, limfocyty B nie przeżywają dobrze w hodowli. Aby pokonać tę przeszkodę, naukowcy łączą limfocyty B z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka, w wyniku czego powstają hybrydomaki. Komórki te są następnie hodowane w selektywnym pożywce, która pozwala tylko hybrydomom rosnąć i uwalniać przeciwciała. Ponownie pożywka jest badana przesiewowo przy użyciu metody takiej jak ELISA w celu uzyskania pożądanego przeciwciała. Po wykryciu hybrydomy są klonowane w procesie zwanym rozcieńczeniem ograniczającym, seryjnym rozcieńczeniem kultury rodzicielskiej, co powinno skutkować wysiewem pojedynczych komórek do dołków płytki przesiewowej. Pozwala to na wzrost hybrydoma z pojedynczej komórki rodzicielskiej, dając monoklonalną linię komórkową, która uwalnia tylko pożądane przeciwciało. Te linie monoklonalne mogą być namnażane w kolbach do hodowli tkankowych w celu wytworzenia dużych ilości przeciwciała monoklonalnego. Następnie, gdy komórki zaczynają obumierać, przeciwciała można wytrącić z pożywki siarczanem amonu. Zwykle w roztworze przeciwciała oddziałują z wodą poprzez oddziaływania hydrofilowe. Jednak amon i siarczan to silnie naładowane jony, które oddzielają cząsteczki wody od przeciwciał, zmniejszając rozpuszczalność przeciwciał i powodując ich wytrącanie.

Aby rozpocząć, najpierw sprawdź listę materiałów i przygotuj wszystkie media, materiały eksploatacyjne i powierzchnie robocze do protokołu.

Następnie włącz łaźnię wodną i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mililitrów całkowitego RPMI do 15-mililitrowej stożkowej probówki i 15 mililitrów całkowitego RPMI do kolby do hodowli komórkowej T75 i odłóż je na bok. Zachowując ostrożność i nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, wyjąć zamrożoną fiolkę zawierającą komórki hybrydoma z magazynu ciekłego azotu. Aby zmniejszyć ciśnienie wewnątrz fiolki, należy lekko poluzować nakrętkę. Teraz ostrożnie inkubować fiolkę w łaźni wodnej, upewniając się, że nakrętka pozostaje nad powierzchnią wody, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Gdy komórki są już prawie rozmrożone, co zwykle trwa około dwóch minut, przenieś fiolkę do kaptura do hodowli tkankowej.

Następnie, przed zdjęciem nakrętki, należy przetrzeć zewnętrzną stronę fiolki 70% etanolem. Za pomocą sterylnej pipety przenieś komórki do stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów kompletnego podłoża RPMI. Następnie odwiruj probówkę przez pięć minut z prędkością 1200 obr./min. Po odwirowaniu przenieś probówkę z powrotem do kaptura na chusteczki i przetrzyj zewnętrzną część probówki etanolem. Nie naruszając osadu, wyrzucić supernatant, a następnie dodać pięć mililitrów świeżej, kompletnej pożywki RPMI i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić. Następnie przenieś komórki do kolby do hodowli komórkowej T75 i umieść kolbę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozwól komórkom osiągnąć około 80% zbieżności, co zwykle trwa około trzech dni. Zauważ, że komórki hybrydoma są nieprzylegające i będą rosły zawieszone w pożywce. Czas osiągnięcia wystarczającej konfluencji może się różnić w zależności od początkowej liczby żywych komórek i rodzaju użytej komórki hybrydoma.

Gdy komórki wystarczająco się zlewają, użyj sterylnej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść je z kolby hodowlanej do stożkowej probówki wirówkowej. Granulować komórki przez odwirowanie z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut. Gdy komórki znajdują się w wirówce, dodaj 18 mililitrów pełnego RPMI do każdej z trzech nowych kolb do hodowli komórkowych T75 i odłóż je na bok. Po odwirowaniu usuń supernatant i delikatnie ponownie zawieś osad ogniwa w sześciu mililitrach pełnego RPMI. Następnie dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej z trzech nowych kolb do hodowli komórkowych. Na koniec umieść kolby w inkubatorze ustawionym na 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza i inkubuj, aż kolby zlewają się w około 80%, przez około trzy dni.

W tym momencie komórki są gotowe do dalszego wzrostu w pożywce bez surowicy przeznaczonej dla linii komórkowych hybrydomy, takiej jak dostępna na rynku pożywka HB Basal Liquid zawierająca suplement HB101. Przenieść komórki z każdej kolby do hodowli komórkowej do stożkowych probówek wirówek, a następnie granulować komórki przez odwirowanie z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut. Teraz dodaj 230 mililitrów uzupełnionej pożywki bez surowicy HB101 do każdej z sześciu kolb do hodowli komórkowych o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych i odłóż je na bok. Po zakończeniu wirowania usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 10 mililitrach uzupełnionej pożywki HB101. Następnie do każdej kolby do hodowli komórkowej dodać pięć mililitrów zawiesiny komórek. Umieść kolby w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i kontynuuj hodowlę komórek przez około trzy tygodnie. W tym czasie komórki będą wytwarzać i uwalniać interesujące przeciwciało monoklonalne do pożywki hodowlanej, a przeciwciało będzie gotowe do oczyszczenia, gdy komórki zaczną umierać.

