Name: Aksotomia dwufotonowa i poklatkowe obrazowanie konfokalne w żywych zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowej aksotomii i poklatkowego obrazowania konfokalnego w żywych zarodkach danio pręgowanego. Technika umożliwia badanie dynamiki aksonów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Markowi Terasaki za wstępne wskazówki dotyczące wykorzystania mikroskopu dwufotonowego do wywoływania lokalnych uszkodzeń tkanki, Kathy Joubin za porady w zakresie montażu preparatów do obrazowania poklatkowego oraz laboratoriom Sagasti i Portera-Cailliau za dyskusje. Pierwsze eksperymenty zostały przeprowadzone przez AS w ramach stypendium Grass Foundation Fellow w Marine Biological Labs w Woods Hole, MA. Prace w laboratorium Sagasti były wspierane przez granty z Whitehall Foundation, Klingenstein Foundation oraz nagrodę Burroughs Wellcome Fund Career Award in the Biological Sciences.

Część 1: Montowanie zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania
<ol>
<li>Przygotować 1% roztwór nisko-topiącej się agarozy do zatapiania. Rozpuścić agarozę w wodzie dejonizowanej (DI) poprzez podgrzewanie w mikrofalówce, rozdzielić na mniejsze porcje do probówek i przechowywać w bloku grzejnym w temperaturze 42 °C.</li>
<li>Wybrać embriony do obrazowania i usunąć ich choriony, ostrożnie rozdzielając chorion pęsetą. Embriony można umieścić w 5% roztworze Ringera z PTU w 22-24 godzinach po zapłodnieniu (hpf), aby zahamować powstawanie pigmentu. Poprawia to klarowność obrazowania i jest niezbędne do przeprowadzania aksotomii aksonów sensorycznych metodą dwufotonową. Jeśli dopuści się do powstania naturalnego pigmentu, autofluorescencja przesłoni aksony w mikroskopie dwufotonowym. Roztwór Ringera dla danio pręgowanego zawiera 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2 oraz 5mM HEPES, pH 7.2.</li>
<li>Zanestetyzować embriony, dodając ~0.02% trikainy do roztworu Ringera z PTU. Przed kontynuacją upewnić się, że zwierzęta nie reagują na dotyk.</li>
<li>Przygotować komorę do długoterminowego obrazowania, nakładając smar próżniowy na jedną stronę szklanego lub teflonowego pierścienia i mocując go do szklanego szkiełka nakrywki.</li>
<li>Przenieść jeden embrion do 42-stopniowego roztworu agarozy za pomocą szklanej pipety, dbając o to, aby nie przenieść zbyt wiele roztworu Ringera z PTU, a następnie przenieść embrion wraz z jedną kroplą agarozy na przygotowaną nakrywkę.</li>
<li>Ustawić embrion w pożądanej pozycji w czasie twardnienia agarozy. Należy pamiętać, że po zakończeniu prac komora obrazowania zostanie odwrócona, tak aby szkiełko nakrywki stało się powierzchnią górną.</li>
<li>W przypadku posiadania stolika zmotoryzowanego i możliwości obrazowania wielu lokalizacji jednocześnie, powtórzyć kroki 1.4-1.6 dla każdego embrionu.</li>
<li>Odczekać do całkowitego stężenia agarozy, a następnie wypełnić pierścień 0.02% roztworem Ringera z PTU i trikainą.</li>
<li>Nałożyć smar próżniowy na drugą stronę pierścienia (pierścieni), a następnie przykryć pierścień (pierścienie) szkiełkiem przedmiotowym. Odwrócić uszczelnioną komorę (komory). Komory te mogą być używane do obrazowania w mikroskopach prostych lub odwróconych.</li>
</ol>
Część 2: Aksotomia dwufotonowa z użyciem zbudowanego na zamówienie mikroskopu dwufotonowego z laserem tytano-szafirowym Chameleon
<ol>
<li>Przygotowanie do obrazowania. Umieść zamontowany embrion (lub embriony) w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem. Ustaw ostrość na jednym embrionie, korzystając z obiektywu wodnego 40X (0.8 NA). Włącz laser. Wykorzystując poniższe parametry, udało nam się powtarzalnie wizualizować i uszkadzać neurony wykazujące ekspresję GFP. Aby wizualizować aksony przy mocy niepowodującej uszkodzeń, ustaw długość fali lasera na 910 nanometrów (nm) i moc na 30 miliwatów (mW – podana wartość to moc w miejscu próbki). Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Używamy oprogramowania ScanImage opracowanego w laboratorium Karela Svobody 2, 3.</li>
