Analiza cyklu komórkowego: ocena proliferacji limfocytów T CD4 i CD8 po stymulacji za pomocą barwienia CFSE i cytometrii przepływowej

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie dokładnie wytrzyj je do sucha.
3. Przygotuj 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Korzystając z systemu dostarczania dwutlenku węgla, poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zabezpiecz uśpioną mysz na płytce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię podłużną za pomocą nożyczek i kleszczy.
2. Za pomocą kleszczy przesuń jelita i żołądek po prawej stronie brzucha, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka.
3. Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek odpornościowych

1. Umieść śledzionę na sitku o wielkości 40 μm na tej samej szalce Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby ją oddzielić.
2. Przenieś zdysocjowaną śledzionę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i odrzucić supernatant omijając osad.
4. Zawiesić osad w 2 ml octanu potasu w celu lizy erytrocytów. Odczekaj 2 minuty, a następnie uzupełnij objętość do 15 ml za pomocą HBSS 2% FCS.
5. Ponownie odwirować probówkę przy 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS.
6. Policz komórki za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do 10⁷ komórek/ml, używając odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Barwienie CFSE i stymulacja limfocytów T

1. Rozprowadź 10⁷ izolowanych komórek śledziony/probówkę w 4 probówkach (15 ml probówek, oznaczonych od 1 do 4)