Name: Mapowanie optyczne serc szczurów perfundowanych metodą Langendorffa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj technikę mapowania optycznego potencjałów czynnościowych na powierzchni serc szczurów perfundowanych metodą Langendorffa z użyciem barwnika di-8-ANEPPS. Ta metoda umożliwia badanie aktywności elektrycznej mięśnia sercowego z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana z grantów badawczych Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health, HL068915; HL088206) oraz z wpłat na fundusz Cardiac Conduction Fund w Children's Hospital Boston.

Część 1: Przygotowanie roztworów i układu izolowanego perfuzyjnego serca
<ol>
<li>W poranek w dniu eksperymentu przygotowuje się 4,0 L roztworu Krebsa-Henseleita zgodnie z wcześniejszym opisem[5, 6].</li>
<li>11 mMol/L 2,3-butanodionomonoksymu (BDM) rozpuszcza się w 1,0 L roztworu Krebsa-Henseleita odlanego z perfuzatu przygotowanego w kroku 1.1.</li>
<li>Dodatkowe 150 mL roztworu Krebsa-Henseleita pobiera się z perfuzatu przygotowanego w kroku 1.1 i miesza z 5 Mol/L di-8-ANEPPS (rozcieńczonym z roztworu zapasowego 10 mMol/L rozpuszczonego w dimetylosulfoksydzie (DMSO)).</li>
<li>Te 3 roztwory przenosi się do szklanych zbiorników z płaszczem wodnym (Radnoti), gdzie są wstępnie ogrzewane do 41,0° C i napowietrzane za pomocą zanurzonego napowietrzacza (Radnoti) przy użyciu gazu 95% O2; 5% CO2 przefiltrowanego przez membranę 0,2 μm. Roztwory z 3 zbiorników zapasowych są pompowane do ściennego systemu Langendorffa za pomocą pomp perystaltycznych MasterFlex™ L/S i silikonowych przewodów o niskiej absorpcji (Cole-Parmer).</li>
<li>Przed montażem szklane elementy systemu Langendorffa (Radnoti) są starannie myte odczynnikiem E-TOXA-CLEAN (Sigma-Aldrich) i dokładnie płukane 0,1 M/L HCl, 100% etanolem oraz wodą destylowaną.</li>
<li>Aparat Langendorffa bez recyrkulacji został skonstruowany tak, aby dostarczać stałe ciśnienie 70 mm Hg z 3 oddzielnych napowietrzonych zbiorników, które są oddzielone od serca grzejnymi cewkami z płaszczem wodnym i pułapkami pęcherzyków powietrza (Radnoti)[7]. 3 niezależne linie perfuzyjne zbiegają się nad sercem w dwóch trójdrożnych kranikach, co pozwala na precyzyjną kontrolę podawania roztworów przygotowanych w krokach od 1.1 do 1.3. Szklane elementy z płaszczem wodnym są połączone szeregowo przewodami MasterFlex PharMed BPT (Cole-Parmer) i ogrzewane do 39° C wodą destylowaną za pomocą dwóch cyrkulatorów E100 (Lauda). Strata ciepła przez silikonowe przewody utwardzane platynowo (Cole-Parmer), które łączą zbiorniki ciśnieniowe z cewkami grzejnymi i pułapkami pęcherzyków, skutkuje dotarciem perfuzatu o temperaturze 37° C do serca.</li>
</ol>
Część 2: Pobranie serca szczura i przygotowanie perfuzji w układzie Langendorffa
<ol>
<li>Aby wywołać głęboką narkozę ogólną u szczurów linii Lewis o masie 200-250 g, do jamy otrzewnowej wstrzykuje się 100 mg/kg Ketaminy i 10 mg/kg Ksylazyny. Do tej mieszaniny dodajemy 500 U/kg Heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi i niedokrwieniu mięśnia sercowego podczas procedury eksplantacji.</li>
<li>W celu uzyskania łatwego dostępu do serca i głównych naczyń krwionośnych usuwa się przednią ścianę klatki piersiowej. Następnie ostrożnie rozcina się tkanki otaczające i otwiera worek osierdziowy.</li>
<li>Po zidentyfikowaniu żyły głównej dolnej naczynie to zostaje podwiązane nicią jedwabną 5-0 (Ethicon), a cały blok serce-płuca zostaje wyjęty. Tkankę bezzwłocznie umieszcza się w lodowatym roztworze Krebsa-Henseleita w zlewce 50 mL ustawionej na lodzie.</li>
<li>Szybko identyfikuje się aortę wstępującą i oddziela ją od tkanek otaczających. Do aorty wprowadza się kanulę (Harvard Apparatus) o odpowiedniej średnicy, dbając o to, by nie przerwać niezbędnej perfuzji tętnic wieńcowych poprzez zbyt głębokie wprowadzenie kanuli do zastawki aorty. Kanulę mocuje się do aorty wstępującej nicią jedwabną 5-0 (Ethicon).</li>
<li>Następnie serce szczura umieszcza się w aparacie Langendorffa, uważając, aby do kanuli nie dostały się pęcherzyki powietrza. Uruchamia się wsteczną perfuzję naczyń wieńcowych za pomocą ciepłego, natlenionego roztworu Krebsa-Henseleita z zasobnika ciśnieniowego opisanego w kroku 1.6.</li>
<li>Usuwa się nadmiar tkanek, w tym płuca, a serce poddaje się perfuzji przez 20 minut, aby umożliwić odzyskanie funkcji i stabilizację rytmu. W tym czasie do jamy lewej komory wprowadza się bardzo cienką sondę termoparową (Cole-Parmer) i mocuje ją szwem Prolene 5-0 (Ethicon). Sondę podłącza się do termokontrolera (Digi-Sense), aby zapewnić utrzymanie temperatury serca na poziomie 37° C poprzez regulację ustawień pomp cyrkulacyjnych wody. Minimalizuje się ruch wywołany skapywaniem perfuzatu z wierzchołka serca, umieszczając kawałek gazy w naczyniu na odpływ.</li>
</ol>
Część 3: Obciążenie serca barwnikiem potencjometrycznym oraz rejestracja sygnałów elektrograficznych i optycznych
<ol>
<li>Di-8-ANEPPS (Invitrogen) wprowadza się do serca, przełączając za pomocą kurka na linię perfuzyjną zawierającą roztwór Krebsa-Henseleita z dodatkiem barwnika fluorescencyjnego. Dodatkowo do lewego i/lub prawego przedsionka wprowadza się kaniulę 18G, przez którą powoli podaje się kolejne 50 ml roztworu barwnika do każdej z tych jam, ponieważ nie są one wystarczająco perfundowane barwnikiem wprowadzonym przez tętnice wieńcowe.</li>
<li>Podczas procedury ładowania 3 odprowadzenia EKG (Harvard Apparatus) są delikatnie umieszczane na powierzchni serca, która nie jest skierowana w stronę optyki używanej do mapowania. Elektroda No 1 jest umiejscowiony na tylnej części wierzchołkowej lewej komory, No 2 na lewym przedsionku, a No 3 jako elektrodę referencyjną w obrębie pierścienia aorty (Rysunek 1). Sygnały elektrograficzne z przedsionków i komór są następnie wzmacniane, digitalizowane i wyświetlane wraz z sygnałami optycznymi przy użyciu oprogramowania (RedShirt Imaging) (Rysunek 2). Do wizualizacji powierzchniowego EKG w czasie rzeczywistym oraz zapewnienia prawidłowego stymulowania wykorzystywany jest również oscyloskop (Tektronix model TDS 1002).</li>
<li>Ustawienia wzmacniacza EKG (Hugo Sachs Elektronik):
Filtr górnoprzepustowy: 0,1 Hz Filtr dolnoprzepustowy: 150 Hz</li>
<li>Kamerę CMOS (RedShirt Imaging) oraz makroskop ustawia się za pomocą regulacji w osiach X-Y-Z w taki sposób, aby powierzchnia serca była w ostrości i znajdowała się w centrum ramki akwizycji. Kamera i układ optyczny są zamontowane na stole wibroizolacyjnym (Minus K Technology) w celu zminimalizowania częstotliwości rezonansowych. Jednocześnie na prawym przedsionku umieszcza się współosiową elektrodę stymulującą (Harvard Apparatus), sterowaną za pomocą izolowanej jednostki elektrostymulacji S48 (Grass), a serce jest stymulowane z częstotliwością 300 uderzeń na minutę (Rysunek 1).</li>
<li>Ustawienia stymulacji elektrycznej (Grass): Częstotliwość: 5 impulsów na sekundę Opóźnienie: 0,2 ms Czas trwania: 2 ms Napięcie: 6–12 V Tryb: Powtórzenie Impuls: pojedynczy</li>
<li>W przypadku rejestracji optycznej, w której należy wyeliminować artefakty ruchowe wynikające z kurczenia się, serce musi zostać rozsprzężone elektromechanicznie. W tym celu ponownie przełączamy linie perfuzyjne na roztwór Krebsa-Henseleita zawierający 11 mMol/L BDM. Pomiędzy poszczególnymi pomiarami serce jest perfundowane czystym roztworem Krebsa-Henseleita, aby pomóc zachować żywotność preparatu.</li>
<li>Parametry rejestracji są ustawiane za pomocą oprogramowania (RedShirt Imaging) z następującymi ustawieniami akwizycji: Konfiguracja: 2 000 Hz; macierz 128x128 pikseli Interwał klatek: 0,5 ms Wzmocnienie wzmacniacza kamery: 5x Wzmocnienie w układzie (On-Chip Gain): 8x-12Me-well Migawka: opóźnienie 500 ms Liczba klatek: 4000 Czas trwania: 2000 ms</li>
<li>Wszystkie światła w pomieszczeniu oraz w urządzeniach zostają wyłączone lub osłonięte, aby wyeliminować szumy tła podczas rejestracji. Światło LED oświetla serce wyłącznie podczas rejestracji optycznej, aby zredukować fotowyblakanie i toksyczność barwnika. Przesłona źródła światła jest sterowana impulsem 5 V dostarczanym przez panel sterujący za pomocą karty cyfrowo-analogowej (D-to-A) w komputerze (RedShirt Imaging).</li>
</ol>
Część 4: Analiza informacji o akwizycji przy użyciu oprogramowania RedShirt Imaging Software
<ol>
<li>Po akwizycji dane są przetwarzane przy użyciu różnych ustawień filtrów. Zazwyczaj stosujemy ustawienia domyślne, z wyjątkiem regulacji filtra pasmowo-zaporowego/pasmowo-przepustowego, w którym lewa granica jest ustawiona na 44.0, a prawa na 98.0. Następnie zarejestrowane informacje są przetwarzane i generowany jest film (RedShirt Imaging).</li>
<li>Dane z jednej akwizycji odpowiadają lokalnej aktywacji elektrycznej w 16 384 punktach na powierzchni serca w okresie 2 sekund. Oprogramowanie umożliwia bezpośrednie porównanie tych lokalnych sygnałów ze sobą oraz z zapisami elektrograficznymi przedsionków i komór. Następnie dane są wizualizowane poprzez mapowanie lokalnej aktywacji elektrycznej na kolory i renderowanie tych informacji w formie animacji przedstawiającej spatiotemporealną aktywację elektryczną na powierzchni serca. Aby utworzyć taką animację, używamy oprogramowania, aby: 
<ul>
<li>przefiltrować dane czasowo i/lub przestrzennie</li>
<li>wybrać czas rozpoczęcia i zakończenia animacji</li>
<li>zmapować sygnały optyczne na kolory w oparciu o spoczynkową intensywność światła każdego piksela</li>
<li>nałożyć wynikowe dane kolorystyczne na obraz serca</li>
<li>wygenerować animację</li>
</ul>
</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Jeśli preparat perfundowanego serca pozostawał w bezruchu podczas rejestracji, sygnały optyczne wykazują jeden wyraźny szczyt dla każdego piksela zaangażowanego w zmianę intensywności emisji di-8-ANEPPS. Odpowiednie filmy (ryciny 3 i 4) obrazują front fali pobudzenia rozprzestrzeniający się po powierzchni epikardialnej serca, a także równolegle zarejestrowane zapisy elektrograficzne (rycina 2).
<img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Schemat układu Langendorffa do badania stymulacji serca z zaznaczonymi ponumerowanymi elementami." data-altupdatedat="1754904545000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Fotografia preparatu serca perfundowanego metodą Langendorffa, przedstawiająca położenie elektrody stymulującej w prawym przedsionku oraz odprowadzeń EKG, zgodnie z opisem w kroku 3.2.
<img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Schemat procesu biologicznego z sygnałami; analiza danych wyników mikroskopii fluorescencyjnej." border="0" data-altupdatedat="1754904545000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Reprezentatywne sygnały optyczne i zapisy elektrograficzne z perfundowanego serca szczura szczepu Lewis. Panel A przedstawia obraz powierzchni epikardialnej wykorzystanej do obrazowania optycznego. Pozycje pikseli wybranych w celu zademonstrowania zmian emisji fluorescencji w czasie w panelu B są wskazane kolorowymi strzałkami. Sygnały elektrograficzne przedstawiono w panelu C, gdzie czerwona linia oznacza aktywację przedsionków, a jasnoniebieska linia odpowiada sygnałowi komorowemu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg">kliknąć tutaj</a>.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Children's Hospital Boston.

Usunięcie serca z znieczulonych szczurów musi zostać przeprowadzone szybko, aby uniknąć niedokrwienia mięśnia sercowego. W przypadku wystąpienia niedokrwienia lub niewystarczającej perfuzji wieńcowej, w sercu prawdopodobnie rozwiną się arytmie i może dojść do zawału. Ponadto, takie serca będą wykazywać niewystarczającą emisję fluorescencji, co uniemożliwi uzyskanie informatywnych zapisów i przeprowadzenie późniejszych analiz. Przed załadowaniem barwnika, komórki mięśnia sercowego muszą zostać odpowiednio przepłukane rozt...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Sprzęt</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CardioPlex</td><td>Sprzęt</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła LED LUXEON 460-490 nm </td><td>Sprzęt</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz EKG Typ 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 505 nm</td><td>Sprzęt</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny długoprzepustowy 605 nm</td><td>Sprzęt</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT boczny</td><td>Sprzęt</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt z miniprzegubem kulowym</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw małych elektrod stymulujących</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Platforma izolacyjna od wibracji nablatowa BM-6</td><td>Sprzęt</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Jednobiegunowa elektroda EKG</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna SCI 400</td><td>Sprzęt</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna MasterFlex Easy Load II</td><td>Sprzęt</td><td>Cole-Parmer</td><td>Model 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Przewód Marprene nr 14</td><td>Sprzęt</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>Przewody MasterFlex</td><td>Sprzęt</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator impulsów prostokątnych S48</td><td>Sprzęt</td><td>Technologie traw</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>JEDNOSTKA IZOLACYJNA TRANSFORMATORA RF SIU5</td><td>Sprzęt</td><td>Technologie traw</td><td>Model SIU5</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem grzewczym o pojemności 5 litrów</td><td>Sprzęt</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem wodnym o pojemności 2 litrów</td><td>Sprzęt</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem wodnym o pojemności 0,5 litra</td><td>Sprzęt</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem wodnym o pojemności 0,25 litra</td><td>Sprzęt</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>Wężownica grzewcza 10 ml</td><td>Sprzęt</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka pęcherzykowa z regulacją podatności</td><td>Sprzęt</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula z złączem Luer Disconnect</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny, Luer-Lock żeński do Luer-Lock żeńskiego, bez zaślepek portów</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Termometr termoparowy</td><td>Sprzęt</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczna mikrosonda Ultra Fine z serii IT </td><td>Sprzęt</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop Tektronix TDS 1002</td><td>Sprzęt</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu </td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Klaweketaminy HCl</td><td>Odczynnik</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Odczynnik</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą langendorffa

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Mapowanie optyczne powierzchni serca z wykorzystaniem fluorescencyjnych barwników wrażliwych na napięcie stało się istotnym narzędziem do badania pobudzenia elektrycznego w modelach eksperymentalnych o różnej skali, od kultur komórkowych po całe organy[1, 2]Wykorzystując najnowocześniejsze systemy obrazowania optycznego, można niemal natychmiast wizualizować generowanie i propagację potencjałów czynnościowych podczas prawidłowego rytmu serca lub w trakcie inicjacji i utrzymywania arytmii[1]Najnowsze dostępne komercyjnie systemy mogą dostarczać informacji o niezwykle wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej i opierają się na specjalistycznym sprzęcie, opracowanym pierwotnie w celu pokonania ograniczeń narzucanych przez bardziej konwencjonalne metody elektrofizjologiczne[1]Postępy w dziedzinie wysokorozdzielczych i szybkich kamer CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) oraz intensywnie świecących diod LED (light-emitting diodes), a także barwników napięciowo-czułych, optyki i filtrów, sprawiły, że akwizycja sygnałów elektrycznych stała się praktyczna dla biologów komórki układu sercowo-naczyniowego, bardziej przyzwyczajonych do pracy z mikroskopami. Chociaż najnowsza generacja kamer CMOS potrafi rejestrować 10 000 klatek na sekundę w matrycy o rozdzielczości 16 384 pikseli, to w zależności od rodzaju przygotowania próbki, dawno ugruntowane technologie akwizycji fluorescencji, takie jak układy fotodiod, systemy skanowania laserowego i chłodzone kamery CCD (charged-coupled device), nadal wykazują pewne wyraźne zalety w zakresie zakresu dynamicznego, stosunku sygnału do szumu i wydajności kwantowej.[1, 3]W niniejszym badaniu przeprowadzono perfuzję serc szczurów linii Lewisex vivoz krystaloidalnym perfuzatem (roztwór Krebsa-Henseleita) w temperaturze 37°C na zmodyfikowanym aparacie Langendorffa. Po 20-minutowym okresie stabilizacji serca były przerywanie perfundowane 11 mMol/L 2,3-butanodionym monoksymem, aby wyeliminować ruchy związane ze skurczem podczas akwizycji obrazu. Do mapowania optycznego wykorzystano w sercach szybką sondę potencjometryczną di-8-ANEPPS[4](5 μMol/L) i krótko naświetlano preparat światłem wzbudzającym o długości fali 475±15 nm. Podczas typowego 2-sekundowego okresu naświetlania, światło o długości fali &gt;605 nm emitowane przez preparat serca było obrazowane za pomocą szybkiej kamery CMOS podłączonej do makroskopu poziomego. W tej demonstracji serca stymulowano z częstotliwością 300 uderzeń na minutę za pomocą elektrody współosiowej podłączonej do izolowanej jednostki stymulacji elektrycznej. Równocześnie rejestrowano bipolarnie zapisy elektrograficzne, które analizowano wraz z sygnałami napięciowymi przy użyciu dostępnego oprogramowania. W ten sposób potencjały czynnościowe na powierzchni serc szczurzych perfundowanych w aparacie Langendorffa mogą być wizualizowane i rejestrowane wraz z sygnałami elektrograficznymi.

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Mapowanie optyczne powierzchni serca z użyciem fluorescencyjnych barwników napięciowo-wrażliwych stało się istotnym narzędziem do badania pobudzenia elektrycznego w...

Witam, nazywam się Yon Ziv i pracuję w laboratorium dr. Cohena w Katedrze Anestezjologii w Children's Hospital i Howard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę mapowania optycznego w perfundowanych czerwonych sercach Lal. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania rozprzestrzeniania się aktywności elektrycznej na powierzchni serca.Zacznijmy zatem. W dniu eksperymentu, rano, przygotuj cztery litry roztworu Krebs-Henseleit (KHL). Po wymieszaniu roztworu usuń nierozpuszczone cząstki za pomocą filtra o rozmiarze porów 200 µm, stosując filtrację próżniową.Najpierw należy użyć jednego litra przygotowanego roztworu Krebsa-Henzela lite w celu rozpuszczenia 11 milimoli BDM. Następnie należy pobrać kolejne 100 mililitrów roztworu Krebsa-Henzela lite i wymieszać z 10 milimolarnym D eight NFS w DMSO, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromoli D eight annex w roztworze. Szklane zbiorniki z płaszczem wodnym, bulgotka oraz pozostałe szkło laboratoryjne użyte w tym doświadczeniu pochodzą z firmy red.Naughty.Przenieś oba roztwory do zbiorników uprzednio podgrzanych do 41 °C. Natlenij roztwory gazem przefiltrowanym przez filtr 0,2 µm przy użyciu zanurzonej pompy napowietrzającej; pompuj roztwory z trzech zbiorników zapasowych przez zamontowany na ścianie system Langendorfa za pomocą pomp perystaltycznych i silikonowych rurek o niskiej absorpcji w celu pobrania serca szczura. Najpierw wykonaj wewnątrzbrzuszny zastrzyk ketaminy i ksylazyny szczurowi rasy Lewis o masie od 200 do 250 g, aby wywołać głęboką narkozę ogólną, oraz heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi i niedokrwieniu mięśnia sercowego podczas eksplantacji.Gdy szczur zostanie całkowicie znieczulony i przestanie reagować na uciśnięcie palca u nogi, należy przystąpić do wyjęcia serca. Operację rozpocznij od usunięcia przedniej ściany klatki piersiowej, aby uzyskać łatwy dostęp do serca i głównych naczyń krwionośnych. Następnie ostrożnie rozprzutuj otaczające tkanki i otwórz worek osierdziowy.Po zidentyfikowaniu żyły głównej dolnej, podwiąż naczynie pięcioma szwami z nici Proline O i wypreparuj cały blok serca i płuc. Natychmiast umieść tkankę w lodowatym roztworze Krebsa-Henzela w zlewce o pojemności 50 ml na lodzie, szybko zidentyfikuj aortę wstępującą i oddziel ją od otaczającej tkanki. Wprowadź do aorty kaniulę o odpowiedniej średnicy.Należy uważać, aby nie wprowadzić kaniuli zbyt głęboko do pierścienia aortnego, co mogłoby przerwać niezbędną perfuzję tętnic wieńcowych. Kaniulę należy przymocować do aorty wstępującej. Następnie serce szczura należy umieścić w aparacie Linga-Endorfa, dbając o to, aby do kaniuli nie dostały się pęcherzyki powietrza.Wsteczna perfuzja naczyń wieńcowych została ustanowiona przy użyciu ciepłego, natlenionego roztworu Krebsa-Henseleia. Po oczyszczeniu głowicy ciśnieniowej aparatu Langendorfa, należy usunąć nadmiar tkanek, w tym płuca, a następnie perfundować serce przez 20 minut, aby umożliwić odzyskanie funkcji i stabilizację rytmu w trakcie perfuzji. Do jamy lewej komory należy wprowadzić bardzo cienką sondę termopary do pomiaru temperatury.Przymocuj sondę za pomocą pięciu szwów z Prolene 5-0 i dostosuj ustawienia pomp cyrkulacyjnych wody, aby utrzymać temperaturę serca. Przy 37 °C zminimalizuj ruch wywołany przez okapywanie z wierzchołka serca. Po umieszczeniu kawałka gazy w zbiorniku z odpływem serce jest gotowe do wprowadzenia barwnika potencjometrycznego w celu pozyskania sygnałów elektrograficznych i optycznych; wprowadź barwnik potencjometryczny dye eight NEPs do serca.Przełącz na linię perfuzyjną zawierającą płyn Krebsa z domieszką barwnika fluorescencyjnego. Ponieważ przedsionki nie są w wystarczającym stopniu perfundowane barwnikiem wprowadzonym przez tętnice wieńcowe, do lewego i/lub prawego przedsionka wprowadza się kaniulę o rozmiarze 18 G. Następnie do każdej z tych komór powoli podaje się dodatkowe 50 ml roztworu barwnika.Podczas procedury ładowania delikatnie umieść trzy odprowadzenia EKG na powierzchni serca, tak aby nie były skierowane w stronę optyki używanej do mapowania. Pierwszą elektrodę umieszcza się na tylnej części koniuszka lewej komory.Drugą elektrodę umieszcza się na lewym przedsionku, a trzecia pełni funkcję elektrody referencyjnej na pierścieniu aorty. Sygnały elektrograficzne z przedsionków i komór są następnie wzmacniane, digitalizowane i wyświetlane jako sygnały optyczne za pomocą oprogramowania. Wykorzystuje się również oscyloskop do wizualizacji powierzchniowego EKG w czasie rzeczywistym oraz w celu zapewnienia odpowiedniego stymulowania.Ustaw wzmacniacz EKG na 0,1 Hz dla filtra górnoprzepustowego oraz na 150 Hz dla filtra dolnoprzepustowego. Ustaw kamerę CMOS za pomocą regulacji w osiach X, Y i Z. Kawałek szkła umieszczony w płaszczyźnie ogniskowej kamery należy przyłożyć do powierzchni serca w taki sposób, aby obszar zainteresowania był ostry i znajdował się w centrum ramki akwizycji. Kamera i optyka są zamontowane na stole wibroizolacyjnym w celu zminimalizowania częstotliwości rezonansowych.W tym samym czasie w prawym przedsionku należy umieścić współosiową elektrodę stymulującą sterowaną za pomocą izolowanej jednostki stymulacji elektrycznej S 48. Pozwoli to na stymulację serca z częstotliwością 300 uderzeń na minutę; stymulację elektryczną należy ustawić w następujący sposób.Częstotliwość powinna wynosić pięć impulsów na sekundę, opóźnienie 0,2 milisekund, czas trwania stymulacji dwie milisekundy przy napięciu od sześciu do 12 V, a tryb ustawiony na powtarzalny oraz pojedynczy impuls. W przypadku rejestracji optycznych pozbawionych artefaktów ruchowych wynikających ze skurczu, serce musi zostać rozsprzężone elektromechanicznie. Należy to zrobić, ponownie przełączając linie perfuzyjne na roztwór Krebsa-Hensela zawierający 11 mM BDM.Pomiędzy akwizycjami należy perfundować serce czystym roztworem Krebsa-HENSEL light, aby pomóc w zachowaniu żywotności preparatu. Parametry rejestracji w oprogramowaniu należy skonfigurować na 2000 hertz z matrycą o rozmiarze 128 na 128 pikseli.Interwał klatek należy ustawić na 0,5 milliseconds, a wzmocnienia na five x dla wzmacniacza kamery oraz eight x dla wzmocnienia wewnątrzukładowego. Wzmocnienie wewnątrzukładowe należy ustawić również na 12. W sterowaniu kamerą w oprogramowaniu należy ustawić opóźnienie migawki na 500 milliseconds i zarejestrować 4 000 klatek przy czasie trwania 2000 milliseconds.Wyłączyć lub osłonić wszystkie światła w pomieszczeniu i urządzenia, aby wyeliminować szum tła podczas rejestracji; światło LED powinno oświetlać serce wyłącznie w trakcie rejestracji optycznej. Aby ograniczyć fotoblaknięcie i toksyczność barwnika, sterować migawką źródła światła za pomocą impulsu pięciu wolt dostarczanego przez panel sterowania przez płytkę przetwornika cyfrowo-analogowego (D2A) w komputerze po akwizycji. Przetwarzać dane, korzystając z różnych ustawień filtrów.Zazwyczaj stosuje się ustawienia domyślne, z wyjątkiem regulacji pasmowo-zaporowego filtra, którego dolna granica jest ustawiona na 44.0, a górna na 98.0. Następnie zarejestrowane informacje są przetwarzane i wykorzystywane do wygenerowania filmu. Dane z jednej akwizycji odpowiadają lokalnej aktywacji elektrycznej w 16 384 punktach na powierzchni serca w okresie dwóch sekund.Oprogramowanie umożliwia bezpośrednie porównanie tych sygnałów lokalnych ze sobą oraz z danymi z zapisów elektrograficznych przedsionków i komór poprzez mapowanie lokalnej aktywacji elektrycznej na kolory i renderowanie tych informacji w formie animacji przedstawiającej spatiotemporalną aktywację elektryczną na powierzchni serca. Aby utworzyć taką animację, należy najpierw wykorzystać oprogramowanie do filtrowania danych w czasie i/lub przestrzeni. Następnie należy wybrać czas rozpoczęcia i zakończenia animacji.Po trzecie, przypisz sygnały optyczne do kolorów na podstawie spoczynkowej intensywności światła każdego piksela. Po czwarte, nałóż wynikowe dane kolorystyczne na obraz serca, a na koniec wygeneruj animację, jeśli preparat perfundowanego serca pozostał nieruchomy. Podczas rejestracji sygnały optyczne wykazują jeden wyraźny szczyt dla każdego piksela zaangażowanego w zmianę intensywności emisji D eight anep. Te filmy z obrazowania w czasie rzeczywistym demonstrują front fali pobudzenia rozprzestrzeniający się po powierzchni epikardium serca, a także jednocześnie zarejestrowane zapisy elektrograficzne.Właśnie zademonstrowaliśmy technikę o wysokiej rozdzielczości do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura Alanor Perfuse Red. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest szybkie usunięcie serca z znieczulonego szczura. Aby uniknąć niedokrwienia mięśnia sercowego, komórki mięśnia sercowego muszą być odpowiednio perfundowane, a serce musi zostać całkowicie nasycone barwnikiem wrażliwym na wodę.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mapowanie optyczne serc szczurów perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis metodologii i wyników jednoczesnego endokardialnego i epikardialnego mapowania optycznego wzbudzenia elektrycznego w nienaruszonym lewym przedsionku serca owczego perfundowanego metodą Langendorffa podczas indukowanego rozciąganiem migotania przedsionków.

Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

W tym filmie wykonujemy retrogradacyjną perfuzję Langendorffa izolowanego serca myszy. Podczas zabiegu czynność serca jest utrzymywana poprzez jego wsteczne perfuzję roztworem perfuzyjnym przez tętnice wieńcowe za pomocą kaniuli wprowadzanej do aorty wstępującej. Model służy do badania patofizjologii serca serca.

Wsteczna perfuzja serca Langendorffa: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Izolowane serce szczura jest trwałym modelem uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. W tym miejscu opisujemy proces pobierania bijącego serca od szczura poprzez kaniulację aorty in situ, perfuzję Langendorffa serca, symulowane uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne i barwienie zawału, aby potwierdzić zakres urazu niedokrwiennego.

Indukcja i ocena uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w sercach szczurów z perfuzją Langendorffa

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Poznaj technikę mapowania optycznego potencjałów czynnościowych na powierzchni serc szczurów perfundowanych metodą Langendorffa z użyciem barwnika di-8-ANEPPS. Ta metoda umożliwia badanie aktywności elektrycznej mięśnia sercowego z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Przeglądaj więcej filmów