<li>Naciśnij przycisk focus, aby zeskanować embrion laserem dwufotonowym, zlokalizuj akson, który chcesz poddać aksotomii, i wykonaj zdjęcie tego aksonu. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z, wykonaj obrazowanie i utwórz projekcję maksymalną (maximum projection) ze stosów Z.</li>
<li>Zastosuj powiększenie 70X na odgałęzieniu aksonu, który chcesz poddać aksotomii, i zatrzymaj skanowanie. Zwiększ moc w miejscu próbki do wartości powodującej uszkodzenie, tj. 180 mW, i wykonaj pojedyncze skanowanie laserem. Robimy to, ustawiając liczbę warstw Z na 1 i naciskając „Grab”. Powinno to być wystarczające do przerwania aksonu. Metody optymalizacji tej procedury dla Twojego mikroskopu i celu eksperymentalnego opisano w dyskusji.</li>
<li>Zmniejsz powiększenie, zredukuj moc do 30 mW i wykonaj zdjęcie.</li>
</ol>
Część 3: Aksotomia dwufotonowa przy użyciu mikroskopu konfokalnego/dwufotonowego Zeiss 510
<ol>
<li>Umieść zamontowany embrion na stoliku i ustaw ostrość, używając obiektywu wodnego 25X lub innego odpowiedniego obiektywu.</li>
<li>Włącz lasery dwufotonowy (910 nm) oraz argonowy (488 nm) w ustawieniu wielościeżkowym, aby umożliwić przełączanie się między nimi. Chociaż oba lasery służą do detekcji GFP, emisję dwufotonową wizualizuje się kolorem czerwonym, a emisję lasera argonowego kolorem zielonym, aby rozróżnić oba sygnały.</li>
<li>Użyj lasera argonowego, aby zidentyfikować akson przeznaczony do uszkodzenia. W ustawieniach Z zaznacz pierwszy i ostatni przekrój optyczny. Wykonaj obraz konfokalny i utwórz projekcję maksymalną stosu Z.</li>
<li>Wybierz odcinek aksonu do uszkodzenia i ustaw ostrość na tym obszarze. Wyłącz laser argonowy i włącz laser dwufotonowy. Zeskanuj preparat laserem dwufotonowym przy intensywności lasera wynoszącej ok. 9% transmisji, aby upewnić się, że akson nadal znajduje się w ostrości.</li>
<li>Kliknij przycisk „stop”, aby aktywować narzędzie przycinania (crop). Użyj funkcji przycinania, aby powiększyć obszar zainteresowania. Zazwyczaj powiększenie ustawia się na ok. 70X (powiększenie można sprawdzić w zakładce „mode”). W zakładce „channels” zmień intensywność lasera dwufotonowego z ok. 9% transmisji na 15-20% transmisji.</li>
<li>Aby przeciąć akson, aktywuj przycisk „fast XY” na około 1 sekundę, a następnie naciśnij przycisk stop, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń. Jeśli procedura przebiegła pomyślnie, akson powinien być widoczny jako rozproszone szczątki.</li>
<li>Aby upewnić się, że akson został uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonowy 488 nm, wykonaj kolejny obraz konfokalny i utwórz projekcję maksymalną.</li>
</ol>
Część 4: Konfokalne obrazowanie time-lapse na mikroskopie Zeiss LSM 510
<ol>
<li>Przygotowanie do obrazowania. W przypadku korzystania z podgrzewanego stolika należy go włączyć co najmniej 30 minut przed ustawieniem filmu time-lapse. Umieścić zamontowany embrion (lub embriony) w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem. Ustawić ostrość na jednym embrionie przy użyciu wybranego obiektywu powietrznego. W tym przypadku stosujemy obiektyw 20X, 0.5 NA. Uruchomić oprogramowanie do obrazowania Zeiss LSM 510. Włączyć odpowiednie lasery i ustawić pożądaną konfigurację. Poniżej opisano szczegółowy protokół długoterminowego obrazowania z wykorzystaniem oprogramowania Zeiss LSM Multi Time. Metody te można dostosować do pracy na własnym mikroskopie z posiadanym oprogramowaniem do obrazowania.</li>