W celu usunięcia resztek komórkowych z pożywki hodowlanej zawierającej przeciwciała, należy wlać zawartość kolb hodowlanych do probówek z wirnikiem o stałym kącie. Umieść probówki w wirniku i upewnij się, że są odpowiednio wyważone przed odwirowaniem. Kręć rurki z prędkością 10 000 obr./min przez osiem minut. Podczas wirowania próbek umieść dwulitrową plastikową zlewkę z mieszadłem w wiaderku z lodem, a następnie umieść wiaderko z lodem na talerzu do mieszania.

Następnie przymocuj 500-mililitrową pokrywę filtra do litrowej butelki. Podłącz ten filtr górny do butelki do odkurzacza domowego za pomocą odpowiedniej rurki. Następnie wlej supernatant zawierający przeciwciało do górnej części filtra. Odwirować pozostałą pożywkę, aby oddzielić resztki komórek od supernatantu zawierającego przeciwciała. Gdy górna część filtra jest pełna supernatantu, uruchom próżnię. Następnie, gdy jednolitrowa butelka zbiorcza jest prawie pełna, zdejmij pokrywę filtra i wlej przefiltrowany supernatant do dwulitrowej zlewki na lodzie. Powtarzaj etapy filtracji, aż cały supernatant zostanie przetworzony.

Po przetworzeniu całej próbki odważyć 295 gramów siarczanu amonu na jeden litr przefiltrowanego supernatantu. Uruchom płytkę mieszającą i powoli dodawaj siarczan amonu do supernatantu w ciągu następnych kilku godzin. Zapobiega to miejscowemu wysokiemu stężeniu soli siarczanu amonu, które może powodować wytrącanie się niepożądanych białek. Po dodaniu całego siarczanu amonu przykryj zlewkę folią i przenieś ją wraz z płytką mieszającą do chłodnego pomieszczenia o temperaturze czterech stopni Celsjusza i ustaw tak, aby mieszała roztwór przeciwciała przez noc.

Następnego ranka wlej roztwór przeciwciała zawierający siarczan amonu z dwulitrowej zlewki do czystych probówek do wirnika o stałym kącie. Odwirować probówki z prędkością 6500 obr./min przez 20 minut bez przerwy, aby osadzać przeciwciało na dnie probówek. Następnie odkurzyć supernatant, uważając, aby nie zassać miękkiego osadu. Kontynuować używanie tego samego zestawu probówek do zbierania granulowanego przeciwciała z pozostałej części supernatantu zawierającego siarczan amonu. Po ostatniej aspiracji ponownie zawiesić każdą osadkę przeciwciała w około jednym mililitrze PBS.

Aby usunąć siarczan amonu z roztworu przeciwciała, najpierw przeciąć około jednego cala rurki dializacyjnej na każdy mililitr roztworu przeciwciała. Następnie przetrzyj rurkę wodą destylowaną i zawiąż węzeł na jednym końcu rurki. Napełnij rurkę wodą destylowaną, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków z węzła. Jeśli po kilku minutach nie ma wycieku, wylej wodę z rurki.

Następnie odpipetować roztwór przeciwciała do rurki. Aby odzyskać jak najwięcej przeciwciał, przepłucz probówki dodatkowymi 0,25 mililitra PBS i przenieś je również do rurki. Zabezpiecz górną część rurki jak najbliżej roztworu za pomocą klipsa do dializy. Następnie przyklej górną część rurki do zewnętrznej górnej części czterolitrowej zlewki z wypełnioną częścią rurki zwisającą do zlewki. Teraz przenieś zlewkę do chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza i umieść ją na talerzu mieszającym. Napełnij zlewkę do góry PBS i dodaj mieszadło. Pozostaw probówkę i roztwór do mieszania przez noc przez około osiem godzin. Następnego ranka wymień PBS w zlewce na świeży PBS, a następnie pozostaw zlewkę do ponownego wymieszania na około osiem godzin. Później tego samego wieczoru powtórz ten proces po raz ostatni. Rano otwórz rurkę dializacyjną, a następnie przenieś roztwór przeciwciał z rurki do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Aby usunąć wszelkie środki strącające, które mogły powstać podczas dializy, należy odwirowywać probówki przez pięć minut z prędkością 1200 obr./min. Na koniec przenieść supernatant do świeżych probówek.

Aby określić ilościowo stężenie przeciwciał, najpierw wykonaj 20-krotne rozcieńczenie, dodając pięć mikrolitrów z podwielokrotności przeciwciała do 95 mikrolitrów PBS. Następnie pipetować rozcieńczone przeciwciało do kuwety i za pomocą spektrofotometru zarejestrować stężenie przy 280 nanometrach. Następnie oblicz stężenie przeciwciał, korzystając z pokazanego wzoru. Na koniec oznaczyć fiolki z zakrętką nazwą przeciwciała, stężeniem, datą przygotowania oraz, w stosownych przypadkach, numerem serii i nazwiskiem eksperymentatora, a następnie podać porcję przeciwciała do oznakowanych fiolek z zakrętką. Można je przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, dopóki nie będą potrzebne.

Przykładowe plony przy użyciu linii hybrydoma 120G8 anty-mysi CD317 lub PDCA-1 wahały się od 44 do 99,6 miligramów, co zwykle daje średnio 67,3 miligrama. Ważne jest, aby pamiętać, że każda seria produkcyjna z tą samą linią komórkową hybrydoma może nieznacznie różnić się ilością przeciwciała monoklonalnego dostępnego na końcu.