Rozwarstwienie larwy Drosophila
4 lutego 2009
Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić sekcję larw Drosophila w ramach przygotowań do immunohistochemii i/lub obrazowania połączenia nerwowo-mięśniowego.
Ta procedura rozpoczyna się od umieszczenia trzeciej larwy w stadium rozwojowym na płytce preparyjnej. Szpilki umieszcza się w tylnych i przednich końcach larw. Nożyczki służą do rozcinania larw, a kleszcze służą do usuwania narządów wewnętrznych.
Na koniec w każdym rogu ściany ciała larwy umieszcza się cztery kolejne kołki, aby utrzymać ją napiętą podczas mocowania. Cześć, nazywam się Jonathan Brent i pracuję w laboratorium Briana McCabe'a na Wydziale Fizjologii i Biofizyki w Columbia University College of Physicians and Surgeons. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę rozwarstwienia larwy Drosophila i MJ.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania rozwoju synaps połączenia nerwowo-mięśniowego. Więc zacznijmy. U larw Drosophila na segment hemi przypada 30 mięśni, których rozmieszczenie w obwodowej ścianie ciała jest znane.
W sumie 35 neuronów ruchowych unerwia te mięśnie w wysoce stereotypowy wzór. Aby uzyskać dostęp do połączenia nerwowo-mięśniowego lub NMJ, konieczne jest dokładne wypreparowanie każdej larwy z odpowiednią sekcją. NMJ może być stosowany do obrazowania immunohistochemii lub elektrofizjologii.
Procedurę należy rozpocząć od naniesienia kropli buforu HL 3.1 na płytkę separacyjną. Bufor jest przygotowywany z wyprzedzeniem i schładzany na lodzie. Ostrożnie wybierz wędrujące larwy gwiazdy trzeciego końca z boku fiolki za pomocą dużych kleszczy SS.
Ruch wskazuje, że larwa nie weszła do przepoczwarzenia Umieść larwy grzbietem do góry w kropli buforowej na płytce rozwarstwiającej. Zimny bufor znieczuli larwy i utrzyma je w bezruchu za pomocą kleszczy. Umieść szpilkę mnuchin między tylnymi kulami, a następnie umieść drugą szpilkę w pobliżu ciemnych haczyków do ust, aby larwy były rozciągnięte i gotowe do otwarcia.
Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe poziome nacięcie w kierunku tylnego końca larw. Włóż jedno ostrze nożyczek do scisek i wykonaj cięcie wzdłuż w kierunku przedniego końca larwy. Następnie wykonaj poziome nacięcia na przednim końcu larw po lewej i prawej stronie szpilki.
Aby usunąć narządy, takie jak jelita, dodaj kilka kropli buforu HL 3.1 do zwierzęcia, jelito i inne narządy uniosą się do roztworu i można je odciągnąć od ciała za pomocą kleszczy. Usuń również system tchawicy wraz z innymi narządami. Teraz odsłoń wewnętrzne mięśnie ciała, przypinając klapy utworzone przez nacięcia.
Pamiętaj, aby rozciągnąć ściany korpusu otwarte w poziomie i w pionie. Podczas przypinania klap. Usuń wszelkie pozostałe części narządów i umyj je raz.
Dodając świeży bufor HL 3.1, larwa jest teraz gotowa do utrwalenia za pomocą świeżo przygotowanego formaldehydu rozcieńczonego do 3,5% w jednym XPBS całkowicie zanurz larwy i utrwalacz i odczekaj 25 minut. Po upływie okresu utrwalania należy przemyć larwy dwukrotnie buforem HL 3.1 przez trzy minuty. Ostrożnie usuń szpilki, w razie potrzeby przenieś larwy do probówek o średnicy 1,5 mil zawierających jeden XPBS.
Larwy można przechowywać do dwóch dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uzyskać optymalne wyniki, natychmiast użyj wypreparowanych larw. Istnieje kilka kluczowych elementów prawidłowo wypreparowanej larwy Drosophila.
Po pierwsze, uważaj, aby nie uszkodzić mięśni, zwłaszcza sześciu, siódemki i czwórki. Po drugie, zwierzę musi być odpowiednio rozciągnięte. W przeciwnym razie połączenie nerwowo-mięśniowe może nie być dostępne lub nie do odróżnienia.
Tutaj możesz zobaczyć odpowiednio wypreparowaną larwę. NMJ jest dobrze widoczny, a system jest teraz gotowy do eksperymentów. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić sekcję larwy przełyku, aby zbadać połączenie nerwowo-mięśniowe.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać mięśnie w nienaruszonym stanie. Jeśli mięśnie są uszkodzone, nie będzie żadnych połączeń nerwowo-mięśniowych do badania. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego. Procedura obejmuje precyzyjne rozmieszczenie szpilek oraz użycie nożyczek i pincet w celu przygotowania larw do dalszej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Immunohistochemia
Wstęp
- Larwy Drosophila są powszechnie wykorzystywane w badaniach neurobiologicznych.
- Złącze nerwowo-mięśniowe jest kluczowym obszarem badania przekazywania sygnałów synaptycznych.
- Właściwe techniki mikrodysekcji są niezbędne dla sukcesu obrazowania i analizy.
- Niniejszy protokół przedstawia standaryzowaną metodę dysekcji larw.
Cel badania
- Przygotowanie larw Drosophila do analizy immunohistochemicznej.
- Ułatwienie obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.
- Standaryzacja technik sekcji w celu zapewnienia powtarzalności badań.
Zastosowane metody
- Umieszczenie szpilek w celu stabilizacji larw podczas sekcji.
- Użycie nożyczek do otwarcia larw.
- Usunięcie narządów wewnętrznych za pomocą pęsety.
- Fiksacja ściany ciała do celów obrazowania.
Główne wyniki
- Prawidłowa dyssekcja umożliwia wyraźną wizualizację złącza nerwowo-mięśniowego.
- Ustandaryzowane metody zwiększają powtarzalność wyników w różnych eksperymentach.
- Ułatwia dalsze badania nad funkcją i rozwojem synaptycznym.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań w dziedzinie neurobiologii Drosophila.
Wnioski
- Disekcja larw Drosophila jest kluczowym etapem w badaniach neurobiologicznych.
- Właściwe techniki poprawiają jakość analiz immunohistochemicznych.
- Niniejszy protokół stanowi cenny zasób dla badaczy w tej dziedzinie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) larwy Drosophila służy jako genetycznie podatny model do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej, oferując wysoką dostępność oraz rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek. Niniejszy protokół sekcji umożliwia powtarzalne przygotowanie NMJ do dalszych zastosowań, takich jak obrazowanie, immunohistochemia i elektrofizjologia, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Poprzez zapewnienie zestandaryzowanej metody izolacji i wizualizacji struktur synaptycznych, technika ta zwiększa pewność prognostyczną w ocenie neurobiologicznych celów oraz wyjaśnianiu szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z funkcją synaptyczną i szlakami rozwoju neurologicznymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez wysokowierną wizualizację wzorców unerwienia mięśni przez neurony ruchowe.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę wpływu interwencji genetycznych lub farmakologicznych na morfologię i funkcję NMJ.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje standaryzowane systemy biologiczne do przesiewania związków, zapewniając spójny dostęp do połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ).
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar liczby i wielkości wypustek synaptycznych oraz lokalizacji białek jako odczytów fenotypowych.
- Skalowalność: Wspiera równoległe przetwarzanie larw w ramach kampanii przesiewowych o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modele zachowawczych mechanizmów synaptycznych, które można zastosować do walidacji celów w chorobach neurodegeneracyjnych i zaburzeniach nerwowo-mięśniowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia genetyczne u Drosophila z biologią synaptyczną ssaków poprzez zachowane szlaki sygnałowe.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Umożliwia wczesną ocenę oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków w żywym, nienaruszonym systemie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przepływ pracy z zakresu sekcji wpisuje się w wczesną fazę odkrywania poprzez umożliwienie testowania hipotez, prowadzi do identyfikacji wiodących cząsteczek za pomocą mierzalnych fenotypów synaptycznych i wspiera walidację przedkliniczną dzięki screeningowi fenotypowemu w odniesieniu do konkretnych chorób.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków synaptycznych i walidację funkcjonalną celów poprzez bezpośrednią wizualizację NMJ.
- Przesiewanie: Dostarcza preparaty gotowe do analizy z powtarzalnymi odczytami strukturalnymi i fluorescencyjnymi do oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe dane morfologiczne i immunohistochemiczne do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy mechanizmy synaptyczne Drosophila z modelami przedklinicznymi poprzez konserwatywne szlaki molekularne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny neurocelów w ramach wielu kampanii odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przygotowania NMJ pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki możliwości wczesnego wykrycia toksyczności synaptycznej lub zaangażowania celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów neurologicznych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o funkcjonalne wyniki synaptyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z Drosophila, mikrochirurgii oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Metoda wymaga użycia płytek sekcyjnych, szpilek entomologicznych, nożyczek sprężynowych, pęset oraz buforu HL 3.1.
- Niezbędna jest standaryzacja napięcia szpilek oraz warunków buforowych dla wszystkich użytkowników.
- W ramach dostosowania należy uwzględnić różne stadia larwalne oraz tła genetyczne wpływające na integralność mięśni.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymaganą sprawność manualną oraz ryzyko uszkodzenia mięśni w przypadku nieprecyzyjnej sekcji.