<li>Zdefiniowanie pozycji i konfiguracji pierwszego embrionu w oknie Multi Time. Otworzyć okna skanowania (scan), stolika (stage) oraz Multi Time. Aktywować funkcję fast scan w oknie skanowania. Przesunąć stolik do pożądanej pozycji XY. Zaznaczyć pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Nacisnąć stop, a następnie Mid, również w oknie skanowania. Odczekać do zakończenia skanowania środkowego przekroju Z, a następnie nacisnąć mark position w oknie stolika. Jeśli obrazowany jest tylko jeden embrion, należy kliknąć kartę „Single Location” w oknie Multi Time. Kliknąć „Replace XYZ”, a następnie „Save Configuration”. Potwierdzić nadpisanie poprzedniej konfiguracji. Przejść do kroku 4.4. W przypadku posiadania stolika zmechanizowanego można ustawić wiele lokalizacji w celu obrazowania wielu embrionów. W takim przypadku należy wybrać kartę „Multiple Locations” przed zdefiniowaniem współrzędnych XYZ i konfiguracji dla pierwszej lokalizacji. Należy również upewnić się, że w menu rozwijanym bezpośrednio pod kartą „Multiple Locations” wybrano location 1, a w sekcji konfiguracji menu rozwijane wskazuje multi loc 1, przed kliknięciem save configuration.</li>
<li>Zdefiniowanie pozycji i konfiguracji pozostałych embrionów w oknie Multi Time. Zlokalizować kolejny embrion, nacisnąć fast scan, przesunąć stolik do pożądanej pozycji XY i zaznaczyć pierwszą oraz ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Nacisnąć stop, a następnie Mid, również w oknie skanowania. Odczekać do zakończenia skanowania środkowego przekroju Z, a następnie nacisnąć mark position w oknie stolika. Kliknąć „Replace XYZ”. Sprawdzić, czy w menu rozwijanym pod kartą „Multiple Locations” wybrana jest lokalizacja 2 (location 2), a w sekcji konfiguracji menu rozwijane wskazuje multi loc 2, a następnie kliknąć „Save Configuration”. Potwierdzić nadpisanie poprzedniej konfiguracji. Powtórzyć ten proces dla pozostałych embrionów.</li>
<li>Ustawienie parametrów akwizycji obrazu w oknie Multi Loc. W sekcji „List of Blocks” wybrać opcję GR-G-L, a następnie wprowadzić pożądaną liczbę powtórzeń grupy. Jest to liczba razy, w których mikroskop konfokalny wykona obraz w każdej lokalizacji. W sekcji Parameters wprowadzić pożądany odstęp czasu (wait interval). Jest to czas od rozpoczęcia jednego powtórzenia obrazowania do rozpoczęcia następnego. W sekcji konfiguracji wybrać „ZStackXY”. W dolnej sekcji wprowadzić podstawową nazwę pliku. Kliknąć „Select Image DB” i wybrać plik mdb. Kliknąć przycisk „Options”. Wybrać folder mdb do zapisywania plików tymczasowych. Zaznaczyć opcje „keep final image open”, „save final image” oraz „middle of the z stack”. Wybrać wait interval. Kliknąć ok, aby zamknąć okno opcji. Kliknąć „start time”. Pozostawić okno Multi Time otwarte przez cały czas trwania obrazowania.</li>
<li>Analiza danych. Po zakończeniu obrazowania time-lapse oprogramowanie Multi Time skompiluje wszystkie pliki tymczasowe w plik podsumowujący dla każdej lokalizacji. Jeśli obrazowanie ma zostać przerwane przed zakończeniem, należy nacisnąć „Finish” zamiast „Stop”, aby utworzono plik podsumowujący. Pliki tymczasowe i podsumowujące powinny zostać automatycznie zapisane w wyznaczonym folderze mdb. Z menu oprogramowania LSM wybrać „3D View”, a następnie „Projection”. Po wybraniu pliku podsumowującego z menu rozwijanego kliknąć „Apply”. Wygeneruje to projekcje maksymalne stosu Z dla każdego obrazu konfokalnego. W menu oprogramowania LSM wybrać „File”, a następnie „Export”. Zapisać projekcje maksymalne jako serię plików tif. Z serii plików tif można następnie stworzyć film przy użyciu programu ImageJ lub QuickTime Pro. Aksony na obrazach LSM mogą być śledzone w trzech wymiarach za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. NeuroLucida firmy MicroBrightfield) w celu uzyskania szczegółowych informacji ilościowych na temat morfologii aksonów.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Pomyślnie przeprowadzony eksperyment pozwoli na dokładne przedstawienie dynamiki komórkowej regeneracji aksonu po urazie. Embriony po obrazowaniu powinny pozostać zdrowe, bez widocznych oznak degeneracji i z silnym biciem serca. Aksotomia powinna spowodować precyzyjne uszkodzenie, przecinając wyłącznie określoną gałąź aksonu. Nie powinno dojść do uszkodzenia sąsiednich aksonów, a śmierć komórek powinna być minimalna. W około 50% eksperymentów obserwujemy śmierć pojedynczej komórki naskórka bezpośrednio nad miejscem aksotomii. W przypadku zaobserwowania większych uszkodzeń należy zoptymalizować protokół dwufotonowy zgodnie z opisem w sekcji dyskusji.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

Opisane metody wykorzystaliśmy do precyzyjnej aksotomii obwodowych aksonów sensorycznych oraz do bezpośredniej obserwacji regeneracji w żywym embrionie danio pręgowanego. Długoterminowe obrazowanie konfokalne typu time-lapse u danio pręgowanego może być stosowane do obserwacji wielu procesów rozwojowych in vivo. Opisana procedura aksotomii dwufotonowej może zostać zmodyfikowana w zależności od wielu różnych celów eksperymentalnych. Tę samą ogólną procedurę zastosowaliśmy do ablacji całych ciał komórek neuronów s...

dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebry danina od dawna są wykorzystywane do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów rozwoju za pomocą obrazowania time-lapse żywych, przezroczystych embrionów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę montowania embrionów zebry daniny do długotrwałego obrazowania oraz demonstrujemy, jak zautomatyzować rejestrację obrazów time-lapse przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Opisujemy również metodę tworzenia kontrolowanych, precyzyjnych uszkodzeń poszczególnych odgałęzień obwodowych aksonów sensorycznych u zebry daniny, wykorzystując skupioną moc lasera femtosekundowego zamontowanego na mikroskopie dwufotonowym. Parametry skutecznej aksonotomii dwufotonowej muszą zostać zoptymalizowane dla każdego mikroskopu. W celu przedstawienia dwóch przykładów zademonstrujemy aksonotomię dwufotonową zarówno na mikroskopie dwufotonowym zbudowanym na specjalne zamówienie, jak i na mikroskopie konfokalnym/dwufotonowym Zeiss 510.

Neurony sensoryczne nerwu trójdzielnego u danio pręgowanego można wizualizować w linii transgenicznej wykazującej ekspresję GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla neuronów sensorycznych 1. Dostosowaliśmy ten model nerwu trójdzielnego u danio pręgowanego, aby bezpośrednio obserwować regenerację aksonów sensorycznych w żywych embrionach tych ryb. Embriony są znieczulane trikainą i umieszczane w kropli agarozy, która następnie zastyga. Unieruchomione embriony są zamykane w komorze obrazowania wypełnionej roztworem Ringera z fenylotiomocznikiem (PTU). Ustaliliśmy, że embriony w tych komorach mogą być obrazowane w sposób ciągły przez 12-48 godzin. Następnie wykonuje się pojedynczy obraz konfokalny, aby wyznaczyć pożądane miejsce aksonotomii. Obszar zainteresowania jest lokalizowany w mikroskopie dwufotonowym poprzez obrazowanie aksonów sensorycznych przy niskiej, nieuszkadzającej mocy. Po powiększeniu pożądanego miejsca aksonotomii zwiększa się moc, a pojedyncze skanowanie tego zdefiniowanego obszaru jest wystarczające do przerwania aksonu. Następnie w mikroskopie konfokalnym konfiguruje się obrazowanie time-lapse w wielu lokalizacjach, aby bezpośrednio obserwować regenerację aksonów po urazie.

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Rybki danio od dawna są wykorzystywane do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów rozwoju za pomocą obrazowania time-lapse żywych, przezroczystych embrionów.

Aby przeciąć aksony z wykorzystaniem obrazowania dwufotonowego in vivo, umieść znieczulone embriony zebrafish w kropli agarozy, podczas gdy ta twardnieje w specjalnej komorze składającej się z uszczelki teflonowej i szkiełka nakrywkowego. Na górze komory umieszcza się szkiełko, a następnie odwraca się ją do góry dnem przed wykonaniem aksonotomii. Wykonaj obraz przed zabiegiem aksonu, który chcesz przeciąć, przy powiększeniu 40x, a następnie powiększ obszar przeznaczony do aksonotomii do 70x.Przy wyłączonym laserze zwiększ jego moc. Włącz laser na krótką chwilę. W powidoku aksonu, w przypadku pomyślnego przeprowadzenia eksocytomlii, widoczne będą rozproszone fragmenty aksonu.Cześć, jestem Georgia O'Brien. Cześć, jestem Sandra Rigo. A ja jestem Shauna Martin.Reprezentujemy laboratorium Alvareza TI w Katedrze Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę dwufotonowej eksocytozy oraz obrazowania konfokalnego w odstępach czasu (time-lapse) w żywych embrionach danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania degeneracji i regeneracji obwodowych aksonów somatosensorycznych.Zacznijmy zatem. Na wstępie przygotujemy 1% roztwór agarozy niskotopliwej do zatapiania. Agarozę rozpuszczamy w wodzie podwójnie destylowanej, podgrzewając ją w mikrofalówce, a następnie rozlewamy do małych probówek i przechowujemy w bloku grzejnym w temperaturze 42 °C.Pierwsze embriony można umieścić w 5% roztworze ringera z PTU od 22 do 24 godzin po zapłodnieniu, aby zahamować powstawanie pigmentu, który wykazuje silną autofluorescencję i przesłaniałby aksony w mikroskopie dwufotonowym. Następnie wybieramy embriony do obrazowania i usuwamy ich chorion, delikatnie rozdzielając je pęsetą. Po wybraniu embrionów zostają one znieczulone poprzez dodanie około 0,02% tricaine do roztworu ringera z PTU.Przed przystąpieniem do pracy należy upewnić się, że zwierzęta nie reagują na dotyk. Przygotować komorę do obrazowania długoterminowego, nakładając smar próżniowy na jedną stronę pierścienia szklanego lub teflonowego i mocując go do szkiełka podstawowego. Należy uważać, aby nie przenieść zbyt dużej ilości roztworu Ringera z PTU.Za pomocą szklanej pipety przenieś jeden embrion do roztworu agro o temperaturze 42 stopnie. Następnie przenieś embrion wraz z jedną kroplą agros na przygotowane szkiełko nakrywką. Po przeniesieniu ustaw embrion w pożądanej pozycji, podczas gdy agros twardnieje.Należy pamiętać, że po zakończeniu prac komora obrazowania zostanie odwrócona tak, aby szkiełko miedziane stanowiło górną powierzchnię. W przypadku posiadania stolika z napędem zmotoryzowanym umożliwiającego obrazowanie wielu lokalizacji jednocześnie, należy powtórzyć te kroki dla każdego zarodka. Pozostawić agarozę do całkowitego stężenia.Następnie wypełnij pierścień 0,02% roztworem ringer'a dla psów z dodatkiem PTU. Na koniec nanieś smar próżniowy na drugą stronę pierścieni. Następnie przykryj je szkiełkiem podstawowym.Odwróć komory uszczelniające. Teraz jesteśmy gotowi do obrazowania dwóch czterodniowych zarodków. Aby przygotować się do obrazowania, umieść zamontowane zarodki w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem.Skup obraz na jednym embrionie za pomocą obiektywu wodnego 40 x 0,8 z aperturą numeryczną. Następnie włącz laser. Ustaw laser na długość fali 910 nanometrów i moc 30 miliwatów.Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Używamy oprogramowania do skanowania obrazów opracowanego dla Laboratorium Boara do badań nad koralowcami. Przy tym powiększeniu można przeszukać pole widzenia w poszukiwaniu kandydującego aksonu, który zostanie przecięty.Po odnalezieniu wykonaj zdjęcie docelowego aksonu. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z, wykonaj obrazowanie i stwórz projekcję maksymalną stosów Z. Następnie powiększ 70-krotnie odgałęzienie aksonu, które chcesz przeanalizować.Zwiększ moc do 180 milliwattów i ustaw liczbę przekrojów Z na jeden. Rozpocznij pojedynczy skan laserem, naciskając przycisk grab. Powinno to wystarczyć do przecięcia aksonu, jednak konieczna jest optymalizacja tej procedury pod kątem używanego mikroskopu oraz celu eksperymentalnego.Na koniec pomniejsz obraz. Zmniejsz moc do 30 milliwatts i wykonaj zdjęcie nowo przeciętego aksonu. Jeśli w Twoim laboratorium nie ma dostępnego dwufotonowego mikroskopu zbudowanego na zamówienie, do przecinania aksonów można również użyć konfokalnego mikroskopu dwufotonowego Zes five 10.Rozpoczynamy od umieszczenia zamontowanego zarodka na stoliku i ustawienia ostrości przy użyciu obiektywu wodnego 25 x. Następnie włączamy laser dwufotonowy oraz laser Argonne w trybie wielośladowym, aby umożliwić przełączanie się między nimi. Chociaż oba lasery są wykorzystywane do detekcji GFP, emisja dwufotonowa jest wizualizowana kolorem czerwonym, a emisja lasera Argonne kolorem zielonym.Aby je rozróżnić, należy użyć lasera Argonne do zidentyfikowania aksonu w ustawieniach Z. Oznacz pierwszy i ostatni przekrój optyczny. Wykonaj obraz konfokalny i utwórz projekcję maksymalną Zacka.Wyłącz laser argonowy i włącz skanowanie laserem dwufotonowym przy intensywności wynoszącej około 9% transmission. Aby upewnić się, że akson nadal znajduje się w ogniskowej, kliknij przycisk stop, aby narzędzie crop stało się dostępne. Użyj funkcji crop, aby powiększyć obszar zainteresowania.Zazwyczaj stosujemy powiększenie około 70 x. Wybierz odcinek aksonu, który ma zostać uszkodzony, i ustaw ostrość w tym obszarze. Powiększenie można sprawdzić w karcie mode.Następnie w karcie kanałów (channels) zmień intensywność dwufotonową z około 9%transmission na 15 do 30%transmission. Aby aktywować nowe ustawienia, kliknij przycisk fast XY, a następnie szybko kliknij stop. Aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń, w przypadku prawidłowego przebiegu procedury akson powinien być widoczny jako rozproszone szczątki.Na koniec, aby upewnić się, że akson został rzeczywiście uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonowy 488 nm. Wykonaj kolejny obraz konfokalny i stwórz projekcję maksymalną z osi Z. Po zaprezentowaniu dwóch sposobów przecinania aksonów z wykorzystaniem dwufotonowej mikroskopii laserowej, przejdziemy do konfokalnego obrazowania TimeLapse procesu regeneracji przy użyciu Zeiss LSM 510.Aby przygotować obrazowanie time-lapse, należy włączyć podgrzewany stolik co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem rejestracji filmu. Umieść zamocowane embriony w uchwycie do szkiełek pod mikroskopem. Ustaw ostrość na jednym embrionie, korzystając z odpowiedniego obiektywu powietrznego.Używamy obiektywu 20 x 0,5 z aperturą numeryczną, uruchamiamy oprogramowanie obrazujące Zeiss LSM five, a następnie włączamy odpowiednie lasery i ustawiamy pożądaną konfigurację. Otwieramy okna etapu skanowania oraz okna wieloczasowe (multi-time windows). W przypadku korzystania z oprogramowania multi-time, definiujemy pozycję i konfigurację pierwszego zarodka w oknie multi-time.Aktywuj szybkie skanowanie (fast scan) w oknie skanowania, a następnie przesuń stolik do pożądanej pozycji XY. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania. Naciśnij stop, a następnie mid w oknie skanowania i poczekaj, aż zakończy się skanowanie środkowego przekroju Z.Następnie naciśnij mark position w oknie stage. Jeśli obrazujesz tylko jeden embrion, kliknij zakładkę single location w oknie multi-time. Kliknij replace X, y, Z, a następnie kliknij save configuration.Zatwierdź prośbę o nadpisanie poprzedniej konfiguracji. Teraz można ustawić parametry akwizycji obrazu w oknie wielokrotnych lokalizacji. W przypadku posiadania zmechanizowanego stolika, można zdefiniować wiele lokalizacji w celu obrazowania wielu embrionów.W tym przypadku należy wybrać kartę wielu lokalizacji (multiple locations) przed zdefiniowaniem współrzędnych X, Y, Z oraz konfiguracji dla pierwszej lokalizacji. Należy również upewnić się, że w menu rozwijanym bezpośrednio pod kartą wielu lokalizacji wybrana jest lokalizacja pierwsza (location one), a w sekcji konfiguracji menu rozwijane wskazuje multi lo one. Przed kliknięciem przycisku zapisz konfigurację (save configuration) należy zdefiniować pozycję i konfigurację pozostałych embrionów w oknie multi-time.Zlokalizuj następny szybki skan embrionów, następnie przesuń stolik do pożądanej pozycji XY i zaznacz pierwsze oraz ostatnie pozycje Z w oknie skanowania. Naciśnij stop. Następnie wybierz opcję mid w oknie skanowania i poczekaj na zakończenie skanu środkowego przekroju Z.Następnie naciśnij mark position. W oknie stage kliknij replace X, Y, Z. Sprawdź, czy w menu rozwijanym bezpośrednio pod zakładką multiple locations wybrano location two oraz czy w menu rozwijanym w sekcji configuration widnieje zapis multi lobe two. Następnie kliknij save configuration. Potwierdź wybór. Gdy pojawi się prośba o nadpisanie poprzedniej konfiguracji, powtórz ten proces dla pozostałych embrionów.Skonfiguruj parametry akwizycji obrazu w oknie multi lo. Wybierz opcję GR GL z listy sekcji bloków. Następnie wprowadź żądaną liczbę powtórzeń grup.Jest to liczba powtórzeń, w których mikroskop konfokalny zarejestruje obraz w każdym punkcie. W sekcji parametrów należy wprowadzić pożądany odstęp czasowy. Jest to czas od rozpoczęcia jednej repetycji obrazowania do rozpoczęcia następnej.W sekcji konfiguracji wybierz Zack XY. W dolnej sekcji wprowadź nazwę pliku bazowego. Kliknij „select image db” i wybierz swoją bazę danych.Kliknij przycisk opcji, a następnie wybierz folder MDB do zapisywania plików tymczasowych. Zaznacz opcję zachowania otwartego obrazu końcowego. Zapisz obraz końcowy, środek Zacka i wybierz przedział wagowy.Kliknij OK, aby zamknąć okno opcji, a następnie kliknij czas rozpoczęcia. Pozostaw okno wielu czasów otwarte przez cały czas trwania obrazowania. Teraz nadszedł czas na analizę danych.Po zakończeniu obrazowania time-lapse oprogramowanie multi-time skompiluje wszystkie pliki tymczasowe w plik podsumowujący dla każdej lokalizacji. Jeśli chcesz zatrzymać nagranie filmu przed jego zakończeniem, upewnij się, że nacisnąłeś przycisk finish zamiast stop, aby umożliwić utworzenie pliku podsumowującego.Pliki tymczasowe i pliki podsumowujące powinny zostać automatycznie zapisane w wyznaczonym folderze MDB. Oto reprezentatywny przykład filmu z konfokalnego obrazowania time-lapse po przeprowadzeniu eksotomii w 54. godzinie po zapłodnieniu. Pierwsza klatka przedstawia widok grzbietowy aksonu przed eksotomią, gdzie żółta strzałka wskazuje miejsce eksotomii w kolejnym punkcie czasowym.Film z serii odstępowej rozpoczyna się w ciągu godziny po exotomii i trwa 12 godzin. Jeden stos konfokalny był pobierany co 20 minut. Ten konfokalny film z serii odstępowej został zarejestrowany przy użyciu tych samych parametrów w 78 godzinach po zapłodnieniu.Pierwsza klatka przedstawia widok boczny aksonu przed ablacją, gdzie żółta strzałka wskazuje miejsce ablacji. Przedstawiliśmy sposób generowania precyzyjnych uszkodzeń tkanek i wizualizacji żywych embrionów zebrafish z wykorzystaniem ablacji dwufotonowej oraz konfokalnego obrazowania time-lapse. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zoptymalizowanie mocy lasera dwufotonowego używanego do ablacji, aby uniknąć spowodowania nadmiernych uszkodzeń.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dwufotonowa aksektomia i czasoprzestrzenna mikroskopia konfokalna u żywych zarodków danio pręgowanego

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Ten film opisuje metodę uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą aksotomii lasera dwufotonowego i obserwacji regeneracji aksonów po urazie.

Aksotomia lasera dwufotonowego: metoda uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego i obserwowania regeneracji aksonów

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj metodę dwufotonowej aksotomii i poklatkowego obrazowania konfokalnego w żywych zarodkach danio pręgowanego. Technika umożliwia badanie dynamiki aksonów w czasie rzeczywistym.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów