Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na nośnikach stałych

Aby zmierzyć długość życia w C Elgan, generuje się populację zsynchronizowaną z wiekiem za pomocą czasowego egg lang reprodukcyjnego. Aktywne dorosłe larwy hermafrodyty są przenoszone na płytki wzrostu nicieni nasiane UV zabijaną e-coli, pozwalane składać jaja przez sześć do ośmiu godzin, a następnie usuwane przez kolejne dwa dni; z tych jaj wykluwają się robaki i osiągają stadium larwy L cztery. Cztery robaki L są przenoszone na nowe płytki NGM zawierające ampicylinę, aby zapobiec zakażeniu żywymi bakteryjnymi, oraz FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu, i pozwalają im rozwinąć się w dorosłe osobniki.

Od tego momentu dorosłe robaki obserwuje się co dwa do trzech dni, aż wszystkie robaki zginą. W każdym momencie usuwane są martwe robaki z płyty, a liczba żywych i martwych robaków jest rejestrowana. Jestem George Seton z laboratorium Matta Capline'a w Katedrze Patologii na Uniwersytecie Waszyngtońskim.

Dziś pokażemy Ci, jak mierzyć długość życia i docenić naszą elegancję w zakresie zapalenia wątroby. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genetyki starzenia. Więc zaczynajmy.

Podstawowy eksperyment długości życia wymaga dwóch typów płytek: standardowych płytek NGM, które nie zawierają dodatków, oraz płyt AMP FUDR, do których do NGM dodaje się zarówno ampicylinę, jak i fluorooksydezydynę. Oba typy płytek są osadzone bakterią E coli OP 50, która następnie zostaje zabita przez ekspozycję na UV. Zacznij od przygotowania 10 mililitrów roztworu NGM.

Na 60 milimetrowe szalki Petriego całkowicie topią stałe NGM przez podgrzewanie w mikrofalówce na wysokim poziomie w 32 impulsach. Mieszaj medium między impulsami, aby zapobiec gromadzeniu się pęcherzyków gazu pod ciśnieniem, umieść ciekłą NGM w kąpieli wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza lub na stole, aby umożliwić chłodzenie medium. Gdy medium ostygnie do 55 stopni Celsjusza, wtedy powinieneś móc wygodnie trzymać szklany pojemnik gołymi rękami, jest gotowy do dodania leków.

Aby nalać płytki z lekami, dodaj 33 mikrolitry 150 milimolowych FUDR i 100 mikrolitrów 100 miligramów na mililitr. Ampicylina na 100 mililitrów NGM oraz wir do mieszania ampicyliny służy do zapobiegania zakażeniu obcymi bakteryjnymi, a FUDR zapobiega wykluciu się jaj. Dlatego robaki nie będą musiały być przenoszone co kilka dni, aby oddzielić je od rosnących larw.

Następnie wylej podłoże i pozwól płytkom wyschnąć na stole przez dwa dni dzień przed zakończeniem suszenia nasion, płynną kulturę LB z pojedynczą kolonią świeżego pasu e. coli. OP 50 bakterii na ślimaku LB. Przygotuj co najmniej 0,5 mililitra hodowli na płytkę 60 milimetrów.

Umieść hodowlę OP 50 w shakerze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól bakteriom rosnąć przez noc. Następnego dnia odizoluj bakterie OP 50 z siłą odśrodkową 3 500 g przez 10 minut. Przelej tyle supernatantu, aby ponownie zawiesić bakterię w stężeniu 10x.

Teraz zaszczep każdą płytkę 100 mikrolitrami skoncentrowanej hodowli. Unikaj dotykania końcówki pipety z powierzchnią NGM, ponieważ niedoskonałości powierzchni podłoża pozwolą robakom wbić się w płyty wirowe, aż bakterie pokryją centralną część NGM, nie zbliżając się do ścian płytek, i pozostawić płytki do wyschnięcia na stole przez 24 godziny. Po wyschnięciu wystaw powierzchnię płytek na dawkę UV wystarczająco silną, by zatrzymać wzrost bakterii; używamy genu strata UV straddle linker 2, 400.

Zacznij od załadowania płyt do łącznika straddle bez ich pokryw. Teraz naciskaj energię. Wpisz 9 9 9 9 9 na klawiaturze i naciśnij start.

Płyty będą wystawione na działanie UV przez około pięć minut. Płytki z bakteriami zabijanymi promieniami UV można przechowywać do góry nogami w temperaturze czterech stopni Celsjusza nawet przez miesiąc. Ta sekcja opisuje, jak wygenerować populację robaków o wspólnej dacie wykłuwania.

Zacznij od przeniesienia około 20 młodych dorosłych robaków na świeżą płytkę NGM bez leków. Zostaw talerz w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około tydzień, aby robaki mogły się rozmnażać i zjeść cały pokarm bakteryjny w ciągu tygodnia. Nowo wyklute robaki w stadium wstrzymanego wzrostu powinny pojawić się, przenoszone 20 do 30 larw wdowia na świeżą płytkę NGM bez leków i wysiabowane w temperaturze 25 stopni Celsjusza w obecności pożywienia.

Larwy posagowe stają się doległymi osobnikami aktywnymi rozrodczymi w ciągu dwóch dni i pozostają aktywne rozrodczo przez kilka kolejnych dni. Teraz przenieś 10 do 15 aktywnych dorosłych osobników na świeżą płytkę NGM bez leków. Ta tablica nazywana jest timed bearing egg lub TEL plate.

Zostaw płytę TEL na 25 stopniach Celsjusza, aby robaki mogły złożyć jaja. Zwierzęta, które wykluwają się z tych jaj, będą zwierzętami doświadczalnymi, a ich długość życia zostanie oceniona po sześciu godzinach. Sprawdź płytę TEL pod kątem jaj.

Jeśli jaj jest jeszcze za mało, pozostawij płytę TEL w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez maksymalnie 24 godziny. Okresowo sprawdzam jajka. Gdy zniesie się wystarczająca liczba jaj, usuń dorosłe z płyty TEL.

Typowy eksperyment na długość życia wymaga od 30 do 90 jaj na grupę eksperymentalną, ale na jednej płycie TEL można wygenerować kilkaset jaj. Około 150 jaj zostanie złożonych przez 10 do 15 dorosłych osobników aktywnych rozrodczo w ciągu sześciu do ośmiu godzin. Porównując grupy eksperymentalne, można uzyskać istotność statystyczną dla dużych różnic długości życia przy zaledwie 30 osobach.

Więcej zwierząt powinno być używanych do wyróżniania mniejszych różnic. Teraz umieść płytkę TEL bez dorosłych osobników w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż jaja się wyklują, a robaki rozwiną się do czwartego stadium larwalnego L. Zazwyczaj zajmuje to dwa dni dla dzikiej elegancji typu C, ale może to potrwać dłużej dla szczepów o wolnorozwojowych fenotypach.

Ta sekcja opisuje, jak śledzić życie populacji zsynchronizowanej z wiekiem. Najpierw przenieś larwę L 4 z płyty TEL na osiadłe płytki AMP FUDR. Dla każdego testowanego szczepu lub stanu zazwyczaj ustawia się dwie do trzech płyt po 25 do 30 robaków na płytę.

Inkubuj płytki AMP FUDR w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie wizualnie oceniam robaki, podłoża i bakterie przenoszą robaki na świeże płytki AMP FUDR. Jeśli robaki zjadły większość pokarmu bakteryjnego, zwykle dzieje się to raz lub dwa razy w tygodniu.

Na początku eksperymentu, jeśli obecna jest znaczna liczba larw, zwykle oznacza to, że robaki zostały przeniesione na płytki AMP FUDR jako młode dorosłe osoby, a nie jako czwórki L. Młode dorosłe mogą składać jaja zanim FUDR zacznie działać, a czasami larwy uciekają od skutków FUDR i rosną na dorosłe osobniki. Larwy te zakłócą eksperyment w takiej sytuacji, przeniosą dorosłe robaki na świeże płytki i wyrzucą stare płytki z larwami.

Robaki powinny być również przenoszone na świeże płytki, jeśli zaobserwuje się żywe rozwijające się bakterie. Zazwyczaj połączenie zabijania AMP i UV zapewnia, że żadne żywe bakterie nie zanieczyszczą eksperymentu, choć czasami się to zdarza. Przenieś też robaki.

Jeśli na podłożu obserwuje się wzrost grzybów. Jeśli grzyb zostanie wykryty wystarczająco wcześnie, można go wyciąć za pomocą końcówki pipety lub szpatułki. Gdy robaki rosną do średnicy przekraczającej kilka milimetrów, zwykle łatwiej jest przenieść robaki na nową płytę.

Oceniaj wszystkie robaki pod kątem długości życia co dwa do trzech dni. Używam lunety do sekcji (dissec). Określ, czy każdy robak jest żywy czy martwy.

Delikatnie stuknij w talerz. Robak żyje, jeśli porusza się w odpowiedzi na stukanie. Jeśli robak nie reaguje na stuknięcie w płytkę, przybliż okolicę głowy, delikatnie stuknij w głowę robaka platynowym kostką transferowym.

Notuj robaka jako martwego. Jeśli nie zareaguje ruchem głowy, usuń martwą robaczkę z płyty. Po sprawdzeniu wszystkich robaków zapisz datę oraz liczbę żywych i martwych robaków.

Robaki utrzymywane na podłożu stałym czasami wydostają się z powierzchni płyty, wspinając się lub wspinając się po ścianie. Uciekające robaki są całkowicie pominięte w badaniu. Po zakończeniu znowu umieść płyty w inkubatorze 20 stopni Celsjusza.

Poczekaj jeszcze dwa do trzech dni, a potem ponownie sprawdź tablice. Kontynuuj ten reżim, aż wszystkie robaki znikną. Liczba dżdżownic, które umierają każdego dnia, jest zazwyczaj odwrócona, aby obliczyć odsetek żywych robaków danego dnia; dane te są wykresowe jako krzywa przeżywalności, uwzględniając dzień złożenia jaj w określonym czasie.

Dzień zero. Typowa mediana życia dla N 2. Szczep typu dzikiego Sea Elgan utrzymywany na bakteriach UV w temperaturze 20 stopni Celsjusza trwa około 25 dni, mierzony od jaja.

Właśnie pokazaliśmy wam, jak mierzyć długość życia i dostrzegać elegancję. Możesz zmodyfikować tę podstawową procedurę, aby testować różne warunki środowiskowe, w tym ograniczenia dietetyczne i interferencję RNA, co jest omówione w tekście wspierającym. I to wszystko.

Dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymencie.