Name: Rozwarstwienie larwy Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj technikę rozwarstwienia larw Drosophila w celu analizy immunohistochemicznej i obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego. Metoda ta umożliwia badanie transmisji synaptycznej w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przed rozpoczęciem
<ol>
<li>Wszystkie kultury należy hodować w temperaturze 25° C.</li>
<li>Bufor do sekcji HL3.1 można przygotować wcześniej. Odmierzyć 50 ml buforu HL3.1 i przechowywać go w lodzie.</li>
<li>Przygotować 15 ml świeżego 3,5% Formaldehyde w buforze HL3.1. Przechowywać w lodzie.</li>
</ol>
Disekcja larwy
<ol>
<li>Nanieś kroplę zimnego roztworu HL3.1 na płytkę sekcyjną. Zapobiegnie to wysychaniu zwierzęcia i go ogłuszy, co ułatwi pracę.</li>
<li>Używając długiej pęsety, wybierz wędrującą larvę trzeciego stopnia i umieść ją w kropli HL3.1.</li>
<li>Najpierw za pomocą krótkiej pęsety chwyć szpilkę minutien. Umieść szpilkę pomiędzy przetchlikami tylnymi. Zwierzę zazwyczaj będzie próbowało odpełznąć od szpilki, wyciągając się, co ułatwi precyzyjne wbicie kolejnej szpilki w głowę larwy w pobliżu haczyków gębowych. Rozciągnij zwierzę wzdłuż jego osi. Pomoże to zmaksymalizować powierzchnię odsłoniętej ściany ciała podczas nacinania. Uwaga: Jeśli zdecydujesz się najpierw przypiąć głowę, zwierzę może owinąć ciało wokół szpilki lub gwałtownie nim machać, co utrudni przypięcie. Można temu zazwyczaj przeciwdziałać, usuwając HL3.1 i dodając świeżą zimną kroplę, aby ponownie ogłuszyć zwierzę. Naukowiec sprawnie posługujący się obiema rękami może po prostu chwycić zwierzę i unieruchomić je w miejscu.</li>
<li>Używając nożyczek sprężynowych, wykonaj nacięcie poziome tuż przed tylną szpilką na stronie grzbietowej larwy. Wsuń jedno ostrze nożyczek w nacięcie i wykonaj cięcie pionowe wzdłuż linii środkowej grzbietu w kierunku końca rostralnego larwy. W części rostralnej zwierzęcia wykonaj nacięcia poziome po lewej i prawej stronie szpilki. Uwaga: końcowy efekt powinien przypominać literę I na stronie grzbietowej larwy wzdłuż osi rostrokaudalnej.</li>
<li>Usuń organy. Zacznij od dodania kilku dodatkowych kropli HL3.1 na larvę. Dzięki temu organy wypłyną z ciała, co pozwoli na znacznie łatwiejsze ich usunięcie. Najpierw usuń układ tchawkowy. Następnie za pomocą pęsety chwyć pozostałe organy i usuń je.</li>
<li>W kroku 3 utworzyłeś lewą i prawą zakładkę ściany ciała. Przypnij zakładki zgodnie z ruchem wskazówek zegara, dbając o to, aby rozciągnąć ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie.</li>
</ol>
Fiksacja
Utrwal każde zwierzę w 3,5% formaldehydzie w HL3.1 przez 25 minut. Przemyj zwierzę dwukrotnie w HL3.1 przez 5 minut.
Przechowywanie
Usuń szpilki i przenieś larwy do probówki 1,5 ml zawierającej 1X PBS. Jeśli planujesz obrazowanie NMJ z wykorzystaniem fuzji znaczników fluorescencyjnych, zwierzęta należy poddać obrazowaniu w ciągu dwóch dni. Wypreparowane larwy można przechowywać do jednego tygodnia w temperaturze 4°C.
Reprezentatywne wyniki
Prawidłowo zdyssekowana larwa Drosophila składa się z kilku kluczowych elementów. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mięśni, zwłaszcza mięśni 4, 6 i 7. Są to najczęściej badane mięśnie i w przypadku ich uszkodzenia należy odrzucić przygotowany płatek i zdyssekować inne zwierzę. Po drugie, należy upewnić się, że zwierzę jest maksymalnie rozciągnięte, aby każdy mięsień i NMJ były możliwe do rozróżnienia.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Technika sekcji zaprezentowana w tym filmie może być wykorzystana do przygotowania larw Drosophila do różnorodnych technik eksperymentalnych. W przypadku obecności fluorescencyjnych znaczników białkowych, larwy mogą zostać zamontowane i poddane obrazowaniu natychmiast. W przeciwnym razie można przeprowadzić immunobarwienie w celu oznakowania specyficznych przedziałów synaptycznych. Ponadto na wysekcjonowanych larwach można łatwo przeprowadzić badania elektrofizjologiczne, aby ocenić funkcjonowanie neurotransmisj...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe Vannasa 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-0</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td>Długa pęseta</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Krótki pęseta</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego SylGard 182</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Służy do przygotowywania płytek do sekcji</td></tr><tr><td>Formaldehyd </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne ze stali nierdzewnej – średnica 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do sekcji HL3: (w mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalozy, 115 sacharozy i 5 HEPES, pH 7,3.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Płytka do sekcji z Sylgardu: Delikatnie wymieszać (aby uniknąć pęcherzyków powietrza) w zlewce w proporcji 10:1. Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Płytka do sekcji z Sylgardu: W zlewce delikatnie wymieszać składniki w proporcji 10:1 (aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza). Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić Sylgard do utwardzenia na noc w inkubatorze w temperaturze 37°C.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;br/&gt;Płytka do sekcji z Sylgardu: W zlewce delikatnie wymieszać (aby uniknąć pęcherzyków powietrza) w stosunku 10:1. Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić Sylgard do utwardzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C.</td></tr><tr><td colspan="4">Płytka do sekcji Sylgard: Delikatnie zmieszać (aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza) w proporcji 10:1 w zlewce. Wlać mieszaninę do szalki Petriego (dowolnego rozmiaru). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C.</td></tr></tbody></table>

