Name: Naprowadzanie komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę badania naprowadzania komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego u myszy. Protokół obejmuje izolację, barwienie i śledzenie migracji komórek w organizmie biorcy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Protokół ten został przetestowany i zoptymalizowany w laboratorium dr. Davida Scaddena. Finansowanie zostało zapewnione przez Program Stypendialny z zakresu Hematologii Klinicznej i Onkologii w Dana Farber Cancer Institute/Massachusetts General Hospital.

<ol>
<li>Eksperyment homingu rozpoczynamy od wyizolowania komórek, które zostaną w nim wykorzystane. W niniejszym badaniu chcemy sprawdzić, czy homing całego szpiku kostnego do nisz w kościach długich zwierząt biorców różni się w przypadku komórek szpiku pobranych od zwierząt WT, takich jak C57BL/6J (WT), oraz od tych, które są transgenicznymi knockoutami receptora lizofosfatydowego 1 (LPAR1) (KO).</li>
<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu zgromadzimy niezbędne materiały. W naszym laboratorium wszystkie sekcje myszy są przeprowadzane w laminarnym dygestorze do hodowli tkankowej, zwłaszcza gdy komórki mają zostać przeszczepione do zwierzęcia biorcy, a nie wykorzystane do analiz ex-vivo. Zaczynamy od umieszczenia w dygestorze niebieskiej podkładki. Pozostałe niezbędne przedmioty to autoklawowana pęseta i ostre nożyczki, sterylny skalpel jednorazowy oraz waciki nasączone alkoholem. Będziemy potrzebować zmodyfikowanego PBS, sterylnej płytki 6-dołkowej, moździerza z tłuczkiem, probówki stożkowej 50 cm³ z niebieskim zamknięciem oraz jednorazowego filtra 70 µM.</li>
<li>Zaczynamy od pobrania jednej myszy WT i jednej myszy KO.</li>
<li>Myszy te są uśpione poprzez inhalację CO2, a następnie zanurzone w 70% izopropanolu na 5 sekund. Ten etap zapobiega zanieczyszczeniu badanych komórek sierścią myszy i w naszej praktyce nie wpłynął negatywnie na wydajność uzyskania komórek ani na wyniki eksperymentu.</li>
<li>Następnie myszy są sekcyjnie rozdzielane przy użyciu pęsety i ostrych nożyczek. Zwyczajowo zaczynamy od myszy WT. Wykonuje się niewielkie nacięcie skóry brzusznej myszy nad jamą brzuszną, a następnie rozciąga się skórę dłońmi. Skóra z kończyn tylnych schodzi łatwo. Następnie wyjmuje się kość udową i piszczelową, dbając o to, aby nie wysunąć głowy kości udowej, gdyż zawiera ona dużą ilość szpiku kostnego. Kończyny górne oddziela się od tułowia zwierzęcia, po prostu pociągając za nie, utrzymując tułów w bezruchu. Pozwala to usunąć kończyny górne w całości. Następnie z kończyn górnych wyjmuje się kości ramienne.</li>
<li>Usunięte kości umieszcza się w zmodyfikowanym PBS, który wlano do płytek 6-dołkowych. Zmodyfikowany PBS przygotowuje się poprzez dodanie 2 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (Fetal Bovine Serum) oraz 2 cm³ EDTA 0,5 M pH 8. Roztwór ten jest następnie filtrowany przez filtr Nalgene 0,45 µM i może być przechowywany w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc.</li>
<li>Niezbędne jest prawidłowe opisanie dołków w płytce, aby móc poprawnie zidentyfikować kości WT i KO.</li>
<li>Tuszki myszy są usuwane i utylizowane.</li>
<li>W dygestorze kładzie się nową podkładkę, a kości oczyszcza za pomocą jednorazowego skalpela.</li>
<li>Oczyszczone kości umieszcza się w moździerzu, przetwarzając po jednej myszy na raz. Do moździerza dodaje się 2 ml zmodyfikowanego PBS i rozdrabnia kości za pomocą tłuczka. Ważne jest, aby najpierw pofragmentować kości, wykonując 10 ruchów tłuczkiem w przód i w tył, a następnie sproszkować je ruchami obrotowymi. Zazwyczaj wykonuję 50 ruchów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, następnie 50 ruchów przeciwnie do wskazówek zegara i tak dalej, aż materiał w moździerzu stanie się biały, a dodany zmodyfikowany PBS pozostanie biały lub przezroczysty.</li>
<li>Po każdym zestawie 50 kolistych ruchów rozdrabniających przenosimy ciecz z moździerza przez filtr 70 µM umieszczony na probówce stożkowej 50 ml. Po każdym transferze do filtra nie zapomnij dodać do moździerza 2 ml PBS. Nie należy próbować rozdrabniać suchych kości ani pozostawiać ich bez cieczy przez dłuższy czas, ponieważ doprowadzi to do apoptozy komórek.</li>
<li>Gdy materiał w moździerzu stanie się biały, zawartość filtra przenosi się z powrotem do moździerza i ponownie przeprowadza rozdrabnianie. Zapewnia to pełne wykorzystanie komórek z filtra. Zazwyczaj potrzeba jednego lub dwóch zestawów ruchów obrotowych, aby materiał w moździerzu ponownie stał się biały, co oznacza zakończenie izolacji komórek.</li>
<li>Roztwór w probówce stożkowej jest teraz wirowany (pamiętaj o oddzieleniu komórek od myszy WT i KO; w związku z tym będziesz mieć dwie różne probówki: jedną z komórkami WT, drugą z komórkami KO). Wirować przy 1200 obr./min przez 10 minut.</li>
<li>Odsysamy nadpływ za pomocą oddzielnych pipet aspiracyjnych dla każdej probówki. Do każdego osadu dodajemy 2 cm³ sterylnego buforu lizującego ACK. Inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
<li>Do każdej probówki dodajemy 8 cm³ zmodyfikowanego PBS. Z każdej probówki pobieramy 10 µl i przenosimy do dwóch oddzielnych dołków w płytce 96-dołkowej. Probówki umieszczamy w wirówce i wirujemy przy 1200 obr./min przez 10 minut.</li>
<li>Podczas wirowania do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającego badane komórki dodajemy 30 µl barwnika błękitu trypanu i 60 µl zmodyfikowanego PBS.</li>
<li>10 µl tej mieszaniny (po dokładnym wymieszaniu poprzez pipetowanie w górę i w dół) przenosimy do komory licznikowej (hemocytometru) i przeliczamy komórki w czterech zewnętrznych kwadratach.</li>
<li>Liczba komórek w każdej próbce na 1 ml to liczba przeliczonych komórek podzielona przez 4 i pomnożona przez 100 000.</li>
<li>Po zakończeniu wirowania wyjmujemy probówki z wirówki i resuspendujemy komórki w PBS bez wapnia, magnezu i L-glutaminy do stężenia 20 milionów komórek na ml. Prawdopodobnie otrzymasz objętość około 5 ml dla zwierzęcia WT i 5 ml dla zwierzęcia KO. Od tego momentu w protokole będziemy używać zwykłego PBS, a nie zmodyfikowanego PBS.</li>
<li>Do każdej probówki dodajemy barwnik do barwienia komórek DiI, aby uzyskać stężenie końcowe 5 µM. Natychmiast mieszać w wortexie przez 10 sekund. Inkubować w 37°C przez 10 minut, unikając ekspozycji na światło.</li>
<li>Uzupełnić probówki PBS i wirować przez 10 minut przy 1200 obr./min.</li>
<li>Po wirowaniu odessać nadpływ i resuspender komórki w PBS do stężenia 40 milionów komórek na ml.</li>
<li>Nabrać 500 µl do strzykawek 1 cm³ z igłą 27G (5 strzykawek dla myszy WT i 5 strzykawek dla myszy KO). Warto przygotować po 6 strzykawek dla każdej kohorty. Dodatkowa strzykawka może być pomocna, ponieważ iniekcje dożylne do ogona, które wykonamy w następnym kroku, mogą być trudne.</li>
<li>Osłonić strzykawki folią, aby zapobiec degradacji DiI.</li>
<li>Wstrzyknąć 500 µl mieszaniny komórek do każdego zwierzęcia biorcy (5 dla każdej kohorty).</li>
<li>Zwierzęta te muszą zostać napromieniowane dawką 9 Gy na 4–24 godziny przed iniekcją.</li>
<li>48 godzin po iniekcji pobrać szpik kostny z kończyn tylnych każdego zwierzęcia biorcy.</li>
<li>Przetworzyć materiał zgodnie z opisem dla dawców. Resuspender komórki z każdego zwierzęcia w 1 cm³ PBS. Wyznaczyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
<li>Odczytać wyniki na cytometrze przepływowym LSR II firmy BD lub urządzeniu równoważnym. Wynik można wyrazić jako procent lub bezwzględną liczbę komórek w analizowanym szpiku kostnym, które są dodatnie pod względem DiI.</li>
</ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

Homing jest procesem, w którym komórki szpiku kostnego, w tym komórki macierzyste, komórki progenitorowe oraz komórki zróżnicowane, przedostają się do szpiku kostnego po wstrzyknięciu ich do krwiobiegu lub jamy szpiku kostnego myszy. Z definicji wynika, że badacz może zdecydować się na analizę homingu komórek macierzystych krwiotwórczych, komórek progenitorowych lub komórek zróżnicowanych, zidentyfikowanych za pomocą immunofenotypowania i wyizolowanych poprzez sortowanie komórek. Zazwyczaj naukowcy wstrzykują komórki szp...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline – sól fizjologiczna z buforem fosforanowym)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna płodowa surowica bydlęca</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy ACK</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropranolol U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do znakowania komórek Vybrant DiD</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do znakowania komórek Vybrant DiI</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

homing komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing jest zjawiskiem, dzięki któremu przeszczepione komórki krwiotwórcze są w stanie dotrzeć do szpiku kostnego, a następnie ulec engraftingowi lub tam osiąść. W procesie homingu hematopoetycznych komórek macierzystych uczestniczą różne chemokiny i receptory. [1, 2]
Niniejszy artykuł przedstawia klasyczny protokół homingu stosowany w badaniach nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi. Generalnie proces ten polega na wyizolowaniu populacji komórek, której zdolność do homingu ma zostać zbadana, zabarwieniu tej populacji odpowiednim barwnikiem i wstrzyknięciu komórek do krwiobiegu zwierzęcia biorcy. Następnie zwierzę biorca jest uśmiercane w określonym czasie po wstrzyknięciu, a w szpiku kostnym ocenia się procent lub bezwzględną liczbę komórek wykazujących pozytywny wynik dla zastosowanego barwnika. W jednym z najczęstszych schematów doświadczalnych porównuje się wydajność homingu komórek hematopoetycznych pochodzących od dwóch genetycznie różnych zwierząt (zwierzęcia typu dzikiego oraz odpowiadającego mu knockoutu). Niniejszy artykuł opisuje protokół homingu komórek hematopoetycznych w ramach takiego eksperymentu.

Niniejszy artykuł opisuje protokół stosowany do badania homingu komórek krwiotwórczych do ich nisz w szpiku kostnym.

Homing komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego

Homing to zjawisko, dzięki któremu przeszczepione komórki hematopoetyczne są w stanie przemieścić się do szpiku kostnego, w którym ulegają engraftacji lub osiedlają się. Różne...

Homing to zjawisko, w którym przeszczepione komórki krwiotwórcze przedostają się do szpiku kostnego biorcy. Niniejszy artykuł opisuje protokół badania homingu komórek krwiotwórczych do odpowiednich obszarów w szpiku kostnym, poprzez izolację interesującej populacji komórek, zabarwienie jej barwnikiem i wstrzyknięcie do krwiobiegu zwierzęcia biorcy.Następnie, po określonym czasie, określa się procent komórek wybarwionych barwnikiem w organizmie zwierzęcia. Dzięki tej metodzie można porównać wydajność homingu tych komórek pochodzących od dwóch genetycznie różnych zwierząt. Cześć, nazywam się RHI Reen Yusef i jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr. Davida Skaddena w Centrum Medycyny Regeneracyjnej w Massachusetts General Hospital oraz w Harvard Stem Cell Institute.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badania procesu homingu komórek macierzystych krwi do szpiku kostnego, w którym normalnie przebywają. Protokół ten stosujemy w naszym laboratorium do badania różnic w homingu komórek macierzystych krwi pochodzących od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy. Zacznijmy zatem.Aby rozpocząć eksperyment dotyczący homingu, pobieramy szpik kostny od zwierząt typu WT oraz zwierząt z

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przemieszczanie się komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Poznaj metodę badania naprowadzania komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego u myszy. Protokół obejmuje izolację, barwienie i śledzenie migracji komórek w organizmie biorcy.

Homing komórek krwiotwórczych do szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów