Mikroskopia i barwienie: barwienie metodą Grama, kapsułki i śródspor

1. Barwienie metodą Grama

1. Ustawiać
   1. Noś rękawice i niepalny fartuch laboratoryjny, ponieważ barwniki plamią ręce i odzież.
   2. Palnik Bunsena służy do utrwalania bakterii na gorąco. Zachowaj ostrożność podczas pracy z płomieniem; związać długie włosy.
   3. Stosowane będą dostępne na rynku odczynniki do barwienia metodą Grama.
   4. Wyczyść szkiełka mikroskopowe chusteczkami laboratoryjnymi.
2. Protokół
   1. Odmierzyć pipetą 10 μl roztworu soli fizjologicznej lub bulionu kulturowego buforowanego fosforanem na szkiełko podstawowe wody.
   2. Rozsmaruj kolonię bakterii w płynie, aby uzyskać cienką, równą warstwę.
      Uwaga: Nie używaj kultur starszych niż 24 godziny, ponieważ zbyt stare bakterie mogą mieć zmiany w ścianie komórkowej, co wpłynie na wyniki barwienia metodą Grama (1, 4).
   3. Całkowicie sucha zjeżdżalnia.
   4. Po wysuszeniu bakterie utrwalają na gorąco, przechodząc przez płomień (bakterią stroną do góry) 4-5 razy.
      Uwaga: Nie trzymaj szkiełka w płomieniu zbyt długo, bo możesz zniekształcić komórki bakteryjne (1).
   5. Pracując nad zlewem, przytrzymaj szkiełko poziomo i nałóż Gram's Crystal Violet, aby całkowicie pokryć bakterie utrwalone termicznie, odstawić na 45 sekund.
   6. Opłucz nadmiar Crystal Violet, trzymając szkiełko pod kątem i spryskując delikatną, pośrednią strugę wody na szkiełko i pozwalając mu spłynąć po poplamionych bakteriach. Nie spryskuj wodą bezpośrednio bakterii.
   7. Ponownie przytrzymując szkiełko, nałóż roztwór jodu Grama, aby całkowicie pokryć poplamione bakterie, odstawić na 45 sekund.
   8. Wypłucz nadmiar jodu, jak w kroku 1.2.6 powyżej.
   9. Trzymając szkiełko pod kątem, dodaj kilka kropli odbarwiacza na szkiełko, pozwalając mu spływać po poplamionych bakteriach, aż spływ będzie czysty; Zazwyczaj około 5 sekund. Natychmiast spłukać wodą, jak w kroku 1.2.6 powyżej.
      Uwaga: To jest krytyczny krok w protokole. Pozostawienie, aby dekoloryzator spływał zbyt długo lub niewystarczająco długo, spowoduje fałszywe barwienie metodą Grama (4).
   10. Ponownie przytrzymując szkiełko, nałóż Safranin Grama, aby całkowicie pokryć bakterie, odstawić na 45 sekund.
   11. Wypłukać nadmiar Safraniny, jak w kroku 1.2.6 powyżej.
   12. Osusz, nie trzeć, nadmiar wody ze szkiełka za pomocą ręczników papierowych.
   13. Zbadaj szkiełko podstawowe pod mikroskopem za pomocą zanurzenia w oleju z obiektywem 100X.
3. Wyniki i analiza danych
   1. Bakterie Gram-dodatnie będą barwić się na fioletowo.
   2. Bakterie Gram-ujemne zabarwią się na czerwono.
   3. Widoczny będzie kształt (ziarniaki, pałeczki, zakrzywione pręciki, spirale) bakterii.
   4. Widoczne będzie ułożenie komórek bakteryjnych (pojedyncze komórki, sparowane komórki, łańcuchy komórek, klastry, zgrupowania).

2. Barwienie kapsułek

1. Ustawiać
   1. Noś rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ barwniki plamią ręce i odzież.
   2. Aby przygotować 1% roztwór fioletu krystalicznego, wymieszaj 0,25 grama fioletu krystalicznego z 25 ml wody destylowanej, aż do rozpuszczenia.
   3. Aby przygotować 1% roztwór czerwieni kongijskiej, wymieszaj 0,25 grama czerwieni kongijskiej z 25 ml wody destylowanej, aż do rozpuszczenia.
   4. Wyczyść szkiełka chusteczkami laboratoryjnymi.
2. Protokół
   1. Umieść 10 μl czerwieni Kongo na szkiełku.
   2. Za pomocą końcówki pipety rozsmaruj kolonię bakterii w barwniku, aby uzyskać cienką, równą warstwę.
   3. Całkowicie suche na powietrzu szkiełko z mieszaniną barwników i komórek, 5-7 minut.
      Uwaga: Nie podgrzewaj utrwalania, ponieważ ogrzewanie może odwodnić lub zniekształcić kapsułkę.
   4. Zalej rozmaz 1% fioletem krystalicznym przez 1 minutę.
   5. Spłucz nadmiar plamy, trzymając szkiełko pod kątem i spryskując delikatną, pośrednią strugę wody na szkiełko i pozwalając mu spłynąć po poplamionych bakteriach. Nie spryskuj wodą bezpośrednio bakterii.
   6. Trzymaj szkiełko pod kątem 45 stopni, aż całkowicie wyschnie.
   7. Zbadaj rozmaz pod mikroskopem pod zanurzeniem w oleju za pomocą obiektywu 100X.
3. Wyniki i analiza danych
   1. Komórki bakteryjne zabarwią się na fioletowo.
   2. Tło slajdu poplami się na ciemno.
   3. Kapsułki będą stanowić wyraźną aureolę wokół komórek na ciemnym tle.

3. Barwienie endospor (metoda Schaeffera-Fultona)

1. Ustawiać
   1. Nosić rękawice i niepalny fartuch laboratoryjny, aby chronić ręce i odzież przed barwnikami i płomieniem.
   2. Palnik Bunsena służy do podgrzewania bakterii. Zachowaj ostrożność podczas pracy z płomieniem; związać długie włosy.
   3. Aby przygotować 0,5% roztwór zieleni malachitowej, wymieszaj 0,125 grama zieleni malachitowej z 25 ml wody destylowanej, aż się rozpuści.
   4. Należy użyć dostępnego w handlu roztworu odczynnika Safranin firmy Gram.
   5. Wyczyść szkiełka chusteczkami laboratoryjnymi.
2. Protokół
   1. Odmierzyć pipetą 10 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub bulionu hodowlanego na szkiełko.
   2. Stosując technikę aseptyczną, rozsmaruj kolonię bakteryjną w płynie, aby uzyskać cienką, równą warstwę.
      Uwaga: Przetrwalniki na ogół nie tworzą się w młodych komórkach; Dlatego zaleca się, aby kultura miała od 18 do 36 godzin (9).
   3. Całkowicie sucha zjeżdżalnia.
   4. Utrwal ciepło, przepuszczając szkiełko (bakterią stroną do góry) przez płomień 4-5 razy.
   5. Aby pomóc w zatrzymaniu barwnika, umieść kawałek papieru do soczewek (przycięty tak, aby pasował do rozmazu bakteryjnego) na utrwalonym termicznie rozmazie.
   6. Nasącz papier do soczewek roztworem zieleni malachitowej.
   7. Umieść szkiełko na zlewce z wrzącą wodą na gorącej płycie i gotuj na parze przez 5 minut, utrzymując wilgotny papier do soczewek, dodając więcej barwnika kropla po kropli na raz, w razie potrzeby.
      Uwaga: Unikaj przegrzania i wysuszenia roztworu barwnika.
   8. Wyjmij szkiełko z zlewki, wyjmij i wyrzuć papier do soczewek, pozostaw szkiełko do ostygnięcia na 2 minuty.
   9. Trzymając szkiełko pod kątem, dokładnie spłucz, spryskując delikatną, pośrednią strużkę wodą na szkiełko, pozwalając jej spłynąć po rozmazaniu się.
   10. Trzymając poziom szkiełka, rozsmarować zalać Safraniną, odstawić na 1 minutę.
   11. Wypłukać nadmiar Safraniny, jak w kroku 3.2.9 powyżej.
   12. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
   13. Zbadaj szkiełko pod mikroskopem w zanurzeniu w oleju z obiektywem 100X.
3. Wyniki i analiza danych
   1. Zarodniki zabarwią się na zielono.
   2. Komórki wegetatywne zabarwią się na czerwono.
   3. Niektóre komórki wegetatywne będą zawierać zarodniki; Komórki zabarwią się na czerwono, podczas gdy przetrwalniki zabarwią się na zielono.