disekcja nmj larw drosophila

Drosophila Larval NMJ Dissection

TheDrosophilazłącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest uznanym modelem systemowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanieDrosophilaukład ruchowy ze względu na jego wysoką dostępność. Można go analizować z rozdzielczością pojedynczych komórek. Na każdy hemisegment przypada 30 mięśni, których rozmieszczenie w obrębie obwodowej ściany ciała jest znane. Łącznie 35 neuronów ruchowych przyłącza się do tych mięśni w sposób wykazujący wysoką wierność. Wykorzystując biologię molekularną i genetykę, można tworzyć zwierzęta transgeniczne lub mutanty. Następnie można badać konsekwencje rozwojowe dla morfologii i funkcji NMJ. Aby uzyskać dostęp do NMJ w celu przeprowadzenia badań, konieczne jest staranne wypreparowanie każdej larwy. W niniejszym artykule demonstrujemy, jak prawidłowo przeprowadzić preparacjęDrosophilalarwy do badania NMJ poprzez usunięcie wszystkich organów wewnętrznych przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej ściany ciała. Technika ta jest odpowiednia do przygotowania larw do obrazowania, immunohistochemii lub elektrofizjologii.

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) muchówki *Drosophila* jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanie...

Procedura rozpoczyna się od umieszczenia larwy w trzecim stadium rozwojowym na płytce sekcyjnej. W tylnym i przednim końcu larwy umieszcza się szpilki. Za pomocą nożyczek przecina się ciało larwy, a następnie przy użyciu pęsety usuwa się narządy wewnętrzne.Na koniec w każdym rogu ścianki ciała larwy umieszcza się cztery kolejne szpilki, aby utrzymać ją w napięciu podczas utrwalania. Cześć, nazywam się Jonathan Brent i pochodzę z laboratorium Briana McCabe'a w Departamencie Fizjologii i Biofizyki Socjalnej na Columbia University College of Physicians and Surgeons. Dzisiaj przedstawimy procedurę sekcji larwy drosophila oraz MJ.Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania rozwoju synaptycznego złącza nerwowo-mięśniowego. Zacznijmy zatem. Larwy Drosophila posiadają 30 mięśni na każdy półsegment, których rozmieszczenie w obrębie obwodowej ściany ciała jest znane.Łącznie 35 neuronów ruchowych unerwia te mięśnie w wysoce stereotypowy sposób. Aby uzyskać dostęp do złącza neuromięśniowego (NMJ), konieczne jest uważne wypreparowanie każdej larwy przy użyciu odpowiedniej techniki sekcji. NMJ może być wykorzystywane do obrazowania, immunohistochemii lub elektrofizjologii.Procedurę rozpoczynaj od naniesienia kropli buforu HL 3.1 na płytkę sekcyjną. Bufor przygotowuje się wcześniej i chłodzi na lodzie. Ostrożnie wyłów z boku fiolki poruszającą się larwę w stadium trzeciego końca (third end star larvae), używając dużych kleszczyków stalowych (SS).Ruch wskazuje, że larwa nie weszła w stadium pocieczy. Umieść larwę stroną grzbietową do góry w kropli buforu na płytce sekcyjnej. Zimny bufor znieczuli larwę i unieruchomi ją. Używając pęsety, umieść szpilkę entomologiczną pomiędzy tylnymi sferami, a następnie wbij drugą szpilkę blisko ciemnych haczyków gębowych, tak aby larwa była rozciągnięta i gotowa do rozwarcia.Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe poziome nacięcie w kierunku tylnego końca larwy. Wsuń jedno ostrze nożyczek w nacięcie i wykonaj cięcie wzdłużne w kierunku przedniego końca larwy. Następnie wykonaj nacięcia poziome na przednim końcu larwy, po lewej i prawej stronie szpilki.Aby usunąć narządy, takie jak jelita, należy dodać kilka kropel buforu HL 3.1 do zwierzęcia; jelita i pozostałe narządy wypłyną do roztworu, skąd można je oddzielić od ciała za pomocą pęsety. Należy również usunąć układ tchawkowy wraz z pozostałymi narządami. Następnie należy odsłonić wewnętrzne mięśnie ciała, odchylając i przypinając płaty powstałe w wyniku nacięć.Należy pamiętać o rozciągnięciu ścian ciała w płaszczyźnie poziomej i pionowej. Podczas przypinania płatów należy usunąć wszelkie pozostałe fragmenty organów i raz wypłukać.Po dodaniu świeżego buforu HL 3.1 larwa jest gotowa do utrwalenia świeżo przygotowanym formaldehydem rozcieńczonym do 3,5% w 1x PBS; całkowicie zanurz larwy w utrwalaczu i odczekaj 25 minut. Po zakończeniu procesu utrwalania przemyj larwy dwukrotnie buforem HL 3.1 przez trzy minuty. Ostrożnie usuń szpilki, a następnie przenieś larwy do probówek 1,5 ml zawierających 1x PBS, jeśli jest to konieczne.Larwy można przechowywać do dwóch dni w temperaturze 4°C. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy wykorzystać zdyssekowane larwy niezwłocznie. Prawidłowo zdyssekowana larwa drosofilowa składa się z kilku kluczowych elementów.Po pierwsze, należy uważać, aby nie uszkodzić mięśni, w szczególności mięśnia szóstego, siódmego i czwartego. Po drugie, zwierzę musi być odpowiednio rozciągnięte. W przeciwnym razie złącze nerwowo-mięśniowe może być niedostępne lub nierozpoznawalne.Tutaj można zobaczyć prawidłowo zdyssekowaną larwę. NMJ jest wyraźnie widoczna, a układ jest teraz gotowy do przeprowadzenia eksperymentów. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić dyssekcję larwy w obrębie przełyku w celu zbadania złącza neuromięśniowego.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować mięśnie w nienaruszonym stanie. Jeśli mięśnie zostaną uszkodzone, nie będzie możliwości zbadania złączy nerwowo-mięśniowych. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przekroczenie NMJ larw Drosophila

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

In situ rejestracje metodą patch clamp są wykorzystywane do charakterystyki elektrofizjologicznej neuronów w nienaruszonych obwodach. W modelu genetycznym Drosophila technika patch clamp jest trudna, ponieważ OUN jest mały i otoczony wytrzymałą osłoną. Niniejszy artykuł opisuje procedurę usuwania osłony oraz oczyszczania neuronów w celu przeprowadzenia późniejszych rejestracji metodą patch clamp.

Przygotowanie neuronów ośrodkowych Drosophila do metody in situ patch clamp

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.

Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila

Opisujemy technikę sekcji, która zachowuje architekturę połączenia nerwowo-mięśniowego i umożliwia szczegółowe badanie immunocytochemiczne neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila.

Rozwarstwienie i immunohistochemia dorosłej nogi Drosophila w celu wykrycia zmian w połączeniu nerwowo-mięśniowym dla zidentyfikowanego neuronu ruchowego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj technikę rozwarstwienia larw Drosophila w celu analizy immunohistochemicznej i obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego. Metoda ta umożliwia badanie transmisji synaptycznej w neurobiologii.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów