Name: Izolacja ludzkich wysp trzustkowych: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich wysp trzustkowych poprzez trawienie tkanki z wykorzystaniem zautomatyzowanej perfuzji kolagenazą. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości wysp przeznaczonych do transplantacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe zapewnili Uniwersytet Illinois w Chicago oraz National Institutes of Health w ramach grantu dla Islet Cell Resource Center (RFA-RR 05-003), a także fundacje Christopher Foundation, Efroymson Foundation i Tellabs Foundation.

1. Przygotowanie zaplecza
<ol>
<li>Izolacja wysepek trzustkowych człowieka jest procedurą wrażliwą na czas, która wymaga pracy zespołowej, dlatego do jej przeprowadzenia potrzebne są cztery osoby. Zespołem kieruje chirurg, który dokonuje wycięcia i kanulacji trzustki.</li>
<li>Izolacja wysepek rozpoczyna się w momencie wejścia zespołu do laboratorium izolacji wysepek UIC. Członkowie zespołu upewniają się, że cała niezbędna aparatura, taka jak wirówka, została sprawdzona i włączona. Dbają również o dezynfekcję wszystkich dygestoriów i powierzchni.</li>
<li>Dwie osoby przygotowują stół do kanulacji, maszynę do chłodzenia (slush machine), układ trawienia, jednostkę perfuzyjną, maszynę do oczyszczania COBE oraz stoły chirurgiczne.</li>
<li>Jednocześnie dwóch pozostałych członków zespołu przygotowuje pożywki niezbędne podczas izolacji.</li>
<li>Następnie przygotowywane są probówki bakteriologiczne (butelki, probówki, formularz i worek), probówki do pobierania próbek (wypełnione wcześniej roztworem płuczącym) oraz probówki i płytki do oceny.</li>
<li>Zestaw probówek do oczyszczania należy przygotować w następujący sposób: pierwsza probówka pozostaje pusta i jest zaznaczona do poziomu 150 ml, probówki od 2 do 12 są wypełnione 200 ml pożywki M199 uzupełnionej o albuminę ludzką (roztwór płuczący) i zaznaczone do poziomu 230 ml, a na koniec jedna probówka stożkowa 50 ml jest wypełniona 50 ml roztworu płuczącego. Po zakończeniu tych etapów przygotowawczych można przystąpić do przygotowania i perfuzji trzustki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i perfuzja trzustki
<ol>
<li>Aby rozpocząć przygotowanie i perfuzję trzustki, operator wyjmuje organ z opakowania, stosując technikę sterylną. Następnie chirurg przenosi trzustkę na stół do dekontaminacji.</li>
<li>Chirurg napełnia jedną strzykawkę o pojemności 60 ml oryginalnym roztworem do konserwacji trzustki i przekazuje ją operatorowi, który wykorzystuje go do napełnienia przygotowanych butelek bakteriologicznych do „pobrania” (Procurement).</li>
<li>Po inspekcji wizualnej w celu ustalenia, czy organ nadaje się do izolacji wysepek (jeśli trzustka została uszkodzona podczas pobrania lub wykazuje nieprawidłowości anatomiczne, nie może być użyta do izolacji wysepek), chirurg prosi operatora o przygotowanie kolagenazy. Należy pamiętać, że czas resuspensji różni się w zależności od marki i serii enzymu.</li>
<li>Gdy chirurg będzie gotowy, należy dostarczyć roztwory do dekontaminacji (Betadine, Fungizone/Cefazolin oraz HBSS) na stół do dekontaminacji i przelać je do odpowiednich pojemników. Chirurg przeprowadza mycie dekontaminacyjne trzustki, płucząc ją przez minutę w każdym z roztworów do dekontaminacji. Następnie trzustkę umieszcza się w małym sterylnym słoiku, w którym zostaje zważona. Po wprowadzeniu wagi do dokumentacji partii (batch record), trzustkę umieszcza się w kuwecie do kaniulacji z niewielką ilością roztworu do konserwacji.</li>
<li>Chirurg odsłania i częściowo nacinaje główny przewód trzustkowy, a następnie kaniuluje każdą połowę trzustki za pomocą kaniuli. Kaniulę mocuje się szwem. Aby przeprowadzić perfuzję trzustki, należy najpierw przenieść ją do jednostki perfuzyjnej i wlać roztwór enzymu do zbiornika. Całkowity czas perfuzji wynosi około 10 minut: 5 minut przy ciśnieniu 80 mmHg, a następnie 5 minut przy 180 mmHg. Po perfuzji trzustka powinna być rozszerzona.</li>
<li>Perfundowaną trzustkę przenosi się do kuwety do kaniulacji, gdzie ostrożnie usuwa się tkankę tłuszczową. Następnie trzustkę tnie się na 10-12 kawałków i przenosi do komory Ricordiego w celu trawienia.</li>
</ol>
3. Trawienie trzustkowe
<ol>
<li>Aby rozpocząć etap trawienia, przenieś trzustkę do pustej komory Ricordi, dodaj jedną fiolkę 2,5 ml Pulmozyme, ułóż tkankę na sitku (unikając dużych fragmentów, które mogłyby zablokować komorę), zamknij komorę i napełnij system.</li>
<li>Uruchom pompowanie roztworu na 5 minut. Delikatnie kołysz komorą, aby równomiernie rozprowadzić ciepły roztwór. Po pięciu minutach delikatnie potrząsaj komorą przez całą fazę trawienia. Utrzymuj temperaturę na poziomie 37˚C.</li>
<li>Delikatnie kołysz komorą, aż temperatura osiągnie 37°, a następnie potrząsaj komorą. Pobieraj próbkę co dwie minuty i sprawdzaj pod mikroskopem, czy obecne są wolne wysepki. Zapisz informacje z oceny wysepek w tabeli trawienia w protokole serii. Kontynuuj monitorowanie odsetka wysepek, aż 50% z nich będzie swobodnie pływać i będzie wyizolowanych w roztworze.</li>
</ol>
4. Pobieranie tkanek
<ol>
<li>Gdy w próbkach stwierdzi się, że 50% wysepek jest wolnych, trawienie zostaje zatrzymane poprzez dodanie do obiegu zimnego roztworu rozcieńczającego RPMI. Tkankę zbiera się do probówek stożkowych o pojemności 500 ml, uprzednio wypełnionych 30 ml albuminy ludzkiej. Po odwirowaniu probówek odsysa się nadsącz i przemywa osad zimnym roztworem do mycia. Probówki stożkowe wiruje się przy 1100 RPM (obrotów na minutę) przez 1 minutę w temperaturze 4˚C.</li>
<li>Wszystkie probówki zbiorcze z zawiesiną strawionej tkanki trzustkowej łączy się w jednej probówce stożkowej o pojemności 500 ml. Gdy probówka wypełni się przemytą tkanką, wiruje się ją i powtarza proces mycia, aż cała tkanka zostanie przemyta kilkukrotnie. Następnie wiruje się tę probówkę i przenosi tkankę do jednej probówki stożkowej o pojemności 250 ml. Objętość uzupełnia się do 250 ml roztworem do mycia M199 uzupełnionym o HA i przygotowuje do pobrania próbek.</li>
<li>Za pomocą pipety pobiera się próbkę 1 ml i dodaje ją do probówki stożkowej o pojemności 15 ml, uprzednio wypełnionej 9 ml roztworu do mycia. Następnie miesza się zawartość, delikatnie odwracając probówkę stożkową 15 ml, a z niej pobiera się 1 ml bezpośrednio do komory licznikowej. Należy policzyć komórki i obliczyć ich liczbę, stosując czynnik rozcieńczenia 2500 (10x250).</li>
<li>Wirować probówkę stożkową 250 ml i dodać 150 ml roztworu UW (University of Wisconsin), który jest zazwyczaj stosowany do konserwacji organów. Po dodaniu UW należy dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety. Należy zapisać i przekazać operatorowi oczyszczania czas rozpoczęcia inkubacji w roztworze UW. Probówkę(i) pozostawia się na lodzie, okazjonalnie delikatnie nią potrząsając. Teraz wysepki mogą zostać poddane dalszemu oczyszczaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Na wynik izolacji wpływa szereg czynników 9,10. Wśród nich kluczową rolę odgrywa trawienie tkanki trzustki. W oparciu o nasze doświadczenie w izolacji ludzkich wysepek podsumowaliśmy następujące krytyczne punkty, które mogą potencjalnie wpływać na wydajność i jakość uzyskanych wysepek.
<ol>
<li>Czas trawienia różni się w zależności od rodzaju zastosowanych enzymów.</li>
<li>Gdy 40-50% wysepek zostanie całkowicie oddzielonych od tkanki zwojowej, trawienie należy natychmiast przerwać, dodając roztwór rozcieńczający i s...

<table><tbody><tr><td>Maszyna do produkcji lodu kruszonego</td><td>wyposażenie</td><td>Firma Taylor</td><td>K4036546</td><td>przygotowanie sterylnego lodu</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>sprzęt</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony MZ6 TLBD4.1</td><td>sprzęt</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli komórek z siatką 2 mm</td><td>wyposażenie</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>liczenie wysepek</td></tr><tr><td>Cyfrowa łaźnia wodna EX7</td><td>wyposażenie</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Termometr</td><td>wyposażenie</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>Waga MonoBloc Balance AB 104-S</td><td>wyposażenie</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>pomiar masy trzustki</td></tr><tr><td>Kontroler prędkości MasterFlex II</td><td>wyposażenie</td><td>Cole-Parmer</td><td>Pobieranie i izolacja RNA z tkanek roślinnych

Abstrakt
Izolacja wysokiej jakości całkowitego RNA jest kluczowym krokiem w wielu badaniach biologii molekularnej, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą RT-qPCR (ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją) oraz sekwencjonowaniu RNA. Tkanki roślinne stanowią jednak szczególne wyzwanie ze względu na obecność wielkich ilości wielocukrów, polifenoli i innych wtórnych metabolitów, które mogą współwytrącać się z kwasami nukleinowymi i hamować późniejsze reakcje enzymatyczne. W niniejszym filmie przedstawiono zoptymalizowany protokół ekstrakcji RNA z tkanek roślinnych przy użyciu metody opartej na izotiocyjanianie guanidyny i bromku fenolu, która zapewnia wysoką czystość i integralność uzyskanego materiału genetycznego.

Słowa kluczowe
izolacja RNA, tkanki roślinne, RT-qPCR, analiza ekspresji genów, bromek fenolu, izotiocyjanian guanidyny, oczyszczanie kwasów nukleinowych</td><td>regulacja prędkości przepływu podczas trawienia</td></tr><tr><td>Cyfrowy celownik DS L1</td><td>wyposażenie</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka perfuzyjna</td><td>wyposażenie</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego, proszę o przesłanie materiałów do tłumaczenia. Jestem gotowy do przetłumaczenia treści naukowych JoVE z języka angielskiego na polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i precyzji terminologicznej.</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnica do jednostki perfuzyjnej</td><td>wyposażenie</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Komora Ricordiego</td><td>sprzęt</td><td>University of Miami</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>roztwór rozcieńczający RPMI</td><td>odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>roztwór University of Wisconsin (UW)</td><td>odczynnik</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>25% albuminy ludzkiej</td><td>odczynnik</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>pożywka M199 (roztwór płuczący)</td><td>odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza NB1 klasy GMP</td><td>odczynnik</td><td>Elektroforeza SERVA</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna proteaza NB1 klasy GMP</td><td>odczynnik</td><td>Elektroforeza SERVA</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>odczynnik</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>odczynnik</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Dytyzon</td><td>odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja wysepek trzustkowych człowieka: część i: trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Leczenie cukrzycy typu 1 jest obciążeniem zarówno dla jednostki, jak i społeczeństwa, generując koszty przekraczające 100 miliardów dolarów rocznie. Pomimo powszechnego stosowania monitorowania glikemii i nowych formulacji insuliny, u wielu osób nadal rozwijają się wyniszczające powikłania wtórne. Transplantacja wysepek trzustkowych może przywrócić niemal normalną kontrolę poziomu glukozy u pacjentów z cukrzycą1, bez ryzyka wystąpienia ciężkich epizodów hipoglikemii związanych z intensywną insulinoterapią. Zapewnienie wystarczającej masy wysepek jest kluczowe dla powodzenia transplantacji wysepek. Jednakże charakterystyka dawcy, sposób pozyskania oraz konserwacja narządu wpływają na wynik izolacji2Na University of Illinois at Chicago (UIC) opracowaliśmy skuteczny protokół izolacji z ulepszonym gradientem oczyszczania3Program rozpoczął się w styczniu 2004 roku i do listopada 2008 roku przeprowadzono ponad 300 izolacji. Trzustki przesyłano w chłodnych roztworach konserwujących (UW, University of Wisconsin lub HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate)4-7do Laboratorium Izolacji Komórek w UIC w celu izolacji wysepek. Wysepki trzustkowe zostały wyizolowane metodą UIC, która jest zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Ricordiegoi wsp. 8. W skrócie, po oczyszczeniu trzustki z otaczających tkanek, przeprowadzono perfuzję roztworem enzymatycznym (Kolagenaza Serva + Proteaza Neutralna lub enzym Sigma V). Następnie obrzękłą trzustkę przeniesiono do komory trawiennej Ricordi, podłączono do zmodyfikowanego, zamkniętego systemu rurek cyrkulacyjnych i ogrzano do 37°C. Podczas trawienia komorę delikatnie wstrząsano. W celu monitorowania postępu trawienia pobierano próbki w sposób ciągły. Po wykryciu wolnych wysepek pod mikroskopem, proces trawienia zatrzymano poprzez wprowadzenie do systemu cyrkulacyjnego zimnego (4°C) roztworu rozcieńczającego RPMI (Mediatech, Herndon, VA) w celu rozcieńczenia enzymu. Po zebraniu i przemyciu w medium M199 uzupełnionym ludzką albuminą, pobrano próbkę tkanki do obliczenia liczby komórek przed oczyszczaniem, a następnie inkubowano ją w roztworze UW przed procesem oczyszczania. Proces oczyszczania zostanie opisany w Części II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek.

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Leczenie cukrzycy typu 1 jest obciążeniem zarówno dla jednostki, jak i dla społeczeństwa, generując roczne koszty przekraczające 100 miliardów dolarów. Pomimo powszechnego stosowania ...

Procedura rozpoczyna się od pozyskania normalnej tkanki trzustki od dawcy. Po krótkim etapie przycinania, obrzękła trzustka jest cięta na równe kawałki i przenoszona do komory trawienia. Trzustka zostaje zakanulowana, a roztwór kolagenazy jest wprowadzany przez kaniulę za pomocą zautomatyzowanej maszyny do perfuzji.Na koniec tkanka trzustki jest zbierana do stożkowych probówek o dużej objętości, a następnie poddawana dalszej puryfikacji w celu transplantacji wysepek, co zostanie pokazane w kolejnym filmie. Cześć, jestem American Chief z Laboratorium Programu Ludzkich Wysepek w Departamencie Chirurgii Uniwersytetu w Chicago. Cześć, nazywam się Barbara Barbero i również pracuję w Programie Ludzkich Wysepek.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji ludzkich wysepek trzustkowych. Stosujemy tę procedurę w naszej placówce w celu pozyskania wysokiej jakości ludzkich wysepek do zastosowań klinicznych. Zapraszamy do oglądania.Izolacja wysepek trzustki u ludzi jest procedurą ograniczoną czasowo, która wymaga pracy zespołowej, dlatego do jej przeprowadzenia potrzebne są cztery osoby. Zespołem kieruje chirurg, który dokonuje wycięcia i kaniulacji trzustki. Izolacja wysepek rozpoczyna się w momencie wejścia zespołu do placówki izolacji wysepek UIC.Członkowie zespołu upewniają się, że cała niezbędna aparatura, taka jak wirówka, została sprawdzona i włączona. Dbają również o dezynfekcję wszystkich wyciągów i powierzchni. Dwie osoby przygotują stół do kaniulacji, urządzenie do trawienia w maszynie do kruszenia lodu (slush machine), układ perfuzji, urządzenie do oczyszczania jednostek cope oraz stoły operacyjne.W tym samym czasie dwóch innych członków zespołu przygotuje pożywki niezbędne do izolacji. Następnie przygotowane zostaną probówki bakteriologiczne, probówki do pobierania próbek oraz probówki i płytki do oceny. Zestaw probówek do oczyszczania należy przygotować w następujący sposób: pierwsza probówka powinna być pusta i oznakowana na poziomie 150 milliliters.Probówki od drugiej do dwunastej napełniono 200 mililitrów pożywki M1 99 uzupełnionej o albuminę ludzką lub roztwór płuczący i oznakowano na poziomie 230 mililitrów. Na koniec przygotowano jedną stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów, napełnioną 50 mililitrami roztworu płuczącego.Po zakończeniu tych kroków przygotowawczych można przystąpić do przygotowania i perfuzji trzustki. Aby rozpocząć przygotowanie i perfuzję trzustki, operator wyjmuje organ z opakowania. Stosując technikę sterylną, chirurg przenosi trzustkę na stół do dekontaminacji.Chirurg napełni jedną strzykawkę o pojemności 60 cc oryginalnym roztworem do konserwacji trzustki i przekaże ją operatorowi, który wykorzysta go do napełnienia przygotowanych butelek bakteriologicznych do pobierania próbek. Po oględzinach mających na celu ustalenie, czy narząd nadaje się do izolacji wysepek, chirurg poprosi operatora o przygotowanie kolagenazy. Przygotowanie jest procesem niezbędnym.Jeśli trzustka uległa uszkodzeniu podczas pobrania lub wykazuje anomalie anatomiczne, nie może być ona wykorzystana do izolacji wysepek. Należy pamiętać, że czas inkubacji w zawiesinie Resus różni się w zależności od marki i partii enzymu. Gdy chirurg będzie gotowy, należy przenieść roztwory do dekontaminacji na stół dekontaminacyjny i wlać je do odpowiednich pojemników.Chirurg odkaża trzustkę, płacząc ją przez jedną minutę. Następnie trzustkę umieszcza się w małym sterylnym słoiku z odpowiednim roztworem odkażającym, w którym zostanie ona zważona. Po wprowadzeniu wagi do protokołu serii trzustka jest przenoszona do kaniulacyjnej tacki.Przy użyciu roztworu konserwującego chirurg odsłoni i częściowo naciśnie przewód główny, a następnie wprowadzi kaniule do każdej połowy trzustki, zabezpieczając je szwami w celu perfuzji narządu. Najpierw przenieś go do urządzenia do perfuzji i wlej roztwór enzymów do zbiornika. Całkowity czas perfuzji wynosi około 10 minut, w tym pięć minut przy ciśnieniu 80 mmHg.Następnie przy ciśnieniu 180 mmHg przez pięć minut trzustka powinna stać się rozciągnięta. Po perfuzji przenieś perfundowaną trzustkę do kuwety do kaniulacji, gdzie należy ostrożnie usunąć tkankę tłuszczową z trzustki. Następnie podziel trzustkę na 10 do 12 fragmentów i przenieś ją do komory pomiarowej w celu trawienia.Aby rozpocząć etap trawienia, przenieś trzustkę do pustej komory rejestracyjnej. Dodaj jedną fiolkę 2,5 ml pulmozyme wyświetloną na ekranie, uważając, aby nie zablokować komory, zamknij ją i napełnij system. Rozpocznij pompowanie roztworu przez pięć minut.Delikatnie kołysz komorą, aby równomiernie rozprowadzić ciepły roztwór. Po pięciu minutach delikatnie wstrząśnij komorą przez całą fazę trawienia. Utrzymuj temperaturę na poziomie 37 °C.Pobierać próbkę co dwie minuty i sprawdzać pod mikroskopem, czy występują wolne oczka; informacje z oceny oczek należy wpisać do tabeli trawienia w dokumentacji partii. Kontynuować monitorowanie procentowej zawartości oczek, aż 50% z nich będzie swobodnie pływać i będzie wyizolowanych w roztworze. Gdy w próbkach stwierdzono obecność 50% wolnych oczek, należy przerwać proces trawienia poprzez dodanie schłodzonego roztworu rozcieńczającego RPMI.Tkankę z krążenia zbiera się do stożkowatych probówek o pojemności 500 ml wypełnionych uprzednio 30 ml albuminy ludzkiej. Probówki stożkowate wirujemy przy 1100 RPM przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu probówek odessać supernatant i wyprać osad. Wykorzystując zimny roztwór do przemywania, połączyć wszystkie probówki z zawiesiną trawionej tkanki trzustkowej w jednej probówce stożkowej o pojemności 500 mililitrów. Po napełnieniu probówki wypłukaną tkanką, odwirować ją i powtarzać proces płukania, aż cała tkanka zostanie przemyta kilkukrotnie.Odwiruj tę probówkę i przenieś tkankę do jednej stożkowej probówki o pojemności 250 mililitrów. Uzupełnij objętość do 250 mililitrów za pomocą roztworu piorącego M1 99 z dodatkiem ludzkiej albuminy i przygotuj do pobrania próbek. Pobierz próbkę o objętości jeden mililitr za pomocą pipety i dodaj do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, uprzednio napełnionej dziewięcioma mililitrami roztworu piorącego.Następnie zmieszano zawartość poprzez delikatne odwracanie probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Z tak przygotowanej próbki pobrano 1 ml bezpośrednio do komory licznikowej typu Grid. Policzono komórki i obliczono ich całkowitą liczbę.Stosując czynnik rozcieńczenia 2 500, zakręć probówkę stożkową o pojemności 250 mililitrów i dodaj 150 mililitrów roztworu uw. University of Wisconsin Solution. Po dodaniu UW dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą pipety, a następnie zarejestruj i przekaż informację operatorowi oczyszczania.Czas rozpoczęcia w uw. Pozostawić probówki na lodzie i sporadycznie mieszać przez obracanie. Na tym etapie można dalej oczyszczać wysepek; pobraną próbkę z nieoczyszczonej tkanki trzustki wykorzystuje się do policzenia.Po dodaniu roztworu dione do próbki, zabarwienie na czerwono ulegną jedynie wyspy trzustkowe. Następnie można ocenić ich jakość i ilość. Przedstawiliśmy procedurę izolacji wysokiej liczby wysokiej jakości ludzkich wysepek trzustkowych, co jest kluczowe dla sukcesu transplantacji wysepek.W oparciu o nasze doświadczenie, gdy tylko od 40 do 50% ludzkich wysepek trzustkowych zostanie uwolnionych z otaczającej tkanki wewnętrznej, należy jak najszybciej przerwać proces trawienia poprzez rozcieńczenie oraz schłodzenie mieszaniny trawiennej. Ważne jest również delikatne obchodzenie się z tkanką podczas pobierania, płukania i mieszania. Zalecamy zastosowanie metody oczyszczania opracowanej przez University of Chicago, która pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności odzysku wysoce czystych ludzkich wysepek trzustkowych.Metoda ta znacznie skróciła również czas izolacji, co zminimalizuje uszkodzenia związane z niedokrwieniem wysepki. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

human-pancreatic-islet-isolation-part-i-digestion-collection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja wysp trzustkowych u ludzi: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę izolacji ludzkich wysp trzustkowych poprzez trawienie tkanki z wykorzystaniem zautomatyzowanej perfuzji kolagenazą. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości wysp przeznaczonych do transplantacji.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Przeglądaj więcej filmów