Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Aby przeciąć aksony z wykorzystaniem obrazowania dwufotonowego in vivo, umieść znieczulone embriony zebrafish w kropli agarozy, podczas gdy ta twardnieje w specjalnej komorze składającej się z uszczelki teflonowej i szkiełka nakrywkowego. Na górze komory umieszcza się szkiełko, a następnie odwraca się ją do góry dnem przed wykonaniem aksonotomii. Wykonaj obraz przed zabiegiem aksonu, który chcesz przeciąć, przy powiększeniu 40x, a następnie powiększ obszar przeznaczony do aksonotomii do 70x.

Przy wyłączonym laserze zwiększ jego moc. Włącz laser na krótką chwilę. W powidoku aksonu, w przypadku pomyślnego przeprowadzenia eksocytomlii, widoczne będą rozproszone fragmenty aksonu.

Cześć, jestem Georgia O'Brien. Cześć, jestem Sandra Rigo. A ja jestem Shauna Martin.

Reprezentujemy laboratorium Alvareza TI w Katedrze Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę dwufotonowej eksocytozy oraz obrazowania konfokalnego w odstępach czasu (time-lapse) w żywych embrionach danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania degeneracji i regeneracji obwodowych aksonów somatosensorycznych.

Zacznijmy zatem. Na wstępie przygotujemy 1% roztwór agarozy niskotopliwej do zatapiania. Agarozę rozpuszczamy w wodzie podwójnie destylowanej, podgrzewając ją w mikrofalówce, a następnie rozlewamy do małych probówek i przechowujemy w bloku grzejnym w temperaturze 42 °C.

Pierwsze embriony można umieścić w 5% roztworze ringera z PTU od 22 do 24 godzin po zapłodnieniu, aby zahamować powstawanie pigmentu, który wykazuje silną autofluorescencję i przesłaniałby aksony w mikroskopie dwufotonowym. Następnie wybieramy embriony do obrazowania i usuwamy ich chorion, delikatnie rozdzielając je pęsetą. Po wybraniu embrionów zostają one znieczulone poprzez dodanie około 0,02% tricaine do roztworu ringera z PTU.

Przed przystąpieniem do pracy należy upewnić się, że zwierzęta nie reagują na dotyk. Przygotować komorę do obrazowania długoterminowego, nakładając smar próżniowy na jedną stronę pierścienia szklanego lub teflonowego i mocując go do szkiełka podstawowego. Należy uważać, aby nie przenieść zbyt dużej ilości roztworu Ringera z PTU.

Za pomocą szklanej pipety przenieś jeden embrion do roztworu agro o temperaturze 42 stopnie. Następnie przenieś embrion wraz z jedną kroplą agros na przygotowane szkiełko nakrywką. Po przeniesieniu ustaw embrion w pożądanej pozycji, podczas gdy agros twardnieje.

Należy pamiętać, że po zakończeniu prac komora obrazowania zostanie odwrócona tak, aby szkiełko miedziane stanowiło górną powierzchnię. W przypadku posiadania stolika z napędem zmotoryzowanym umożliwiającego obrazowanie wielu lokalizacji jednocześnie, należy powtórzyć te kroki dla każdego zarodka. Pozostawić agarozę do całkowitego stężenia.

Następnie wypełnij pierścień 0,02% roztworem ringer'a dla psów z dodatkiem PTU. Na koniec nanieś smar próżniowy na drugą stronę pierścieni. Następnie przykryj je szkiełkiem podstawowym.

Odwróć komory uszczelniające. Teraz jesteśmy gotowi do obrazowania dwóch czterodniowych zarodków. Aby przygotować się do obrazowania, umieść zamontowane zarodki w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem.

Skup obraz na jednym embrionie za pomocą obiektywu wodnego 40 x 0,8 z aperturą numeryczną. Następnie włącz laser. Ustaw laser na długość fali 910 nanometrów i moc 30 miliwatów.

Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Używamy oprogramowania do skanowania obrazów opracowanego dla Laboratorium Boara do badań nad koralowcami. Przy tym powiększeniu można przeszukać pole widzenia w poszukiwaniu kandydującego aksonu, który zostanie przecięty.

Po odnalezieniu wykonaj zdjęcie docelowego aksonu. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z, wykonaj obrazowanie i stwórz projekcję maksymalną stosów Z. Następnie powiększ 70-krotnie odgałęzienie aksonu, które chcesz przeanalizować.

Zwiększ moc do 180 milliwattów i ustaw liczbę przekrojów Z na jeden. Rozpocznij pojedynczy skan laserem, naciskając przycisk grab. Powinno to wystarczyć do przecięcia aksonu, jednak konieczna jest optymalizacja tej procedury pod kątem używanego mikroskopu oraz celu eksperymentalnego.

Na koniec pomniejsz obraz. Zmniejsz moc do 30 milliwatts i wykonaj zdjęcie nowo przeciętego aksonu. Jeśli w Twoim laboratorium nie ma dostępnego dwufotonowego mikroskopu zbudowanego na zamówienie, do przecinania aksonów można również użyć konfokalnego mikroskopu dwufotonowego Zes five 10.

Rozpoczynamy od umieszczenia zamontowanego zarodka na stoliku i ustawienia ostrości przy użyciu obiektywu wodnego 25 x. Następnie włączamy laser dwufotonowy oraz laser Argonne w trybie wielośladowym, aby umożliwić przełączanie się między nimi. Chociaż oba lasery są wykorzystywane do detekcji GFP, emisja dwufotonowa jest wizualizowana kolorem czerwonym, a emisja lasera Argonne kolorem zielonym.

Aby je rozróżnić, należy użyć lasera Argonne do zidentyfikowania aksonu w ustawieniach Z. Oznacz pierwszy i ostatni przekrój optyczny. Wykonaj obraz konfokalny i utwórz projekcję maksymalną Zacka.

Wyłącz laser argonowy i włącz skanowanie laserem dwufotonowym przy intensywności wynoszącej około 9% transmission. Aby upewnić się, że akson nadal znajduje się w ogniskowej, kliknij przycisk stop, aby narzędzie crop stało się dostępne. Użyj funkcji crop, aby powiększyć obszar zainteresowania.

Zazwyczaj stosujemy powiększenie około 70 x. Wybierz odcinek aksonu, który ma zostać uszkodzony, i ustaw ostrość w tym obszarze. Powiększenie można sprawdzić w karcie mode.

Następnie w karcie kanałów (channels) zmień intensywność dwufotonową z około 9%transmission na 15 do 30%transmission. Aby aktywować nowe ustawienia, kliknij przycisk fast XY, a następnie szybko kliknij stop. Aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń, w przypadku prawidłowego przebiegu procedury akson powinien być widoczny jako rozproszone szczątki.

Na koniec, aby upewnić się, że akson został rzeczywiście uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonowy 488 nm. Wykonaj kolejny obraz konfokalny i stwórz projekcję maksymalną z osi Z. Po zaprezentowaniu dwóch sposobów przecinania aksonów z wykorzystaniem dwufotonowej mikroskopii laserowej, przejdziemy do konfokalnego obrazowania TimeLapse procesu regeneracji przy użyciu Zeiss LSM 510.

Aby przygotować obrazowanie time-lapse, należy włączyć podgrzewany stolik co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem rejestracji filmu. Umieść zamocowane embriony w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem. Ustaw ostrość na jednym embrionie, korzystając z odpowiedniego obiektywu powietrznego.

Używamy obiektywu 20 x 0,5 z aperturą numeryczną, uruchamiamy oprogramowanie obrazujące Zeiss LSM five, a następnie włączamy odpowiednie lasery i ustawiamy pożądaną konfigurację. Otwieramy okna etapu skanowania oraz okna wieloczasowe (multi-time windows). W przypadku korzystania z oprogramowania multi-time, definiujemy pozycję i konfigurację pierwszego zarodka w oknie multi-time.

Aktywuj szybkie skanowanie (fast scan) w oknie skanowania, a następnie przesuń stolik do pożądanej pozycji XY. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Naciśnij stop, a następnie mid w oknie skanowania i poczekaj, aż zakończy się skanowanie środkowego przekroju Z.

Następnie naciśnij mark position w oknie stage. Jeśli obrazujesz tylko jeden embrion, kliknij zakładkę single location w oknie multi-time. Kliknij replace X, y, Z, a następnie kliknij save configuration.

Zatwierdź prośbę o nadpisanie poprzedniej konfiguracji. Teraz można ustawić parametry akwizycji obrazu w oknie wielokrotnych lokalizacji. W przypadku posiadania zmechanizowanego stolika, można zdefiniować wiele lokalizacji w celu obrazowania wielu embrionów.

W tym przypadku należy wybrać kartę wielu lokalizacji (multiple locations) przed zdefiniowaniem współrzędnych X, Y, Z oraz konfiguracji dla pierwszej lokalizacji. Należy również upewnić się, że w menu rozwijanym bezpośrednio pod kartą wielu lokalizacji wybrana jest lokalizacja pierwsza (location one), a w sekcji konfiguracji menu rozwijane wskazuje multi lo one. Przed kliknięciem przycisku zapisz konfigurację (save configuration) należy zdefiniować pozycję i konfigurację pozostałych embrionów w oknie multi-time.

Zlokalizuj następny szybki skan embrionów, następnie przesuń stolik do pożądanej pozycji XY i zaznacz pierwsze oraz ostatnie pozycje Z w oknie skanowania. Naciśnij stop. Następnie wybierz opcję mid w oknie skanowania i poczekaj na zakończenie skanu środkowego przekroju Z.

Następnie naciśnij mark position. W oknie stage kliknij replace X, Y, Z. Sprawdź, czy w menu rozwijanym bezpośrednio pod zakładką multiple locations wybrano location two oraz czy w menu rozwijanym w sekcji configuration widnieje zapis multi lobe two. Następnie kliknij save configuration. Potwierdź wybór. Gdy pojawi się prośba o nadpisanie poprzedniej konfiguracji, powtórz ten proces dla pozostałych embrionów.

Skonfiguruj parametry akwizycji obrazu w oknie multi lo. Wybierz opcję GR GL z listy sekcji bloków. Następnie wprowadź żądaną liczbę powtórzeń grup.

Jest to liczba powtórzeń, w których mikroskop konfokalny zarejestruje obraz w każdym punkcie. W sekcji parametrów należy wprowadzić pożądany odstęp czasowy. Jest to czas od rozpoczęcia jednej repetycji obrazowania do rozpoczęcia następnej.

W sekcji konfiguracji wybierz Zack XY. W dolnej sekcji wprowadź nazwę pliku bazowego. Kliknij „select image db” i wybierz swoją bazę danych.

Kliknij przycisk opcji, a następnie wybierz folder MDB do zapisywania plików tymczasowych. Zaznacz opcję zachowania otwartego obrazu końcowego. Zapisz obraz końcowy, środek Zacka i wybierz przedział wagowy.

Kliknij OK, aby zamknąć okno opcji, a następnie kliknij czas rozpoczęcia. Pozostaw okno wielu czasów otwarte przez cały czas trwania obrazowania. Teraz nadszedł czas na analizę danych.

Po zakończeniu obrazowania time-lapse oprogramowanie multi-time skompiluje wszystkie pliki tymczasowe w plik podsumowujący dla każdej lokalizacji. Jeśli chcesz zatrzymać nagranie filmu przed jego zakończeniem, upewnij się, że nacisnąłeś przycisk finish zamiast stop, aby umożliwić utworzenie pliku podsumowującego.

Pliki tymczasowe i pliki podsumowujące powinny zostać automatycznie zapisane w wyznaczonym folderze MDB. Oto reprezentatywny przykład filmu z konfokalnego obrazowania time-lapse po przeprowadzeniu eksotomii w 54. godzinie po zapłodnieniu. Pierwsza klatka przedstawia widok grzbietowy aksonu przed eksotomią, gdzie żółta strzałka wskazuje miejsce eksotomii w kolejnym punkcie czasowym.

Film z serii odstępowej rozpoczyna się w ciągu godziny po exotomii i trwa 12 godzin. Jeden stos konfokalny był pobierany co 20 minut. Ten konfokalny film z serii odstępowej został zarejestrowany przy użyciu tych samych parametrów w 78 godzinach po zapłodnieniu.

Pierwsza klatka przedstawia widok boczny aksonu przed ablacją, gdzie żółta strzałka wskazuje miejsce ablacji. Przedstawiliśmy sposób generowania precyzyjnych uszkodzeń tkanek i wizualizacji żywych embrionów zebrafish z wykorzystaniem ablacji dwufotonowej oraz konfokalnego obrazowania time-lapse. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zoptymalizowanie mocy lasera dwufotonowego używanego do ablacji, aby uniknąć spowodowania nadmiernych uszkodzeń.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.