Name: Fotoindukowane sieciowanie białek niemodyfikowanych (PICUP) stosowane do peptydów amyloidogennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę PICUP do analizy oligomerów peptydów amyloidogennych. Technika fotoindukowanego sieciowania umożliwia badanie dystrybucji wielkości oligomerów białkowych kluczowych dla rozwoju chorób neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez granty AG027818 i AG030709 z NIH/NIA, 2005/2E z Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 z Alzheimer Association oraz 07-65798 z California Department of Public Health.

1. Przygotowanie peptydów
<ol>
<li>Odważ około 100–200 μg liofilizowanego peptydu za pomocą mikrowagi i przenieś go do oznakowanych, powlekanych silikonem, niskoadsorpcyjnych probówek do wirówek. W niniejszej procedurze stosujemy ludzkie sekwencje Aβ40, Aβ42, kalcytoniny oraz GRF.</li>
<li>Stosujemy peptydy poddane wstępnej obróbce 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolem (HFIP), aby uzyskać jednorodne preparaty wolne od agregatów. Krok ten jest niezbędny, ponieważ wcześniej powstałe agregaty indukują szybką agregację białek amyloidogennych, co prowadzi do niskiej powtarzalności między doświadczeniami5. Do uzyskania preparatów wolnych od agregatów dla metody PICUP można również zastosować inne metody, takie jak filtracja i SEC6.</li>
<li>Aby poddać peptydy obróbce HFIP, schłodź pojemnik z HFIP w lodzie wewnątrz dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony (HFIP jest lotny i toksyczny). Chłodzenie butelki o pojemności 250 ml trwa zazwyczaj 10–15 min. Dodaj HFIP do uprzednio schłodzonych probówek zawierających liofilizaty peptydów, aby uzyskać nominalne stężenie peptydu 0,5 mM.</li>
<li>Poddaj roztwory peptydów sonikacji w kąpieli wodnej przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Delikatnie wymieszaj na wortexie i inkubuj probówki przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Schłodź probówki w lodzie (przez 1 min), a następnie podziel roztwory na alikwoty o objętości 10–50 μl w oznakowanych, niskoadsorpcyjnych probówkach o pojemności 0,6 ml.</li>
<li>Usuń HFIP poprzez odparowanie pod delikatnym strumieniem azotu lub pozostaw otwarte probówki w dygestorium przez noc. W przypadku odparowywania nocnego umieść otwarte probówki w statywie i przykryj je dużym arkuszem chusteczek Kimwipes, aby zapobiec zanieczyszczeniu kurzem i cząstkami.</li>
<li>Wysusz pozostały HFIP in vacuo w liofilizatorze lub koncentratorze odśrodkowym przez 30 min, bądź w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej przez 2 h. Produktem końcowym będzie film peptydowy na dnie probówek do wirówek. Po prawidłowym wysuszeniu probówki mogą być przechowywane szczelnie przez dłuższy czas (miesiące) w temperaturze −20 lub −80 °C.</li>
</ol>
2. Rozpuszczanie peptydów traktowanych HFIP i fotousieciowanie
<ol>
<li>Przed rozpuszczeniem peptydów traktowanych HFIP w celu przeprowadzenia reakcji sieciowania należy przygotować odczynniki sieciujące i gaszące.</li>
<li>Odważyć nadsiarczan amonu (APS, Mr 228.2 g/mol) i przygotować roztwór 20 mM w 10 mM fosforanie sodu, pH 7.4. Mieszać za pomocą wortexa do momentu uzyskania przejrzystego roztworu.</li>
<li>Przygotować roztwór 1 mM sześcionawodnika dichlorochloreku tris(2,2-bipyrydylu)rutenu(II) (RuBpy, Mr 748.63 g/mol) w 10 mM fosforanie sodu, pH 7.4. Mieszać za pomocą wortexa i zweryfikować całkowite rozpuszczenie. Chronić probówkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
<li>Do analizy SDS-PAGE po sieciowaniu wygodnym odczynnikiem gaszącym jest 5% β-merkaptoetanol w 2× buforze do próbek SDS-PAGE. Alternatywnie można zastosować 1 M ditiotreitol (DTT, Mr 154.5 g/mol) w wodzie dejonizowanej lub odpowiednim buforze.</li>
<li>Filmy peptydowe traktowane HFIP rozpuszcza się najpierw w rozcieńczonym NaOH, a następnie dodaje bufor fosforanowy sodu, aby uzyskać stężenie peptydów ok. 30 μM. Do probówki zawierającej film peptydowy dodać 60 mM NaOH, a następnie wodę dejonizowaną w taki sposób, aby NaOH i woda stanowiły odpowiednio 10% i 45% objętości końcowej. Zeskrobać film peptydowy z wewnętrznych ścianek probówki do mikrocentryfugi za pomocą końcówki pipety, wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie sonikować przez 5 min w kąpieli ultradźwiękowej.</li>
<li>Dodać 45% 20 mM fosforanu sodu, pH 7.4, wymieszać przez pipetowanie i wirować przy 16,000 g przez 10 min. Odstawić alikwoty niesieciowanych peptydów wymieszanych z odczynnikiem gaszącym jako kontrole negatywne.</li>
<li>Ustawić opóźnienie migawki aparatu na 1 s. Przy dłuższym czasie naświetlania intensywne reakcje rodnikowe mogą prowadzić do degradacji białek. Napiąć migawkę aparatu. Czas naświetlania może wymagać optymalizacji podczas stosowania tej metody z nowym białkiem.</li>
<li>Typową reakcję PICUP przeprowadza się w objętości reakcyjnej 20 μl. Przenieść 18 μl roztworu peptydów do cienkościennej, przezroczystej probówki PCR o pojemności 0.2 ml.</li>
<li>Do roztworu peptydów dodać 1 μl RuBpy, a następnie 1 μl APS i wymieszać odczynniki poprzez pipetowanie (końcowe stężenia RuBpy i APS w mieszaninie reakcyjnej wyniosą odpowiednio 0.05 i 1 mM).</li>
<li>Szybko umieścić probówkę reakcyjną w szklanej fiolce o pojemności 1.8 ml. Umieścić fiolkę w miechu zamocowanym z przodu korpusu aparatu. Założyć osłonę obiektywu i nacisnąć migawkę, aby próbka była naświetlana przez 1 s wewnątrz miecha.</li>
<li>Po naświetleniu próbki szybko wyjąć fiolkę z miecha, a probówkę PCR z fiolki. Szybko zgasić reakcję, dodając 1 μl DTT lub 10 μl redukującego buforu do próbek PAGE. Powtórzyć reakcję dla każdego alikwotu peptydów.</li>
<li>Mieszaniny reakcyjne można teraz zamrozić w temperaturze −20 °C w celu przechowywania nie dłużej niż przez 7 dni lub trzymać na lodzie przed analizą metodą SDS-PAGE i barwieniem srebrem.</li>
</ol>
3. SDS-PAGE i barwienie srebrem produktów sieciowania peptydów
<ol>
<li>W celu wizualizacji sieciowanych peptydów przeprowadza się rutynowe rozdzielanie metodą SDS-PAGE oraz barwienie srebrem.</li>
<li>Na każdą ścieżkę nanosi się 5 μl mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać ~130 pmol peptydów na ścieżkę.</li>
<li>W celu porównania należy uwzględnić podobne ilości niesieciowanych peptydów. Należy również zastosować standardową drabinę białkową do wizualnej oceny masy cząsteczkowej prążków peptydowych.</li>
<li>Żel należy poddać elektroforezie przy użyciu standardowej aparatury. W naszej pracy stosujemy system XCell SureLock Mini-Cell firmy Invitrogen, a barwienie srebrem przeprowadzamy zgodnie z publikacją Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast Gel Electrophoresis Guide.</li>
</ol>
Część 4: Reprezentatywne wyniki (Rysunek 1)
<img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result%20no%20demarcation.png" alt="Wyniki elektroforezy żelowej SDS-PAGE dla sieciowania białek GRF, kalcytoniny, Aβ40, Aβ42." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rycina 1: Barwione srebrem żele poliakrylamidowe przedstawiające nieusieciowany (−) oraz usieciowany fotochemicznie (+) GRF, kalcytoninę, Aβ40 i Aβ42
Analizy SDS-PAGE i barwienie srebrem oligomerów Aβ40 generowanych metodą PICUP wykazują zbliżoną intensywność prążków od monomeru do tetrameru, po czym następuje gwałtowny spadek zawartości wyższych oligomerów7. Nieusieciowany Aβ40 migruje z Mr zgodną z masą monomeru7. Aβ42 wykazuje odmienny rozkład wielkości oligomerów. Oligomery Aβ42 składają się z 2–3 grup8. Pierwsza grupa, od monomeru do trimeru, wykazuje malejącą intensywność wraz ze wzrostem rzędu oligomeru. W drugiej grupie obserwuje się rozkład zbliżony do rozkładu Gaussa pomiędzy tetramerem a heptamerem, z maksimum dla pentameru i heksameru. Trzecia grupa, która nie jest tutaj pokazana, zawiera oligomery o Mr ~30 000–60 000 Da8. Te oligomery o wyższym Mr są zazwyczaj obserwowane przy użyciu LMW Aβ42 izolowanego metodą SEC, ale nie w peptydach przygotowanych poprzez filtrację lub traktowanie HFIP6. Nieusieciowany Aβ42 tworzy głównie dwa prążki: prążek monomeru oraz szeroki prążek trimeru/tetrameru, który jest artefaktem indukowanym przez SDS5,9. Kalcytonina daje rozkład wielkości oligomerów, który silnie odbiega od monotonnego spadku wykładniczego w zakresie od monomeru do tetrameru, co sugeruje wstępne istnienie dimerów, trimerów i tetramerów7. Polipeptyd kontrolny, GRF, tworzy monotonny rozkład oligomerów od dimeru do heksameru, tak że pozorne względne ilości oligomerów maleją wykładniczo wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej. W innych eksperymentach można było zwizualizować również wyższe oligomery7. Dokładna liczba i względne intensywności prążków oligomerów mogą się nieco różnić między eksperymentami w zależności od rzeczywistego stężenia białka, ilości białka naniesionego na żel oraz czasu trwania etapu wywoływania w protokole barwienia srebrem.

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

Metoda PICUP została opracowana pierwotnie w celu badania stabilnych kompleksów białkowych2. Następnie zastosowano ją do ilościowych badań metastabilnych agregatów białek amyloidowych, w tym Aβ10, prionów i PrPSc 11 związanych z chorobami oraz α-synukleiny12. Najważniejszymi czynnikami, które należy uwzględnić podczas projektowania eksperymentu PICUP, są stechiometria odczynników, czas naświetlania oraz procedura przygotowania próbek. Dwie pierwsze kwestie mogą wymagać optymali...

<table><tbody><tr><td>żarówka wolframowa Dolan-Jenner o mocy 200 W</td><td>Inne</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Model 170-D</td><td>Ciepło generowane przez lampę d&amp;#8211;nie wpłynie na próbki podczas krótkich okresów inkubacji.</td></tr><tr><td>korpus aparatu SLR 35 mm</td><td>Narzędzie</td><td>Pentax</td><td>model SP500</td><td>W naszej konfiguracji do korpusu kamery przymocowano miech, który tworzy dogodną komorę do naświetlania próbki umieszczonej w odległości 10 cm od źródła światła.</td></tr><tr><td>Przezroczyste probówki do PCR z cienkimi ściankami</td><td>Inne</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 dostarczony przez Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane (1,8 ml)</td><td>Inne</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, dostarczony przez Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Odczynnik</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Odczynnik</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Stosować w dygestorium.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 i A&amp;#946;42</td><td>Odczynnik</td><td>Laboratorium Biopolimerów UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalcytonina</td><td>Odczynnik</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Heksahydrat dichlorotris(2,2'-bipirydylo)rutenu(II)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Mieszać w wstrząsarze wirowym (vortexować) aż do uzyskania klarownego roztworu. Probówkę z RuBpy owinąć folią aluminiową, aby chronić odczynnik przed światłem otoczenia. RuBpy należy przygotowywać świeżo przed każdym użyciem i zużyć w ciągu 48 h.</td></tr><tr><td>Persiarczan amonu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Wymieszać w wstrząsarku wirującym (vortex) do czasu uzyskania klarownego roztworu. APS należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem i zużyć w ciągu 48 h. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>Można stosować podczas przeprowadzania analizy metodą SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Novex Tricine SDS (2x)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-komórka</td><td>Narzędzie</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Żele Novex Tricine (10-20%)</td><td>Inne</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy Novex Tricine SDS (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego barwienia srebrem</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

fotostymulowane sieciowanie niemodyfikowanych białek (picup) zastosowane do peptydów amyloidogennych

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Agregacja białek amyloidogennych w toksyczne oligomery jest kluczowym zdarzeniem w patogenezie chorób związanych z błędnym fałdowaniem białek, w tym choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, dziedzicznej stwardnienia zanikowej bocznego oraz cukrzycy typu 2. Ze względu na metastabilną naturę tych kompleksów białkowych, trudna jest ilościowa ocena rozkładu wielkości ich oligomerów za pomocą klasycznych metod, takich jak elektroforeza, chromatografia, fluorescencja czy dynamiczne rozpraszanie światła. Oligomery białek amyloidogennych występują jako metastabilne mieszaniny, w których jednocześnie zachodzi dysocjacja oligomerów do monomerów oraz ich asocjacja w większe kompleksy. Metoda PICUP stabilizuje populacje oligomerów poprzez kowalencyjne sieciowanie a w połączeniu z metodami frakcjonowania, takimi jak elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) lub chromatografia wykluczania (SEC), PICUP pozwala uzyskać obraz rozkładu wielkości oligomerów istniejących przed sieciowaniem. W związku z tym PICUP umożliwia wizualizację i analizę ilościową metastabilnych populacji białek i może być wykorzystywana do monitorowania agregacji oraz określania zależności między modyfikacjami sekwencji a oligomeryzacją.1Mechanistycznie PICUP obejmuje fotoutlenianie Ru2+w kompleksie tris(bipyrydylu)Ru(II) (RuBpy) do Ru3+poprzez naświetlanie światłem widzialnym w obecności akceptora elektronów. Ru3+jest silnym utleniaczem jednoelektronowym zdolnym do odebrania elektronu z sąsiedniej cząsteczki białka, co prowadzi do powstania rodnika białkowego1,2Rodniki są niestabilnymi, wysoce reaktywnymi formami, które z tego względu szybko zanikają w wyniku szeregu reakcji wewnątrz- i międzycząsteczkowych. Rodnik może wykorzystać wysoką energię niesparowanego elektronu do reakcji z innym monomerem białka, tworząc rodnik dimeryczny, który następnie traci atom wodoru i tworzy stabilny, kowalencyjnie powiązany dimer. Dimer ten może następnie dalej reagować poprzez podobny mechanizm z monomerami lub innymi dimerami, tworząc oligomery wyższego rzędu. Zalety metody PICUP w porównaniu z innymi metodami sieciowania foto- lub chemicznego3,4uwzględnij krótką (≤1 s) ekspozycję na niedestrukcyjne światło widzialne, nie ma potrzebypre factomodyfikacji natywnej sekwencji oraz kowalencyjnego sieciowania o zerowej długości. Ponadto PICUP umożliwia sieciowanie białek w szerokim zakresie pH i temperatur, w tym w parametrach fizjologicznych. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie PICUP do sieciowania trzech białek amyloidogennych: wariantów białka amyloid β o długości 40 i 42 aminokwasów (Aβ40 i Aβ42) oraz kalcytoniny, a także białka kontrolnego – czynnika uwalniającego hormon wzrostu (GRF).

Fotowywołane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) umożliwia charakteryzację rozkładu wielkości oligomerów w metastabilnych mieszaninach białek. Prezentujemy zastosowanie metody PICUP w odniesieniu do trzech reprezentatywnych peptydów amyloidogennych: form 40- i 42-resztkowych białka amyloid β oraz kalcytoniny, a także do kontrolnego peptydu – czynnika uwalniającego hormon wzrostu.

Fotostymulowane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) zastosowane do peptydów amyloidogennych

Agregacja białek amyloidogennych w toksyczne oligomery jest kluczowym zdarzeniem w patogenezie chorób związanych z błędnym fałdowaniem białek, w tym choroby Alzheimera, ...

Uważa się, że rozpuszczalne oligomery białek amyloidogennych, ze względu na swoje właściwości cytotoksyczne, leżą u podstaw patofizjologii chorób neurodegeneracyjnych. Oligomery te nieustannie tworzą się i rozpadają w roztworze. Fakt ten komplikuje badania strukturalne, które są kluczowe dla opracowania cząsteczek inhibicyjnych pozwalających rozwiązać ten problem.Stosuje się fotowyzwalane sieciowanie niezmodyfikowanych białek lub ich wychwytywanie. Metoda ta polega na wystawieniu rozaggregowanych i solubilizowanych peptydów amyloidogennych na działanie odczynników sieciujących oraz jednosekundowy impuls intensywnego światła w celu kowalencyjnego połączenia dimerów i oligomerów. Rozkład wielkości oligomerów można następnie przeanalizować za pomocą standardowych technik biochemicznych.Witajcie, jestem Far Rahimi z Laboratorium Batan w Departamencie Neurologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Jestem Al Mai z Laboratorium Bean. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę fotoindukowanego sieciowania niemodyfikowanych białek.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do wytwarzania stabilizowanych oligomerów białka beta-amyloidu oraz badania modyfikacji strukturalnych w rozkładzie oligomerów. Procedura ta została pierwotnie opublikowana przez Fancy'ego i Coate'a w celu badania stabilnych kompleksów białkowych. Metoda ta została później zastosowana przez Battana i innych do ilościowej analizy metastabilnych zgromadzeń białek amyloidowych, w tym beta-amyloidu i alfa-synukleiny.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć protokół, do probówki o niskiej absorpcji z powłoką krzemową, zawierającej od 1 do 200 µg liofilizowanego peptydu, dodaje się uprzednio schłodzony na lodzie heksafluoroizopropanol (HFIP), tak aby końcowa koncentracja wynosiła około 0,5.Milimolowe stężenie HFIP zapobiega agregacji peptydów amyloidogennych, co poprawi powtarzalność wyników. Teraz sonikuj probówkę z peptydem przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu sonikacji delikatnie wymieszaj zawartość probówek w wortexie i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach schłodź peptydy na lodzie przez jedną minutę. Schłodzone peptydy można teraz podzielić na aliquoty od 10 do 50 µL w probówkach o niskiej absorpcji o grubości ścianek 0,6 mil.Następnie umieść probówki w dygestorium z odkręconymi nakrętkami. Aby umożliwić odparowanie HFIP przez noc, owiń statyw z probówkami ręcznikami papierowymi Kim wipes, aby zapobiec osadzaniu się kurzu w probówkach. Po odparowaniu większości HFIP wszelkie pozostałości HFIP należy usunąć, umieszczając probówki w eksykatorze pod próżnią przez dwie godziny.Produktem końcowym jest cienka warstwa filmu peptydowego wewnątrz probówek. Probówki te mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze -20 lub -80 °C. Aby rozpocząć etapy solubilizacji i sieciowania fotochemicznego, film peptydowy rozpuszcza się najpierw w roztworze rozcieńczonego wodorotlenku sodu.Po dodaniu wodorotlenku sodu, dodaje się wodę dejonizowaną, a następnie bufor fosforanowy, tak aby końcowy roztwór składał się w 45% z buforu fosforanowego, 45% z wody i 10% z roztworu wodorotlenku sodu. Jeśli na ściankach probówki pozostanie resztka filmu białkowego, należy go zeskrobać do roztworu. Po wymieszaniu zawiesonych peptydów za pomocą pipety (kilkukrotne zasysanie i wydmuchiwanie), należy poddać je sonikacji w kąpieli wodnej Sonica przez jedną do dwóch minut.Po sonikacji należy dodać roztwór fosforanowy i wymieszać go, pipetując próbkę w górę i w dół. Następnie wirowarkę należy ustawić na 16 000 G i wirować przez 10 minut. W czasie wirowania należy przygotować aparat fotograficzny do etapów sieciowania fotochemicznego.Opóźnienie migawki aparatu należy ustawić na jedną sekundę, a migawkę należy zbroić. Po zakończeniu wirowania probówek należy przygotować alikwoty po 18 µL roztworu peptydowego w przezroczystych probówkach PCR 0,2 ml. Alikwoty te zostaną wykorzystane do sieciowania fotochemicznego.Należy odłożyć część roztworu peptydowego, aby posłużył jako kontrola negatywna bezpośrednio przed sieciowaniem. Dodać 1 µL siarczanu amonu i 1 µL rutenu. Następnie szybko umieścić probówkę w szklanej fiolce 1,8 M, a fiolkę w mieszchu przymocowanym do przedniej części korpusu aparatu.Przykryj obiektyw kamery osłoną i naciśnij spust migawki. Próbka zostaje teraz naświetlona przez jedną sekundę. Przy dłuższym czasie naświetlania rozległe reakcje rodnikowe prowadzą do degradacji białek.Po naświetleniu szybko wyjmij probówkę PCR 0,2 mil i dodaj 10 µL wcześniej przygotowanego buforu do próbek do elektroforezy zawierającego beta-merkaptoetanol. Sieciowane peptydy można przechowywać do siedmiu dni w temperaturze -20 °C. Przed przeprowadzeniem elektroforezy SDS-PAGE, frakcjonowania i barwienia srebrem.Aby zbadać sieciowane peptydy, do oszacowania objętości można zastosować rutynową elektroforezę SDS-PAGE oraz barwienie srebrem; nałożenie 5 µL mieszaniny reakcyjnej powinno dostarczyć około 130 pmoli peptydów. Do elektroforezy żelowej i barwienia srebrem zaleca się użycie systemu Xcel Sherlock mini cell firmy Invitrogen. Zgodnie z publikacją firmy Invitrogen (IM 1 0 0 2, przewodnik po elektroforezie na gotowych żelach NOx), po analizie żelu SDS-PAGE zabarwionego srebrem, niesieciowany polipeptyd kontrolny GRF wędruje głównie jako monomer.Siatkowana GRF tworzy ciągły rozkład ligandów, obejmujący formy od dimeru do heksameru, w taki sposób, że pozorna względna intensywność prążków oligomerów maleje wykładniczo wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej. Nieusiatkowana kalcytonina występuje głównie w formie monomeru oraz w niewielkiej części jako dimer. Siatkowana kalcytonina daje rozkład wielkości ligandów, który w tym obszarze wyraźnie odbiega od monotonnego spadku wykładniczego.Od monomeru do tetrameru, co sugeruje wcześniejsze istnienie nieusieciowanych dimerów, trimerów i tetramerów. Beta 40 występuje wyłącznie jako monomer, a próbka wygenerowała Beta 40. Wszystkie ligandy wykazują zbliżone intensywności prążków od monomeru do tetrameru, po czym następuje spadek liczebności wyższych oligomerów wszystkich ligandów.Brak sieciowania. Beta 42 tworzy głównie dwa prążki: prążek monomeru oraz prążek trimeru/tetrameru. Prążek trimeru/tetrameru jest artefaktem powstałym w wyniku sieciowania przez SDS.Beta 42 wykazuje wyraźny rozkład wielkości oligomerów składający się z dwóch grup. Pierwsza grupa, od monomeru do trimeru, wykazuje malejącą intensywność wraz ze wzrostem stopnia oligomeryzacji. W drugiej grupie obserwuje się rozkład przypominający kształt dzwonu między tetramerem a heptamerem, z maksimum przy pentamerze i heksamerze.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić sieciowanie białka za pomocą pika, stosując tę procedurę. Należy pamiętać, że w przypadku białek amyloidogennych musimy upewnić się, że preparaty są wolne od agregatów, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Warunki przedstawione tutaj oraz te eksperymenty mogą być modyfikowane doświadczalnie w zależności od analizowanych lizatów. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu pobierania.

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fotoindukcyjne łączenie krzyżowe niezmodyfikowanych białek (PICUP) zastosowane do amyloidogennych peptydów

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Podczas gdy transport białek na powierzchni komórki jest stosunkowo łatwy do zbadania, wizualizacja transportu białek wewnątrzkomórkowych jest znacznie trudniejsza. Tutaj używamy konstruktów zawierających fotoaktywowany GFP i demonstrujemy metodę dokładnego śledzenia białka prekursorowego amyloidu z aparatu Golgiego do dalszych przedziałów i śledzenia jego klirensu.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego transportu APP za pomocą fotoaktywowalnego GFP

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Ten artykuł opisuje, jak można zastosować mikroskopię dwufotonową wrażliwą na polaryzację, aby scharakteryzować lokalną organizację w obrębie bezznacznikowych nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Opisano w nim również, jak przygotować i zmierzyć próbkę, skompletować wymaganą konfigurację i przeanalizować dane w celu uzyskania informacji o lokalnej organizacji włókienek amyloidowych.

Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

Tutaj prezentujemy systematyczną metodę opisującą quasi-odwracalną samoorganizację agregatów złota o długości 20 nm pokrytych amyloidem beta 1-40 (Aβ 1-40). Zależna od nanorozmiaru, quasi-odwracalna sieć między peptydami została skorelowana z określonymi aminokwasami lub sekcjami monomeru Aβ 1-40.

Charakterystyka zależnej od pH odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40

Poznaj metodę PICUP do analizy oligomerów peptydów amyloidogennych. Technika fotoindukowanego sieciowania umożliwia badanie dystrybucji wielkości oligomerów białkowych kluczowych dla rozwoju chorób neurodegeneracyjnych.

Fotostymulowane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) zastosowane do peptydów amyloidogennych

Przeglądaj więcej filmów