5.10: Analiza cyklu komórkowego: ocena proliferacji limfocytów T CD4 i CD8 po stymulacji za pomocą barwienia CFSE i cytometrii przepływowej

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie dokładnie wytrzyj je do sucha.
3. Przygotuj 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Korzystając z systemu dostarczania dwutlenku węgla, poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zabezpiecz uśpioną mysz na płytce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię podłużną za pomocą nożyczek i kleszczy.
2. Za pomocą kleszczy przesuń jelita i żołądek po prawej stronie brzucha, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka.
3. Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek odpornościowych

1. Umieść śledzionę na sitku o wielkości 40 μm na tej samej szalce Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby ją oddzielić.
2. Przenieś zdysocjowaną śledzionę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i odrzucić supernatant omijając osad.
4. Zawiesić osad w 2 ml octanu potasu w celu lizy erytrocytów. Odczekaj 2 minuty, a następnie uzupełnij objętość do 15 ml za pomocą HBSS 2% FCS.
5. Ponownie odwirować probówkę przy 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS.
6. Policz komórki za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do 10⁷ komórek/ml, używając odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Barwienie CFSE i stymulacja limfocytów T

1. Rozprowadź 10⁷ izolowanych komórek śledziony/probówkę w 4 probówkach (15 ml probówek, oznaczonych od 1 do 4)

W przypadku większości badań immunologicznych pomiar proliferacji komórek odpornościowych jest kluczowym krokiem i powszechnie stosowana jest metoda oparta na barwniku fluorescencyjnym CFSE. Prawidłowy podział komórek jest ważny dla komórek odpornościowych, ponieważ reguluje zarówno poziom, jak i swoistość odpowiedzi immunologicznej. Na przykład limfocyty T namnażają się w celu identyfikacji i zabijania komórek rakowych, a limfocyty B ulegają podziałowi komórkowemu w celu wytworzenia określonych przeciwciał. Ogólne założenie testu CSFE polega na barwieniu komórek zielonym barwnikiem fluorescencyjnym CFSE, który wnika do żywych komórek i stabilnie wiąże się z białkami wewnątrz, co skutkuje trwałym znakowaniem. W rezultacie, gdy komórka rodzicielska zawierająca barwnik dzieli się, każda komórka potomna otrzymuje połowę fluorescencji z komórki rodzicielskiej.

Proces ten jest kontynuowany w kolejnych podziałach, przy czym intensywność barwnika stopniowo maleje z każdym podziałem. W pożądanym punkcie końcowym intensywność fluorescencji każdej komórki mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej. Dane te są następnie wykorzystywane do ilościowego określenia liczby i wzorca podziałów, przez które przeszły komórki. Jak pokazano tutaj, populacja komórek o najwyższej fluorescencji pochodzi z pokolenia rodzicielskiego. Drugi co do wysokości należy do drugiego pokolenia i tak dalej. Liczba pików określa liczbę podziałów komórek.

Ponadto, jeśli używane są pierwotne komórki odpornościowe, określone populacje komórek, takie jak na przykład limfocyty T, mogą być znakowane różnokolorowym barwnikiem fluorescencyjnym wraz z CFSE i jednocześnie identyfikowane za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej. Nowe dane można wykreślić na tym samym wykresie, teraz pokazującym subpopulację limfocytów T o różnej intensywności barwienia CFSE, za pomocą którego można szczegółowo analizować szybkość proliferacji limfocytów T. Ten film przedstawia protokół barwienia CFSE mysich splenocytów, które są stymulowane przeciwciałem anty-CD3. Następnie następuje barwienie w celu znakowania limfocytów T i cytometria przepływowa w celu śledzenia ich proliferacji komórek.

Na początek załóż odpowiednią odzież ochronną i rękawice laboratoryjne. Następnie umyj kleszcze i nożyczki preparacyjne najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie wytrzyj je do sucha czystym ręcznikiem papierowym. Przygotuj 50 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS z 2% stężeniem płodowej surowicy cielęcej lub FCS, łącząc jeden mililitr FCS z 49 mililitrami HBSS w 50-mililitrowej probówce. Wymieszać, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół około 10 razy. Następnie wyizoluj mysie komórki śledziony, jak pokazano w protokole wideo do izolacji FACS limfocytów B śledziony.

Oznacz cztery 15-mililitrowe probówki od jednej do czterech i dodaj jeden razy 10 do siódmych izolowanych komórek śledziony. Następnie dodaj trzy mililitry HBSS 2% FCS do każdej probówki. Następnie odpipetować jeden mikrolitr pięcioma mikromolowymi estrami sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) do każdej probówki. Inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 minut. Komórki w probówkach pierwszej i drugiej nie będą stymulowane. Zostaną one wykorzystane do ujawnienia podstawowego poziomu proliferacji limfocytów T CD4 i CD8 śledziony.

Odpipetować 10 mililitrów HBSS 2% FCS do tych probówek. Probówki trzecia i czwarta będą stymulowane przeciwciałem anty-CD3 w celu zaobserwowania wpływu na cykl komórkowy. Dodaj 10 mililitrów HBSS 2% FCS i przeciwciała anty-CD3 w końcowym stężeniu 2,5 mikrograma na mililitr do probówek trzeciej i czwartej. Następnie odwiruj wszystkie probówki o sile 370 x g przez siedem minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatanty. Ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach HBSS 2% FCS i odpipetować powstałe roztwory do oddzielnych studzienek na sześciodołkowej płytce. Ostrożnie oznacz tabliczkę od jednego do czterech, aby śledzić tożsamość próbki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez trzy dni.

Trzeciego dnia dodaj dwa mililitry HBSS 2% FCS do studzienek pierwszej i trzeciej, które powinny zawierać komórki z probówek pierwszej i trzeciej. Energicznie pipetować w górę i w dół, a następnie przenieść próbki do oznakowanych pięciomililitrowych probówek FACS. Umieścić sześciodołkową płytkę z powrotem w inkubatorze. Te pozostałe komórki z dołków drugiego i czwartego zostaną przeanalizowane w piątym dniu w celu zbadania długoterminowego wpływu stymulacji na cykl komórkowy. Odwirować probówki o sile 370 x g przez siedem minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza, a następnie wyrzucić supernatanty. Teraz dodaj 100 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do każdej probówki. Inkubuj probówki przez 20 minut na lodzie w ciemności. Następnie dodaj jeden mililitr HBSS 2% FCS do każdej probówki i odwiruj probówki o sile 370 x g przez siedem minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatanty. Ponownie zawiesić granulki w 200 mililitrach HBSS 2% FCS i dobrze wymieszać. Przenieś zawieszone granulki do nowych oznaczonych probówek FACS.

Następnie oceń proliferację limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano w protokole FACS. Bramkować komórki, aby wybrać limfoidalne komórki CD3-dodatnie i rozróżnić komórki CD4-dodatnie i CD8-dodatnie, a następnie zarejestrować dane dla probówek pierwszej i trzeciej. W piątym dniu powtórz proces barwienia komórek z komórkami z pozostałych dwóch dołków sześciodołkowej płytki.

Przeanalizujemy wpływ stymulacji CD3 na cykl komórkowy komórek CD4 i CD8-dodatnich po trzech dniach i pięciu dniach od stymulacji. Aby rozpocząć, kliknij ikonę FlowJo i przeciągnij pliki do okna Wszystkie próbki. Kliknij dwukrotnie plik dla niestymulowanych komórek zebranych trzeciego dnia, aby wyświetlić wykres punktowy z rozproszeniem do przodu na osi y i rozproszeniem bocznym na osi x. Kliknij wielokąt, aby zakreślić populacje limfocytów na podstawie ich morfologii. W oknie identyfikacji subpopulacji nazwij limfocyty populacji i kliknij przycisk OK. Następnie kliknij dwukrotnie zakreśloną populację i w nowym oknie wybierz Thy1.2 na osi y i CD3 na osi x. Następnie kliknij wielokąt, aby zakreślić podwójnie dodatnie komórki CD3 i Thy1.2. W nowym oknie identyfikacji subpopulacji nazwij populację T-Cell i kliknij OK. Następnie kliknij dwukrotnie zakreśloną populację. W nowym oknie wybierz CD4 na osi y i CD8 na osi x. Następnie kliknij wielokąt, aby zakreślić populację CD4-dodatnią. W nowym oknie identyfikacji subpopulacji nazwij populację limfocytów T CD4 i kliknij przycisk OK. Teraz kliknij wielokąt, aby zakreślić populację CD8-dodatnią. W nowym oknie identyfikacji subpopulacji nazwij populację CD8 T-Cell i kliknij OK. Powtórz te kroki z innymi plikami.

Aby określić częstotliwości dzielenia i niedzielenia komórek, najpierw zwizualizuj populacje komórek, klikając Edytor układu. Następnie przeciągnij limfocyty T CD4 i limfocyty T CD8 z każdej z czterech probówek do okna Wszystkie próbki. Pojawią się wykresy przedstawiające Twoje populacje. Dla każdej probówki kliknij dwukrotnie wykres punktowy dla limfocytów T CD8 i wybierz Histogram w obszarze Definicja wykresu, aby wyświetlić wyniki. Wybierz CFSE jako parametr, aby porównać populacje komórek stymulowanych i niestymulowanych w każdym punkcie czasowym. Komórki niedzielące się utrzymują wyższy poziom CFSE, podczas gdy komórki proliferujące dzielą zawartość CFSE na komórki dzielące.

Teraz, naciskając klawisz Shift, kliknij dwukrotnie histogram. W nowym oknie kliknij zakres i wybierz zakres CFSE odpowiadający najwyższemu szczytowi. W oknie identyfikacji subpopulacji nazwij populację Niedzielące się limfocyty T CD8 i oznacz populację Dzielące się komórki CD8. Teraz powtórz czynność, aby wybrać dzielące się i niedzielące się limfocyty T CD4 w każdej probówce. Aby sprawdzić częstotliwość dzielenia komórek CD3-dodatnich, kliknij Edytor tabel. Następnie przeciągnij interesujące nas populacje, Podział limfocytów T CD8 i Podział limfocytów T CD4, do tabeli. W menu Statystyka wybierz opcję Częstotliwość limfocytów T. Następnie kliknij Utwórz tabelę, aby wyświetlić częstotliwość w nowej tabeli.