Aksotomia dwufotonowa i poklatkowe obrazowanie konfokalne w żywych zarodkach danio pręgowanego

Aby przeciąć aksony za pomocą obrazowania in vivo, dwa fotony umieszczają znieczulone zarodki danio pręgowanego w kropli aros, gdy twardnieją w specjalistycznej komorze składającej się z prania TEFL i szkiełka nakrywkowego. Szklane światło jest umieszczane na górze komory, które jest następnie odwracane do góry nogami przed ex otomią. Zrób zdjęcie przed aksonem, który chcesz przyciąć przy 40-krotnym powiększeniu do 70-krotnym w regionie, który chcesz egzo-mize.

A gdy laser jest wyłączony, zwiększ moc lasera. Na krótko włącz laser. Na poobrazie aksonu zobaczysz rozproszone szczątki aksonów, jeśli egzotomia się powiedzie.

Cześć, nazywam się Georgia O'Brien. Cześć, nazywam się Sandra Rigo. A ja nazywam się Shauna Martin.

Pochodzimy z laboratorium Alvareza TI na Wydziale Komórek Molekularnych i Biologii Rozwoju Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę dwufotonowego ex sodomii i poklatkowego obrazowania konfokalnego w żywych zarodkach danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zwyrodnień i regeneracji obwodowych aksonów somatosensorycznych.

Więc zacznijmy. Na początek przygotujemy 1% roztwór agro o niskiej temperaturze topnienia do zatapiania. Rozpuszczamy agros w wodzie z podwójnym dystalnym dystalem, podgrzewając w kuchence mikrofalowej, a następnie podlewamy Aleca do małych rurek i przechowujemy w bloku grzewczym w temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Pierwsze zarodki można umieścić w 5% roztworze pierścienia PTU po 22 do 24 godzinach od zapłodnienia, aby zahamować tworzenie się pigmentu, który jest jasno, autofluorescencyjny i zasłania aksony na mikroskopie dwufotonowym. Następnie wybieramy zarodki do obrazowania i usuwamy ich choon, delikatnie rozsuwając je kleszczami. Po wybraniu zarodków są one znieczulane poprzez dodanie około 0,02% trica do obrączek PTU.

Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że zwierzęta nie reagują na dotyk. Przygotuj długotrwałą komorę obrazowania, nakładając smar próżniowy na jedną stronę szklanego lub teflonowego pierścienia i mocując go na szklanym szkiełku nakrywkowym. Uważaj, aby nie przenosić zbyt wielu dzwonków PTU.

Przenieś jeden zarodek do roztworu agro o temperaturze 42 stopni za pomocą szklanej pipety. Następnie przenieś zarodek z jedną kroplą agros na przygotowane szkiełko nakrywkowe. Po przeniesieniu umieść zarodek zgodnie z potrzebami, podczas gdy agros twardnieje.

Należy pamiętać, że komora obrazowania zostanie odwrócona, gdy skończysz, tak aby miedziany poślizg stanowił górną powierzchnię. Jeśli masz stadium zmotoryzowane i możesz obrazować wiele lokalizacji jednocześnie, powtórz te kroki dla każdego zarodka. Pozwól różom agro całkowicie zastygnąć.

Następnie napełnij pierścień 0,02% tri psimi dzwonkami PTU. Na koniec nałóż smar próżniowy na drugą stronę pierścieni. Następnie przykryj je szklaną lampą.

Odwróć komory uszczelniające. Teraz jesteśmy gotowi na dwa czterotonowe obrazowanie egzotomiczne. Aby przygotować się do obrazowania, umieść zamontowane zarodki na szkiełku podstawowym pod mikroskopem.

Skoncentruj się na jednym zarodku za pomocą obiektywu wodnego o aperturze numerycznej 40 x 0,8. Następnie włącz laser. Ustaw laser na długość fali 910 nanometrów i moc 30 miliwatów.

Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Korzystamy z oprogramowania do skanowania koralowców opracowanego dla Boar's Laboratory. Przy tej mocy można przeskanować pole w poszukiwaniu kandydującego aksonu, który zostanie odcięty.

Po znalezieniu zrób zdjęcie docelowego aksonu. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z, uzyskaj obraz i wykonaj maksymalną projekcję stosów Z. Następnie powiększ 70-krotnie gałąź aksonu, którą chcesz wyeksponować.

Zwiększ moc do 180 miliwatów i ustaw liczbę plasterków Z na jeden. Zainicjuj pojedyncze skanowanie za pomocą lasera, naciskając chwyć. Powinno to wystarczyć do przecięcia aksonu, jednak konieczne jest zoptymalizowanie tej procedury pod kątem mikroskopu i celu eksperymentalnego.

Na koniec pomniejsz. Zmniejsz moc do 30 miliwatów i zrób zdjęcie naszego nowo odciętego aksonu. Jeśli specjalnie zbudowany teleskop dwufotonowy nie jest dostępny w Twoim laboratorium, konfokalny mikroskop dwufotonowy Zes five 10 może być również użyty do przecinania aksonów.

Zaczynamy od umieszczenia zamontowanego zarodka na stoliku i ustawienia ostrości za pomocą obiektywu wodnego 25x. Następnie włącz dwa fotony w laserach Argonne w ustawieniu wielościeżkowym, aby możliwe było przełączanie się z jednego na drugi. Chociaż oba lasery są używane do wykrywania GFP, emisja dwóch fotonów jest wizualizowana na czerwono, a emisja lasera argonnowego na zielono.

Aby je rozróżnić, użyj lasera Argonne, aby zidentyfikować akson, który ma wytrzymać w ustawieniach Z. Zaznacz pierwszą i ostatnią sekcję optyczną. Zrób obraz konfokalny i stwórz maksymalną projekcję Zacka.

Wyłącz laser argonowy i włącz skanowanie laserem dwufotonowym z intensywnością około 9% transmisji. Aby upewnić się, że akson jest nadal ostry, kliknij przycisk zatrzymania, aby narzędzie do przycinania było dostępne. Użyj kadrowania, aby powiększyć obszar zainteresowania.

Zwykle powiększamy do około 70 x. Wybierz obszar aksonu, który ma zostać zraniony i ustaw ostrość na tym obszarze. Powiększenie można sprawdzić w zakładce trybu.

Następnie w zakładce kanały zmień intensywność dwóch fotonów z około 9% transmisji na 15 do 30% transmisji. Aby aktywować nowe ustawienia, kliknij szybki przycisk XY, a następnie szybko się zatrzymaj. Aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń, akson powinien być postrzegany jako rozrzucone szczątki, jeśli procedura zadziałała.

Na koniec, aby upewnić się, że akson rzeczywiście został uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonnowy o długości 4 88 nanometrów. Zrób kolejny obraz konfokalny i utwórz maksymalną projekcję Zacks. Teraz, gdy pokazaliśmy Ci dwa sposoby przecinania aksonów za pomocą dwufotonowej mikroskopii laserowej, przyjrzymy się konfokalnemu obrazowaniu regeneracji w trybie poklatkowym przy użyciu zes LSM five 10.

Aby przygotować film poklatkowy, należy włączyć podgrzewaną scenę co najmniej 30 minut przed skonfigurowaniem filmu poklatkowego. Umieść zamontowane zarodki na szkiełku podstawowym pod mikroskopem. Skoncentruj się na jednym zarodku z pożądanym obiektywem powietrznym.

Używamy obiektywu z aperturą numeryczną 20 x 0,5, otwieramy oprogramowanie do obrazowania Zeiss LSM five 10, a następnie włączamy odpowiednie lasery i ustawiamy żądaną konfigurację. Otwórz etap skanowania i okna wielu czasów. Jeśli masz oprogramowanie do obsługi wielu przypadków, zdefiniuj pozycję i konfigurację swojego pierwszego zarodka w oknie wielokrotnym.

Aktywuj szybkie skanowanie w oknie skanowania, a następnie przesuń stół montażowy do żądanej pozycji XY. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Naciśnij stop, a następnie w połowie również w oknie skanowania, poczekaj na zakończenie skanowania środkowego wycinka Z.

Następnie naciśnij oznacz pozycję w oknie sceny. Jeśli obrazujesz tylko jeden zarodek, kliknij zakładkę pojedynczej lokalizacji w oknie wielokrotnym. Kliknij zastąp X, y, Z. Następnie kliknij zapisz konfigurację.

Wyraź zgodę, gdy pojawi się monit o zastąpienie poprzedniej konfiguracji. Teraz możesz skonfigurować parametry akwizycji obrazu w oknie multi lo. Jeśli masz stadium zmechanizowane, możesz skonfigurować wiele lokalizacji, aby zobrazować wiele zarodków.

W takim przypadku należy wybrać zakładkę wiele lokalizacji przed zdefiniowaniem X, Y, Z i konfiguracji dla pierwszej lokalizacji. Upewnij się również, że menu rozwijane tuż pod zakładką wielu lokalizacji znajduje się w pierwszej lokalizacji, a menu rozwijane w sekcji konfiguracji mówi o wielu lo jeden. Zanim klikniesz na Zapisz konfigurację, zdefiniuj pozycję i konfigurację pozostałych zarodków w oknie wielokrotnym.

Zlokalizuj następny szybki skan wyciskania zarodków, a następnie przesuń stolik do żądanej pozycji XY i zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Naciśnij stop. Następnie w połowie również w oknie skanowania poczekaj na zakończenie skanowania środkowego wycinka Z.

Następnie naciśnij oznacz pozycję W oknie sceny kliknij zastąp X, Y, Z. Sprawdź, czy menu rozwijane tuż pod zakładką wielu lokalizacji znajduje się w lokalizacji drugiej i czy menu rozwijane w sekcji konfiguracji mówi o wielu płatkach dwa. Następnie kliknij zapisz konfigurację. Zgodzić się. Gdy zostaniesz poproszony o nadpisanie poprzedniej konfiguracji, powtórz ten proces dla pozostałych zarodków.

Skonfiguruj parametry akwizycji obrazu w oknie multi lo. Wybierz opcję GR GL z listy sekcji bloków. Następnie wprowadź żądaną liczbę powtórzeń grupowych.

Jest to liczba przypadków, w których konfokalny uzyska obraz w każdym miejscu. Wprowadź żądany przedział wagowy w sekcji parametrów. Jest to czas, jaki upływa od rozpoczęcia jednego powtórzenia obrazowania do rozpoczęcia następnego.

Wybierz Zack XY w sekcji konfiguracji. Wprowadź nazwę pliku podstawowego w dolnej sekcji. Kliknij wybierz bazę danych obrazu i wybierz swoją bazę danych.

Kliknij przycisk opcji, a następnie wybierz folder MDB, aby zapisać również pliki tymczasowe. Sprawdź, czy ostateczny obraz jest otwarty. Zapisz końcowy obraz, środek Zacka i wybierz przedział wagi.

Kliknij OK, aby zamknąć okno opcji, a następnie kliknij czas rozpoczęcia. Pozostaw otwarte okno wielokrotne na czas obrazowania. Teraz nadszedł czas na analizę danych.

Po zakończeniu obrazowania poklatkowego. Oprogramowanie do obsługi wielu czasów skompiluje wszystkie pliki tymczasowe w plik podsumowania dla każdej lokalizacji. Jeśli chcesz zatrzymać film przed jego ukończeniem, pamiętaj, aby nacisnąć przycisk Zakończ, a nie Stop, aby utworzyć plik podsumowania.

Pliki tymczasowe i pliki podsumowań powinny być automatycznie zapisywane w wyznaczonym folderze MDB. Oto reprezentatywny przykład poklatkowego filmu konfokalnego po ex otomii po 54 godzinach od zapłodnienia. Pierwsza klatka przedstawia widok grzbietowy aksonu przed ex otomią z żółtą strzałką wskazującą miejsce ex otomy następnym razem.

Film poklatkowy rozpoczyna się w ciągu godziny po ex otomii i trwa 12 godzin. Co 20 minut pobierano jeden stos konfokalny. Ten konfokalny film zaniku jest rejestrowany przy użyciu tych samych parametrów po 78 godzinach od zapłodnienia.

Pierwsza klatka przedstawia boczny widok aksonu przed ex sodomią z żółtą strzałką wskazującą miejsce ex sodomii. Właśnie pokazaliśmy, jak generować precyzyjne uszkodzenia tkanek i wizualizować żywe zarodki danio pręgowanego za pomocą sodomii dwufotonowej i poklatkowego obrazowania konfokalnego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować ilość energii zużywanej przez laser dwufotonowy ex sodomia, aby uniknąć powodowania nadmiernych uszkodzeń.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.