Name: Drukowanie mikrokontaktowe białek w biologii komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj mikrokontaktowe drukowanie białek w biologii komórki. Ta technika umożliwia tworzenie precyzyjnych wzorów fibronektyny na szkle do badania zachowań komórkowych w kontrolowanych środowiskach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie roztworów i materiałów
Powyższe kroki należy wykonać z kilkudniowym wyprzedzeniem.
<ol>
	<li>Szklane szkiełka coverglass. Szkiełka oczyszczono poprzez 10-minutowe zanurzenie w roztworze detergentu Linbro 7X i wody w stosunku 1:3, podgrzewanym z mieszaniem do uzyskania przejrzystości. Szkiełka płukano obficie wodą dejonizowaną, a następnie wypalano w temperaturze 450°C przez 6 godzin. Proces ten ułatwiło umieszczenie szkiełek w ceramicznych kasetach do barwienia (patrz: Odczynniki).</li>
	<li>Roztwór białka do stemplowania. Fibronektynę zrekonstytuowano zgodnie z instrukcją producenta do postaci roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/ml.</li>
</ol>
2. Odlewanie stempli z matrycy topologicznej
Te kroki można wykonać z kilkudniowym wyprzedzeniem. Przechowywać stemplowane próbki wzorem do góry w przykrytym naczyniu, na przykład w naczyniu do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Usuń luźny kurz z matrycy, używając strumienia sprężonego, filtrowanego powietrza lub gazu obojętnego.</li>
	<li>Umieść matrycę stroną z wzorem do góry na dnie plastikowego naczynia nieco większego niż sama matryca. Do tego celu odpowiednie są naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 lub 100 mm.</li>
	<li>W polistyrenowej probówce do wirowania o pojemności 50 ml połącz komponenty Sylgard w stosunku utwardzacza do bazy elastomerowej wynoszącym 1:10 wagowo. Wymieszaj dokładnie za pomocą plastikowego przyrządu, np. jednorazowej pipety. Przygotuj co najmniej 0,2 ml elastomeru na centymetr kwadratowy powierzchni naczynia.</li>
	<li>Wirować probówkę 50 ml przy 300 G przez 5 min, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wylej elastomer na matrycę, a następnie umieść go w eksykanie pod próżnią na 30 minut.</li>
	<li>Utwardzaj elastomer w piecu w temperaturze 65°C przez co najmniej 2 godziny. Utwardzanie w wyższych temperaturach i przez dłuższy czas prowadzi do uzyskania sztywniejszego elastomeru. Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Oddziel arkusz stempli od matrycy.</li>
</ol>
3. Mikrodyruk fibronektyny na szkle
<ol>
	<li>Wytnij pojedynczą stempelkę. Na początek najłatwiej zastosować stempelki o powierzchni od 4 mm X 4 mm do 1 cm X 1 cm i grubości 1 – 2 mm. Połóż stempelkę stroną z wzorem do góry na szkiełku przedmiotowym lub małym plastikowym naczyniu.</li>
	<li>Umieść stempelkę w oczyszczaczu plazmowym i poddaj procesowi w próżni przez 30 sekund. Oczyszczacz plazmowy firmy Harrick Scientific (patrz Equipment), ustawiony na maksymalną moc, sprawi, że powierzchnia PDMS stanie się hydrofilowa. Dłuższy czas obróbki prowadzi do pękania elastomeru.</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór fibronektyny wodą dejonizowaną do stężenia stemplowania wynoszącego 50 µg/ml.</li>
	<li>Nanieś małą kroplę (10 – 50 µl) roztworu do stemplowania na stempelkę. Rozprzestrzeni się on po hydrofilowej powierzchni. Dodaj tylko tyle roztworu, aby kropla pokryła stempelkę, ale nie wypływała poza jej krawędzie. Pozostaw białko do adsorpcji na stempelce przez 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą chusteczki Kimwipe® lub innej czystej papierowej serwetki odsącz większość roztworu białka ze stempelki, nie dotykając obszaru z wzorem.</li>
	<li>Osusz pozostały na stempelce roztwór strumieniem czystego, suchego gazu obojętnego, np. azotu.</li>
	<li>Za pomocą pęsety zdejmij stempelkę ze szkiełka, odwróć ją i dociśnij do oczyszczonego szkiełka nakrywkowego (powierzchni, na której ma powstać wzór). Połóż na górze obciążnik, aby zapewnić dobry kontakt. Konkretna masa obciążnika zapewniająca najlepsze stemplowanie zależy od rozmiaru stempelki i wzoru; zacznij od obciążnika 5 g i dostosowuj go między kolejnymi próbami. Pozostaw stempelkę w kontakcie z powierzchnią przez 1 minutę.</li>
	<li>Ostrożnie rozdziel elementy i oddziel stempelkę od szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Intensywnie wypłucz wzorowane szkiełko nakrywkowe w PBS, a następnie w wodzie dejonizowanej, aby usunąć białko, które nie zaadsorbowało się na powierzchni. Osusz szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu.</li>
</ol>
 Reprezentatywne wyniki
Drukowanie mikroredukcyjne (microcontact printing) jest potężną metodą wzorowania cząsteczek na powierzchniach. Proces ten pozwala na tworzenie struktur o wymiarach od kilkunastu mikrometrów do kilkuset nanometrów; na rys. 1A logotypy po lewej stronie mają wysokość 200 µm, natomiast zielone kropki przedstawione na rys. 1B mają średnicę 1 µm i są rozmieszczone w odstępach 4 µm, mierzonych od środka do środka. Rys. 1B ilustruje również istotną właściwość drukowania mikroredukcyjnego, mianowicie to, że jest to proces addytywny. Wielokrotne cykle drukowania mikroredukcyjnego można zastosować na jednej powierzchni w celu stworzenia systemów wieloskładnikowych3.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej; analiza ekspresji białek; wizualizacja za pomocą markerów optycznych." src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/figure_a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek A"> <img alt="Schemat kryształu fotonicznego z wzorem zielonych i czerwonych kropek do analizy emisji optycznej." src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek B">

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Proces mikrodyruków kontaktowych jest koncepcyjnie prosty i bardzo niezawodny, znajdując zastosowanie w nanoszeniu wzorów z szerokiej gamy cząsteczek na różnorodne podłoża. Niemniej jednak proces ten wciąż w pewnym stopniu opiera się na doświadczeniu i intuicji. Na jakość stemplowania wpływają: konkretna geometria tworzonego wzoru, rodzaj nanoszonego białka, przyłożona siła nacisku oraz warunki powlekania i stemplowania. Na przykład zbyt mały nacisk przy dużych elementach wzoru często prowadzi do powstania przerw, co wid...

<table><tbody><tr><td>Oczyszczacz plazmowy</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania białek</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Statyw do barwienia</td><td>Odczynnik</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zakrywkowe</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Odczynnik</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Siatka dyfrakcyjna</td><td>Odczynnik</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrodruk białek w biologii komórki

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

Zdolność do nanoszenia białek i innych biomolekuł w określonym wzorze na podłoża jest istotna dla odwzorowania złożoności przestrzennej środowiska pozakomórkowego. Opracowanie druku mikrokontaktowego przez grupę Whitesidesa (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) w połowie lat 90. zrewolucjonizowały tę dziedzinę, udostępniając techniki mikroelektroniki i mikrofabrykacji laboratoriom koncentrującym się na naukach o życiu. Pierwsze implementacje tej metody wykorzystywały stemple z polidimetylosiloksanu (PDMS) do tworzenia wzorów z funkcjonalizowanych substancji chemicznych na powierzchniach materiałów1Od tego czasu opracowano szereg innowacyjnych podejść do rozmieszczania innych cząsteczek, w tym białek2Niniejszy film demonstruje podstawowy proces tworzenia stempli z PDMS oraz ich wykorzystanie do wzorowania białek, ponieważ kroki te są trudne do precyzyjnego opisania słownie. W ramach konkretnego przykładu wzorowania skupiamy się na nanoszeniu białka macierzy pozakomórkowej, fibronektyny, na szklane szkiełka podstawowe.
Ważnym elementem procesu mikrodruku kontaktowego jest matryca topologiczna, z której odlewa się stemple; obszary wypukłe i wklęsłe matrycy są odwzorowywane w stemplu i definiują końcowy wzór. Zazwyczaj matryca składa się z wafla krzemowego pokrytego fotorezystem, a następnie wzorowanego metodą fotolitografii, tak jak zrobiono to w tym przypadku. Tworzenie matryc zawierających konkretny wzór wymaga specjalistycznego sprzętu i najlepiej jest podejść do tego w konsultacji z centrum lub zakładem mikrofabrykacji. Niemniej jednak, niemal każdy podłoże z określoną topologią może służyć jako matryca, np. plastikowe siatki dyfrakcyjne (patrz Odczynniki dla jednego z przykładów), a takie przypadkowe matryce zapewniają łatwo dostępne, proste wzory. Niniejszy protokół rozpoczyna się od momentu posiadania gotowej matrycy.

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Zdolność do tworzenia wzorów z białek i innych biomolekuł na podłożach jest istotna dla odwzorowania złożoności przestrzennej środowiska zewnątrzkomórkowego. ...

Mikrodruk kontaktowy jest wykorzystywany do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów w celu odtworzenia złożoności środowisk pozakomórkowych. Aby rozpocząć proces mikrodruku kontaktowego, należy stworzyć matrycę topologiczną, a następnie za pomocą litografii miękkiej odlać z niej stempel z Sylgardu. Stempel może zostać pokryty białkiem, a następnie wykorzystany do przeniesienia białek na nową powierzchnię, do której mogą przytwierdzać się komórki.Cześć, nazywam się Chen. Pracuję w laboratorium dr. Lance'a Campa w dziale inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Columbia. Cześć, jestem GT z Wydziału Inżynierii Mechanicznej.Witam, nazywam się Lance Kem i reprezentuję Katedrę Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Columbia. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania reakcji komórek na złożone układy białek w ich środowisku zewnątrzkomórkowym. Metoda ta została opracowana w połowie lat 90. przez zespół George'a Whitesidesa i stała się powszechnie stosowanym oraz wartościowym narzędziem.Istnieje wiele wariantów tej techniki, lecz dziś G i Co U zaprezentują podstawowy proces mikro druku kontaktowego. Przejdźmy zatem do realizacji. W przypadku mikro

microcontact-printing-of-proteins-for-cell-biology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Druk mikrokontaktowy białek dla biologii komórkowej

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Opis metod wykorzystanych do przekształcenia drukarki HP DeskJet 500 w biodrukarkę. Drukarka jest zdolna do przetwarzania żywych komórek, co powoduje powstanie przejściowych porów w błonie. Pory te mogą być wykorzystane do wprowadzania małych cząsteczek, w tym fluorescencyjnej G-aktyny, do wydrukowanych komórek.

Tworzenie przejściowych porów w błonie komórkowej przy użyciu standardowej drukarki atramentowej

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach.  Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie.  Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Poznaj mikrokontaktowe drukowanie białek w biologii komórki. Ta technika umożliwia tworzenie precyzyjnych wzorów fibronektyny na szkle do badania zachowań komórkowych w kontrolowanych środowiskach.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Przeglądaj więcej filmów