Name: Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Naucz się mikroiniekcji oocytów Xenopus laevis w celu badania transportu jądrowo-cytoplazmatycznego. Ta metoda umożliwia wizualizację substratów importowych za pomocą mikroskopii elektronowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Davidowi Theilmannowi (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, Kolumbia Brytyjska) za udostępnienie bakulowirusa AcMNPV oraz za pomocne dyskusje.
Praca ta była wspierana przez granty z Canada Foundation for Innovation (CFI), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR) oraz Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Część 1: Przygotowanie oocytów Xenopus do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Umieść mały fragment (około 2 cm) jajnika Xenopus laevis w probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml roztworu kolagenazy (5 mg/ml kolagenazy w zmodyfikowanym roztworze soli Bartha pozbawionym wapnia: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Kolagenaza służy do usunięcia komórek pęcherzykowych otaczających oocyty.</li>
	<li>Umieść probówkę na platformie wytrząsowej i delikatnie wstrząsaj (przy 100 RPM) przez jedną godzinę. Czas ten różni się w zależności od partii kolagenazy. Dlatego po godzinie pobierz małą próbkę oocytów i obejrzyj je pod mikroskopem stereologicznym. Prawidłowo odfolikulowane oocyty powinny być od siebie dobrze oddzielone, a wprowadzenie szklanej igły do oocytu powinno być łatwe. Jeśli oocyty nie są wystarczająco odfolikulowane, pozostawia się je w roztworze kolagenazy i sprawdza ponownie co pięć minut.</li>
	<li>Przemyj oocyty trzykrotnie zmodyfikowanym roztworem soli Bartha (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO4, 0,33 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5) i przenieś je do szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej MBS z dodatkiem 1% penicyliny/streptomycyny. Oocyty są teraz gotowe do mikroiniekcji. Jeśli mikroiniekcja ma być przeprowadzona w innym dniu, przechowuj oocyty w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereologicznym wybierz do mikroiniekcji dojrzałe oocyty w stadium VI. Oocyty te są duże, z wyraźnym kontrastem między czarną półkulą zwierzęcą a kremową półkulą roślinną.</li>
	<li>Przenieś dojrzałe oocyty w stadium VI do płytki z mikrowydziałami (Nunc, objętość studzienki 10 µl). Należy to zrobić ostrożnie, używając pipety 200-µl z końcówką, której koniec został odcięty, aby umożliwić zasysanie oocytów bez ich uszkodzenia.</li>
</ol>
Część 2: Mikroiniekcja oocytów Xenopus
<ol>
	<li>Przygotować substrat do importu przeznaczony do mikroiniekcji, dodając niewielką ilość 1% błękitu bromofenolowego w celu ułatwienia wizualizacji procesu wstrzykiwania. Na przykład dodajemy 1 µl błękitu bromofenolowego do 10 µl substratu.</li>
	<li>Umieścić niewielki pasek Parafilmu na szalce Petriego o średnicy 100 mm i nanieść na niego kroplę 5 µl roztworu do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Napełnić uprzednio skalibrowaną igłę do iniekcji (wykonaną poprzez wyciągnięcie mikropipety Drummond o pojemności 6,6 µl za pomocą urządzenia Inject+Matic Puller) roztworem do wstrzyknięcia. W tym celu mikroinjektor ustawia się w trybie aspiracji. Aby skalibrować igłę do iniekcji, należy nanieść na nią kropki co 0,5 mm, co odpowiada objętości 50 nl.</li>
	<li>W przypadku iniekcji cytoplazmatycznej końcówkę igły wprowadzić do oocyta w półkuli wegetatywnej, bardzo blisko półkuli zwierzęcej, pod kątem około 45 stopni. Przełączyć ustawienie mikroinjektora na tryb mikroiniekcji i wstrzyknąć do każdego oocyta 50 nl substratu do importu. Kropki na igle służą do monitorowania ilości wstrzykniętego substratu.</li>
	<li>Przenieść wstrzyknięte oocyty do małej szalki Petriego (o średnicy 35 mm) wypełnionej MBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez wybrany czas (punkty czasowe dobiera się tak, aby umożliwić obserwację substratu importowanego związanego z NPC; w przypadku białek i wirusów transportowanych aktywnie w kierunku NPC proces ten zachodzi między 10 a 30 minutami; czas ten zależy również od miejsca iniekcji oraz wielkości białka/wirusa).</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji przenieść oocyty do szklanej fiolki o pojemności 4 ml zawierającej 2% glutaraldehydu w MBS i utrwalić przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Część 3: Disekcja oocytów Xenopus
<ol>
	<li>Następnego dnia przemyć oocyty 3 razy buforem MBS.</li>
	<li>Przenieść oocyty do małej szalki Petriego wypełnionej buforem niskosolnym (LSB: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.5). Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i pęset sekcyjnych usunąć biegun wegetatywny z każdego oocytu. Wygodne jest stabilizowanie preparowanego oocytu jedną pęsetą, podczas gdy druga służy do odcięcia bieguna wegetatywnego. Na tym etapie można ocenić sukces mikroiniekcji na podstawie obecności niebieskiego zabarwienia w cytosolu. Protokół kontynuuje się tylko dla oocytów, które zostały skutecznie poddane mikroiniekcji. Ponadto, jeśli próbki mają być przygotowane do EM, ten etap sekcji znacznie ułatwia zlokalizowanie jądra podczas przycinania i krojenia próbek.</li>
	<li>Ponownie utrwalić wypreparowane oocyty w 2% glutaraldehydzie w LSB przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po utrwalaniu przemyć wypreparowane oocyty trzy razy buforem LSB.</li>
</ol>
Część 4: Przygotowanie wstrzykniętych oocytów do zatopienia i cięcia na cienkie sekcje do EM
<ol>
	<li>Przenieść wypreparowane oocyty na szkiełko z zagłębieniem. Odessać jak największą ilość płynu, a następnie szybko (aby uniknąć wysychania) pokryć wypreparowane oocyty 2% niskotopliwą agarozą. Dopóki agaroza jest jeszcze miękka, użyć końcówki pipety, aby rozdzielić oocyty od siebie i upewnić się, że każdy oocyt jest skierowany stroną górną lub dolną (nie bokiem).</li>
	<li>Pozostawić agarozę do zastygnięcia na około 10 minut. Po zastygnięciu agarozy użyć żyletki, aby pociąć ją na małe fragmenty, z których każdy zawiera jeden wypreparowany oocyt.</li>
	<li>Umieścić oocyty zatopione w agarozie w szklanej fiolce o pojemności 4 ml i przeprowadzić postfiksację w 1% OsO4 w buforze LSB przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć próbkę trzykrotnie w buforze LSB. W razie potrzeby przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez noc i kontynuować protokół następnego dnia.</li>
	<li>Przeprowadzić sekwencyjną dehydratację próbek w rosnących stężeniach alkoholu (etanol 50, 70 i 90% przez 20 min każdy). Następnie zastosować dwie wymiany w 100% etanolu przez 15 min każda. Na koniec zdezhydratować próbki w 100% acetonie przez 15 min.</li>
	<li>Infiltrować próbki mieszaniną Epon (Fluka) i acetonu w stosunku 1:1 przez jedną godzinę, następnie mieszaniną Epon i acetonu w stosunku 2:1 przez dwie godziny, a na koniec w czystym Eponie przez co najmniej sześć godzin.</li>
	<li>Umieścić próbki w płaskich formach do zatapiania wypełnionych świeżym, czystym Eponem. Oocyty należy zorientować w taki sposób, aby strona jądra bliższa miejscu iniekcji – w tym przypadku strona oocytów, która została wypreparowana – była przecinana jako pierwsza. Krok ten optymalizuje szansę na wizualizację importu wybranego substratu.</li>
	<li>Na koniec polimeryzować Epon przez dwa dni w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>W celu wizualizacji próbek, bloki należy przyciąć, a następnie wykonać skrawki przy użyciu ultramikrotomu. Skrawki przenosi się na siatki EM, barwi zgodnie ze standardową procedurą i wizualizuje za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Ta część protokołu nie zostanie przedstawiona, ponieważ jest to standardowa procedura EM.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Jeśli protokół przebiegł pomyślnie, otoczka jądrowa (NE) oraz kompleksy porów jądrowych (NPC) powinny być wyraźnie widoczne na mikrografiach EM. W zależności od wstrzykniętego substratu oraz czasu pomiędzy wstrzyknięciem a utrwaleniem, substrat powinien być widoczny po stronie cytoplazmatycznej NPC, wewnątrz NPC lub po stronie jądrowej NPC.
Rycina 1 przedstawia przekrój poprzeczny otoczki jądrowej (NE) z przyległymy cytoplazmą (c) i jądrem (n) oocyty Xenopus, do której wstrzyknięto kapsydy bakulowirusa AcMNPV, inkubowanej w temperaturze 4°C przez cztery godziny i poddanej procesowi zatapiania oraz cięcia na cienkie sekcje do EM zgodnie z opisem. Groty strzałek wskazują na kompleksy porów jądrowych (NPC). Kapsyd dokujący do cytoplazmatycznej strony NPC zaznaczono białą strzałką.
W przeciwieństwie do poprzedniego przypadku, na Rysunku 2 przedstawiono przekrój poprzeczny osłonki jądrowej (NE) z przyległym cytoplazmą (c) i jądrem (n) z oocyta Xenopus, do którego wstrzyknięto parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM), inkubowanego w temperaturze pokojowej przez cztery godziny i poddanego procesowi zatopienia oraz przygotowania cienkich przekrojów do EM zgodnie z opisem. Stosując tę technikę, stwierdziliśmy, że MVM indukuje przerwanie ciągłości NE (Cohen i Panté, 2005). Nawiasy wskazują przerwy w NE. Groty strzałek wskazują kompleksy porów jądrowych (NPC). Domniemane kapsydy MVM związane z NE są wskazane białymi strzałkami.
<img alt="Ultrastruktura tkanki biologicznej, mikrografia elektronowa, detal błony komórkowej i organelli." src="/files/ftp_upload/1106/1106fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rysunek 1: Mikrograf elektronowy przekroju otoczki jądrowej (NE) z sąsiadującą cytoplazmą (c) i jądrem (n) z oocyta Xenopus, do którego wstrzyknięto kapsydy bakulowirusa AcMNPV, inkubowanego w 4°C przez cztery godziny i poddanego procesowi zatapiania i przygotowania cienkich sekcji do EM zgodnie z opisem. Groty strzałek wskazują na kompleksy porów jądrowych (NPCs). Kapsydy zaznaczono białymi strzałkami. Pasek skali: 100 nm.
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej połączeń komórkowych; analiza strukturalna; strzałki wskazują charakterystyczne cechy." src="/files/ftp_upload/1106/1106fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2: Mikrograf elektronowy przekroju otoczki jądrowej (NE) z przylegającym cytoplazmą (c) i jądrem (n) z oocytu Xenopus, do którego wstrzyknięto parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM), inkubowanego w temperaturze pokojowej przez cztery godziny i poddanego procesowi zatapiania oraz cienkiego cięcia do EM zgodnie z opisem. Grotowidkie strzałki wskazują kompleksy porów jądrowych (NPCs). Nawiasy wskazują przerwy w NE. Przypuszczalne kapsydy MVM związane z NE zaznaczono białymi strzałkami. Pasek skali: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Mikroiniekcja oocytów Xenopus w połączeniu z EM na cienkich przekrojach stanowi wysoce skuteczne narzędzie do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. System ten był wykorzystywany do mapowania poszczególnych etapów importu przez NPC, na przykład oddziaływania substratu importu jądrowego z komponentami strukturalnymi NPC, takimi jak filamenty cytoplazmatyczne i koszyk jądrowy (przegląd Panté, 2006). Wykorzystywano go również do badania importu jądrowego wirusów replikujących się w jądrze (Panté i Kann, 2002;...

mikroiniekcja oocytów xenopus laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis, po której następuje mikroskopia elektronowa (EM) cienkich przekrojów, stanowi doskonały system do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. Ze względu na dużą wielkość jądra oraz wysoką gęstość kompleksów porów jądrowych (NPCs), transport jądrowy można łatwo zwizualizować w oocycie Xenopus. Dzięki wykorzystaniu tego systemu uzyskano wiele istotnych informacji na temat mechanizmów importu i eksportu jądrowego (przegląd opracowany przez Panté, 2006). Ponadto wykorzystaliśmy mikroiniekcję oocytów Xenopus do analizy szlaków importu jądrowego kilku wirusów, które replikują się w jądrze gospodarza. 
W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus z substratem importu jądrowego. Przedstawiamy również przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii przekrojów cienkich, obejmujące wycinek, odwodnienie oraz zatopienie oocytów w żywicy epoksydowej. Na koniec prezentujemy reprezentatywne wyniki dla oocytów, do których wstrzyknięto kapsyd bakulowirusa Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) lub parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM), oraz omawiamy potencjalne zastosowania tej techniki.

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Mikroiniekcja oocytów *Xenopus laevis* z następującym po niej badaniem za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w cienkich przekrojach stanowi doskonały system do badania nukleocytoplazmicznego...

Mikroiniekcja oocytów Opus lavu, a następnie elektronowa mikroskopia cienkich przekrojów, stanowi doskonały system do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. W tym doświadczeniu oocyty poddaje się defoliacji za pomocą kolagenazy, a następnie wybiera oocyty w szóstym stadium rozwoju i umieszcza je w płytce wielodołkowej. Następnie do oocytów wstrzykuje się mikroiniekcyjnie substrat importu jądrowego, po czym oocyty inkubuje się w temperaturze pokojowej, aby umożliwić przeniknięcie substratu do jądra komórkowego.Komórki są utrwalane i preparowane. Preparowane komórki są zatapiane w niskotopliwym agarozie, ponownie utrwalane w tetroksydzie osmu, odwadniane i zatapiane w żywicy epoksydowej. Próbki zatopione w żywicy epoksydowej są cięte ultramikrotomem, a otrzymane przekroje są umieszczane na miedzianej siatce do preparatów EM.Po barwieniu preparaty są wizualizowane pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym. Cześć, jestem Sarah Cohen z laboratorium dr Nellie Pane w Katedrze Zoologii na Uniwersytecie Kolumbijskim w Brytyjskiej Kolumbii. Jestem Shelly Ow, również z laboratorium Panta.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę mikroińjekcji komórek Zenap Lavis. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania importu jądrowego ładunków, takich jak wirusy. Zapraszamy do oglądania.Aby rozpocząć eksperyment, należy umieścić mały fragment jajnika Zenap Lavis o długości około dwóch centymetrów w probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml roztworu kolagenazy. Kolagenaza usuwa komórki mieszkowe otaczające cyty, następnie probówkę należy umieścić na platformie wytrząsowej i delikatnie mieszać przy 100 RPM przez 30 minut. Czas ten może się różnić w zależności od partii kolagenazy.Po jednej godzinie pobierz niewielką próbkę cytes i obejrzyj je pod mikroskopem stereoskopowym. Prawidłowo odliściaste cytes powinny być od siebie wyraźnie oddzielone. Wprowadź szklaną igłę do cyte, aby upewnić się, że wsuwa się ona z łatwością.Jeśli cyty nie są wystarczająco odfoliowane, należy pozostawić je w roztworze kolagenazy i sprawdzać stan co pięć minut. Po uzyskaniu odpowiedniego stopnia deregulacji cytów, należy przemyć je trzykrotnie modyfikowanym roztworem soli bar i przenieść do 100 milimetrowej szalki Petriego zawierającej MBS oraz 1% Penicyliny streptomycyny. Przy użyciu mikroskopu sekcyjnego należy wybrać dożrzałe cyty w stadium szóstym do mikroiniekcji.Komórki te są duże i wykazują wyraźny kontrast między czarnym biegunem zwierzęcym a kremowym biegunem roślinnym. Przenieś dojrzałe komórki w szóstym stadium do płytki wielodołkowej. W tym celu użyj pipety o objętości 200 µL z końcówką odciętą na brzegu, aby umożliwić niezakłócone zassanie oocytów, a następnie ostrożnie przenieś oocyty do dołków płytki.Używamy płytki z mikrododatkami o objętości dołka 10 µL. Miejsca wstrzykiwania są teraz przygotowane do mikroiniekcji. Przygotuj substrat do mikroiniekcji, dodając 1 µL 1% błękitu bromofenolowego do 10 µL substratu. Barwnik błękit bromofenolowy umożliwia wizualizację procesu mikroiniekcji.Następnie umieść mały pasek parafilmy na szalce Petriego o średnicy 100 millimeter i nanieś pięciomikrolitrową kroplę roztworu do iniekcji na pasek parafiny. Następnie przygotuj igłę do iniekcji, wyciągając mikropipetę Drummond o pojemności 6,6 microliter za pomocą wyciągarki Matt Puller. Skalibruj igłę do iniekcji, wykonując na niej kropkowe oznaczenia co 0,5 millimeters, co odpowiada objętości 50 nanoliters. Ustaw mikroinjektor w trybie aspiracji i napełnij igłę roztworem do iniekcji w celu przeprowadzenia iniekcji cytoplazmatycznej.Wprowadź końcówkę igły do cyty w półkuli wegetatywnej, bardzo blisko półkuli zwierzęcej, pod kątem około 45 stopni. Następnie przełącz ustawienie mikroinjektora na tryb mikroiniekcji i wstrzyknij do każdej cyty 50 nanolitrów substratu importacyjnego. Obserwuj znaczniki kropkowe na igle, aby monitorować ilość wstrzykniętego substratu po zakończeniu iniekcji.Przenieś komórki do 35 milimetrowej szalki Petriego wypełnionej buforem MBS. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez wybrany czas. Wybierz punkty czasowe umożliwiające obserwację importu substratu związanego z kompleksami porów jądrowych lub NPC.Zazwyczaj stosujemy punkty czasowe od 10 do 30 minut dla białek i wirusów, które są aktywnie transportowane w kierunku NPC. Punkty czasowe te zależą również od miejsca iniekcji oraz rozmiaru białka lub wirusa. Po zakończeniu inkubacji przenieś cyty do szklanej fiolki o pojemności czterech mililitrów zawierającej 2% glutaraldehydu w MBS i utrwalaj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj cyty trzykrotnie za pomocą MBS; teraz można przystąpić do sekcji cytów.Przenieś oocyty do małej szalki Petriego wypełnionej buforem o niskim zasoleniu. Używając mikroskopu stereoskopowego i pęsety anatomicznej, usuń biegun wegetatywny z każdego oocytu. Warto stabilizować oocyt jedną pęsetą, podczas gdy drugą należy wykorzystać w sposób przypominający działanie nożyczek, aby odciąć biegun wegetatywny; ten etap preparowania znacznie ułatwia lokalizację jądra podczas przycinania i sekcjonowania próbek do mikroskopii elektronowej.Na tym etapie obecność niebieskiego zabarwienia w cytozolu świadczy o pomyślnym przeprowadzeniu mikroiniekcji; należy odrzucić cyty, w których mikroiniekcja nie powiodła się. Następnie ponownie utrwalone cyty utrwala się 2% glutaraldehydem w LSB przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; po utrwaleniu cyty płucze się trzykrotnie w LSB. Po wypłukaniu cytów można przystąpić do przygotowania iniekcyjnych oocytów do zatopienia i cięcia na cienkie skrawki em.Przenieś wypreparowane oocyty na szkiełko z wgłębieniem, odessij jak największą ilość cieczy, a następnie działaj szybko, aby nie dopuścić do ich wyschnięcia. Przykryj wypreparowane komórki 2% niskotopliwą agaroza, gdy jest ona jeszcze miękka. Użyj końcówki pipety, aby oddzielić od siebie komórki i upewnić się, że każda z nich jest skierowana albo stroną górną, albo dolną do góry, ale nie bokiem.Pozostaw agrosy do zestalenia na około 10 minut. Po zestaleniu agrosów użyj żyletki, aby pociąć je na małe kawałki, z których każdy zawiera jedną wypreparowaną komórkę. Następnie umieść komórki zatopione w agrosach w szklanej fiolce o pojemności czterech mililitrów i za pomocą mieszadła obrotowego utrwal je w 1% osmidzie tetratlenku w LSB przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po godzinnej fiksacji, jeśli to konieczne, przemyj próbkę trzykrotnie w LSB. Przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc i kontynuuj protokół następnego dnia. Przeprowadź sekwencyjną dehydratację próbek w 50%, 70% i 90% etanolu przez 20 minut w każdym z tych stężeń, a następnie przeprowadź dehydratację dwukrotnie w 100% etanolu przez 15 minut w każdym cyklu.Na koniec odwodnij próbki w 100% acetonie przez 15 minut. Po zakończeniu etapów odwadniania przeprowadź infiltrację próbek mieszaniną eponu, flua i acetonu w stosunku jeden do jednego przez jedną godzinę, następnie infiltrację mieszaniną eponu i acetonu w stosunku dwa do jednego przez dwie godziny, a na koniec w czystym eponie przez co najmniej sześć godzin. Po zakończeniu końcowego etapu infiltracji umieść próbki w płaskich formach do zatapiania wypełnionych świeżym, czystym eponem.Zorientuj cyty w taki sposób, aby w pierwszej kolejności wycięte zostały sekcje strony jądra znajdującej się bliżej miejsca wstrzyknięcia. W tym przypadku sekcjonowana będzie strona cytów, która została wypreparowana. Krok ten optymalizuje szansę na wizualizację importu wybranego substratu.Po prawidłowym zorientowaniu komórek polimeryzuj epon przez dwa dni w temperaturze 60 °C. Po etapie polimeryzacji wykonaj za pomocą ultramikrotomu przekroje o grubości 50 nm z próbek zatopionych w żywicy epoksydowej. Przekroje zbierz na miedzianej siateczce do EM, zabarw próbki i poddaj je obserwacji za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.Jeśli protokół przebiegł pomyślnie, otoczka jądrowa oraz kompleksy porów jądrowych (NPC) powinny być wyraźnie widoczne na mikrografiach em. W zależności od wstrzykniętego substratu oraz czasu pomiędzy wstrzyknięciem a utrwaleniem, substrat powinien być widoczny na cytoplasmicznej stronie NPC, w obrębie NPC lub na jądrowej stronie NPC. Ten reprezentatywny wynik przedstawia przekrój poprzeczny otoczki jądrowej z przyległą cytoplazmą i jądrem komórkowym z komórki zenap, do której wstrzyknięto kapsydy wirusa vao.Groty strzałek A-C-M-N-P-V wskazują na NPC, a biała strzałka wskazuje kapsyd dokujący do cytoplazmatycznej strony NPC. W przeciwieństwie do tego, na niniejszej rycinie przedstawiono przekrój otoczki jądrowej z sąsiednią cytoplazmą i jądrem oocyty zenap, do której wstrzyknięto parwowirusa mysiego. Stosując tę technikę, odkryliśmy, że MVM indukuje przerwy w ciągłości otoczki jądrowej.Nawiasy wskazują przerwy w otoczce jądrowej. Groty strzałek wskazują NPC, a domniemane kapsydy MVM związane z otoczką jądrową są oznaczone białymi strzałkami. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić mikroiniekcję i mikrodysekcję komórek Xenopus laevis.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że różne partie kolagenazy mogą się od siebie różnić. Należy zatem dokładnie przetestować kolagenazę, aby określić optymalny czas defoliacji. Ponadto, po etapie defoliacji i przemywania w roztworze MBS, cyty można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie jeden tydzień przed mikroiniekcją.Na koniec, zawsze przechowuj preparaty w lodzie i nigdy nie dopuść do wyschnięcia tkanek. Powinny one pozostać całkowicie zanurzone podczas wszystkich etapów odwadniania i infiltracji. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroiniekcja komórek jajowych Xenopus Laevis

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Naucz się mikroiniekcji oocytów Xenopus laevis w celu badania transportu jądrowo-cytoplazmatycznego. Ta metoda umożliwia wizualizację substratów importowych za pomocą mikroskopii elektronowej.

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów