Name: Poziome Przygotowanie Kromka Retina (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj nową metodę przygotowania kromek siatkówki, która zachowuje morfologię dendrytów neuronów siatkówki. Technika ta umożliwia dokładniejsze badanie obwodów siatkówki i ich funkcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Richard H. Masland i Akimichi Kaneko za udzielenie nam cennych rad i sugestii w celu ustalenia procedury poziomej przygotowania kawałek siatkówki.

<ol><li> Przygotowanie bloku agar (30 mg / ml, tj. 3%, w wodzie destylowanej). Rozpuścić i kuchenka mikrofalowa to pierwszy i przelać do naczynia szklanego. Przechowywać pojemnik w lodówce w temperaturze 4 ° C. Wskazówka: Blok agar powinny być przygotowane wcześniej. </li><li> Przygotuj się do niskich temperatur i topnienia żelu agarozowym (25 mg / ml, tj. 2,5%, w średnich). Rozpuścić i mikrofalówka to. Trzymaj go w gorącej łaźni wodnej w temp. 35 o C. Wskazówka: Należy żelu agarozowym nie za gorąco. Jeśli jest zbyt gorąco, to zajmuje dużo czasu, aby być zestalone, a żel może zabić w siatkówce . </li><li> Eutanazji zwierząt, wyłuszczyć gałki ocznej i otwórz go w muszlę oczną. Aby stopić ciała szklistego, otworzył muszla oczna jest moczony przez 10 minut w hialuronidazy w średnim (0,07 mg / ml), jeśli koniecznie. </li><li> Cut agar w bloku (np. 1 cm x 1,5 cm do siatkówki myszy) i przymocowane na stałe na vibratome scenie kleje. Przechowywać bloku agar mokre. </li><li> Umieścić ostrze w 5 stopni na krajalnicy. Delikatnie cięcia górnej powierzchni bloku agar z prędkością ok.. 50 ľm / s, Częst. 50 Hz. Wskazówka: Upewnij się, że górna powierzchnia bloku agar jest całkowicie gładka i płaska. Kilka kawałków (co najmniej 3 razy) mogą być potrzebne, aby uzyskać gładką i płaską powierzchnię bloku agar. </li><li> Przepłukać muszla oczna z medium bez hialuronidazy. Isolate siatkówki z nabłonka barwnikowego i umieścić ją fotoreceptorów do dołu na kawałku bibuły filtracyjnej. Aby mocno przywiązują siatkówki do bibuły, próżni siatkówki na filtr papierowy kilka razy. Wskazówka: Upewnij się, że siatkówka jest dołączony do bibuły całkowicie płaskie. Po umieszczeniu siatkówki na bibule filtracyjnej, wyciąć nadmiar bibułę wokół siatkówki (rys.2a). Nadmiar bibułę często uniemożliwia ostrze przejdzie w odpowiednie warstwy siatkówki. </li><li> Delikatnie wytrzyj nadmiar medium na bloku agar i dokładnie miejsce w siatkówce na bibule filtracyjnej w bloku agar. Aby trwale umieścić bibułę filtracyjną w bloku agar, dołączyć kleje na krawędzi bibuły. Wskazówka: Aby uniknąć nieoczekiwanie crack, miejsce na siatkówce, jak z przodu, jak to możliwe na górnej powierzchni bloku agar. </li><li> Delikatnie wlać do niskich temperatur i topnienia żelu agarozowym w siatkówce. Poczekaj na 1 min i delikatnie wlać medium na to, aby ostudzić. Żelu agarozowym staje się zestalone szybko. Wskazówka: Za gorąco żelu agarozowym zabija siatkówki. </li><li> Podnieś pozycję ostrza do kilkuset mikrometrów powyżej górnej powierzchni bloku agar i delikatnie wyciąć góry zestalony żelu agarozowym. </li><li> Niżej pozycji ostrza. Cut siatkówki na poziomie bliższym jedna trzecia warstwa wewnętrzna jądrowej (ok. pomiędzy 200 a 250 mikrometrów powyżej górnej powierzchni bloku agar). Wskazówka: Za dużo prędkości ostrze uszkodzić siatkówkę poważnie. Ok. 50 ľm / s (50 Hz) jest odpowiednia. </li><li> Zauważ, że amacrine komórki są teraz zakryte. Ostrożnie podnieś kawałek siatkówki wraz z zestalonego żelu agarozowym i umieścić ją odkrytą w komorze lub danie. Wskazówka: Ponieważ siatkówki myszy jest bardzo mała i faliste, trudno jest uzyskać doskonałe poziomego wycinka w odpowiedniej warstwie. &quot;Ukośny&quot; slice może być metodą alternatywną do uzyskania względnej płaski kawałek siatkówki. Aby uzyskać ukośne kawałek, umieścić inny filtr papieru między siatkówki na bibule filtracyjnej i blok agar, jak pokazano na Fig.2B. Chociaż nie można oczekiwać doskonałej poziomego wycinka, zawsze są pewne obszary, gdzie amacrine komórki soma jest na powierzchni warstwy. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

Wszystkie protokoły eksperymentalne były prowadzone zgodnie z National Institutes of Health wytyczne do stosowania u zwierząt.

Istnieje kilka ważnych zalet poziomej przygotowania kawałek siatkówki. Po pierwsze, morfologii komórek, które rozszerzają się dendrytów w poziomie, jak amacrine i komórki w poziomie, jest zachowany. Wykazano, że istnieje ponad 20 rodzajów amacrine komórek w siatkówce (MacNeil i Masland, 1998), tak że jest bardzo ważne dla porównania morfologii komórek fizjologiczne własności. Po drugie, w całym montażu siatkówki, obszerne relacje z komórek glejowych s endfeets uniemożliwia dostęp do pipet patch do amacrine komórek. W poziome...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza L</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>Agaroza niskotopliwa </td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Typ I-S, 300 U/mg</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>w mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,0 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;oraz 10 glukozy, przy utrzymaniu pH 7,8, lub Ames&amp;rsquo; Roztwór (Sigma)</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>MF – filtry membranowe</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>Papier filtracyjny, wielkość porów 0,45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji</td><td></td><td></td><td>pinceta, ostrze, ścisnąć, pęseta &lt;em&gt;itp.&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>Klej błyskawiczny</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glu</td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

poziome przygotowanie kromka retina

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Jednak wiele neuronów siatkówki, takie jak amacrine komórek, rozszerzać swoją dendrytów poziomo, tak że morfologia komórek ma być poważnie uszkodzony w pionowe plastry. W całym montażu przygotowania, zwłaszcza dla patch-clamp nagrań neuronów siatkówki w środkowej warstwie nie są łatwo dostępne ze względu na rozległy zasięg glejowych komórek (komórki Mueller) endfeets s. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone. Kawałek został poziomo po wewnętrznej warstwy siatkówki za pomocą vibratome Krajalnica po siatkówki został osadzony w niskiej temperaturze topnienia żelu agarozowym. W tym poziome przygotowania kawałek siatkówki, badanych przez nas funkcji neuronów siatkówki w porównaniu z ich morfologii, za pomocą patch-clamp nagrywania, techniki obrazowania wapnia, immunocytochemii i pojedynczych komórek RT-PCR.

Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone.

Poziome Przygotowanie Kromka Retina

Tradycyjnie do badania funkcji obwodów siatkówki stosowano preparaty w formie przekrojów pionowych oraz preparaty całych organów. Jednakże wiele z...

Zatem legenda jest już tutaj, a to jest artykuł ilustrowany.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia rozwoju i starzenia się. Organizacja anatomiczna siatkówki naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.

Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj nową metodę przygotowania kromek siatkówki, która zachowuje morfologię dendrytów neuronów siatkówki. Technika ta umożliwia dokładniejsze badanie obwodów siatkówki i ich funkcji.

Poziome Przygotowanie Kromka Retina

Przeglądaj więcej filmów