Name: Zakażenie wirusem krowianki i czasowa analiza ekspresji genów wirusa: część 2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę syntezy cDNA z RNA po zakażeniu komórek HeLa wirusem vaccinia. Protokół obejmuje izolację RNA, transkrypcję odwrotną i amplifikację do analizy mikromacierzowej ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze dla stypendystów Whitehead Institute

Część 1: Synteza cDNA z RNA
<ol>
<li>Przed użyciem zestawu Ambion Amino Allyl MessageAmp II należy dodać zalecaną objętość 100% etanolu do buforów do płukania.</li>
<li>Do probówki do reakcji PCR należy dodać od 100ng do 5µg całkowitego RNA oraz 1µl primera T7 oligo (dT). Objętość należy uzupełnić do 12µl wodą wolną od nukleaz.</li>
<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 70°C przez 10 min w termocyklerze.</li>
<li>Próbki RNA należy wyjąć z temperatury 70°C i krótko odwirować. Następnie umieścić na lodzie.</li>
<li>Należy przygotować master mix do syntezy 1szej nici i przechowywać go w temperaturze pokojowej (z 10% nadwyżką na błędy pipetowania). (Tabela 1)</li>
<li>Master Mix należy delikatnie wymieszać za pomocą pipety lub poprzez lekkie potrząśnięcie probówką, a następnie krótko odwirować.</li>
<li>Do każdej próbki RNA należy przenieść 8µl Master Mixu. Wymieszać poprzez 3-4 krotne pipetowanie w górę i w dół.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 42°C przez 2 godziny w termocyklerze.</li>
<li>Próbki należy krótko odwirować i umieścić na lodzie. Natychmiast przejść do następnego etapu syntezy dsDNA.</li>
<li>Master mix do syntezy 2giej nici należy przygotować na lodzie (z 10% nadwyżką na błędy pipetowania). (Tabela 2)</li>
<li>Master Mix należy delikatnie wymieszać za pomocą pipety lub poprzez lekkie potrząśnięcie probówką, a następnie krótko odwirować.</li>
<li>Do każdej próbki należy przenieść 80µl i delikatnie wymieszać poprzez 3-4 krotne pipetowanie w górę i w dół.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 16°C przez 2 godziny w termocyklerze.</li>
<li>Po 2-godzinnej inkubacji należy przejść do etapu oczyszczania cDNA lub natychmiast zamrozić próbki w temperaturze –20°C.</li>
</ol>
Część 2: Oczyszczanie dwuniciowego cDNA
<ol>
<li>Wyjmij cDNA Pure z lodówki i pozostaw do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej na 30 minut przed użyciem. Przed użyciem wstrząśnij butelką, aby całkowicie resuspendować magnetyczne kulek wiążące cDNA.</li>
<li>Odmień wodę wolną od nukleaz do probówki 1,5 mL i inkubuj w temperaturze 50-60°C przez co najmniej 10 minut w trakcie poprzedniej 2-godzinnej inkubacji.</li>
<li>Dodaj 180µl cDNA Pure do każdej próbki i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Przenieś próbki do 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie.</li>
<li>Kontynuuj mieszanie próbek, delikatnie wstrząsając płytką na wytrząsace orbitalnym przez co najmniej 2 minuty.</li>
<li>Przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby wychwycić kuleczki magnetyczne. Pozostaw płytkę na statywie przez około 6 minut lub do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kuleczki wiążące utworzą osad.</li>
<li>Ostrożnie odessij nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usuń nadsącz pipetą i go wylej.</li>
<li>Zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego.</li>
<li>Dodaj 150µl buforu do przemywania cDNA (cDNA Wash Buffer) do każdego dołka i wstrząśnij płytką przez 1 minutę na wytrząsace orbitalnym z umiarkowaną prędkością. Na tym etapie kuleczki NIE ulegną dyspersji ze względu na niskie napięcie powierzchniowe buforu do przemywania.</li>
<li>Przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby wychwycić kuleczki magnetyczne.</li>
<li>Ostrożnie odessij nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usuń nadsącz pipetą i go wylej.</li>
<li>Zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego.</li>
<li>Powtórz przemywanie po raz 2nd za pomocą 150µl buforu do przemywania cDNA.</li>
<li>Po 2nd przemywaniu osusz kuleczki, wstrząsając płytką przez 2 minuty na wytrząsace orbitalnym z maksymalną prędkością. Nie przesuszyć!</li>
<li>Eluuj cDNA z kuleczek, dodając 18µl podgrzanej wcześniej wody wolnej od nukleaz do każdej próbki.</li>
<li>Intensywnie wstrząsaj płytką przez 3 minuty na wytrząsace orbitalnym, a następnie sprawdź, czy kuleczki magnetyczne są całkowicie zdyspergowane. Jeśli nie, kontynuuj wstrząsanie.</li>
<li>Gdy kuleczki magnetyczne zostaną całkowicie zdyspergowane, przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby je wychwycić.</li>
<li>Ostrożnie przenieś eluowane cDNA (~16µl) do nowej płytki PCR (lub probówek PCR).</li>
<li>Przejdź bezpośrednio do następnego kroku lub zamroź cDNA w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
Część 3: Transkrypcja in vitro (IVT)
<ol>
<li>Przygotować mieszaninę główną (master mix) do IVT w temperaturze pokojowej. (Tabela 3)</li>
<li>Delikatnie wymieszać mieszaninę główną za pomocą pipety lub poprzez lekkie potrząsanie probówką, a następnie krótko odwirować.</li>
<li>Dodać 24µl mieszaniny do każdej próbki i delikatnie wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół 3-4 razy.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 14 godzin w termocyklerze, a następnie przechowywać w 4°C do momentu przejścia do następnego etapu.</li>
</ol>
Część 4: Oczyszczanie aRNA po IVT
<ol>
<li>Krótko wymieszać kuleczki do wiązania RNA w wstrząsarku vortex, aby uzyskać jednorodną zawiesinę przed użyciem.</li>
<li>Przygotować mieszaninę wiążącą aRNA (aRNA Binding Mix) w temperaturze pokojowej. (Tabela 4) Można to zrobić z wyprzedzeniem – przygotowana mieszanina wiążąca może być przechowywana w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia.</li>
<li>Dokładnie wymieszać za pomocą vortexa.</li>
<li>Odnieść aRNA Elution Buffer do probówki 1,5 mL i inkubować w temperaturze 50-60°C przez co najmniej 10 minut.</li>
<li>Dodać 70µl mieszaniny wiążącej aRNA do każdej próbki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.</li>
<li>Przenieść próbki z płytki PCR do płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym.</li>
<li>Dodać 50µl 100% izopropanolu do każdej próbki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.</li>
<li>Delikatnie wstrząsać płytką na wstrząsarce orbitalnej przez co najmniej 2 minuty, aby dokładnie wymieszać próbki.</li>
<li>Przenieść płytkę na statyw magnetyczny w celu wychwycenia kuleczek magnetycznych. Pozostawić płytkę na statywie do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kuleczki wiążące ulegną zbiciu w pellet.</li>
<li>Ostrożnie odessać nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i go odrzucić.</li>
<li>Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego.</li>
<li>Dodać 100µl aRNA Wash Solution do każdego dołka i wstrząsać płytką przez 1 minutę na wstrząsarce orbitalnej z umiarkowaną prędkością. Na tym etapie kuleczki mogą nie rozprzestrzenić się całkowicie.</li>
<li>Przenieść płytkę na statyw magnetyczny w celu wychwycenia kuleczek magnetycznych.</li>
<li>Ostrożnie odessać nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usunąć nadsącz pipetą i go odrzucić.</li>
<li>Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego.</li>
<li>Powtórzyć płukanie po raz 2nd przy użyciu 100µl aRNA Wash Solution.</li>
<li>Po 2nd płukaniu osuszyć kuleczki, wstrząsając płytką przez 1 minutę na wstrząsarce orbitalnej z maksymalną prędkością. Nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia próbek!</li>
<li>Eluować aRNA z kuleczek, dodając 40µl podgrzanego aRNA Elution Buffer do każdej próbki.</li>
<li>Intensywnie wstrząsać płytką na wstrząsarce orbitalnej przez 3 minuty, a następnie sprawdzić, czy kuleczki magnetyczne są całkowicie rozproszone. Jeśli nie, kontynuować wstrząsanie.</li>
<li>Po całkowitym rozproszeniu kuleczek magnetycznych przenieść płytkę na statyw magnetyczny w celu ich wychwycenia. Nadsącz zawiera oczyszczone aRNA z wbudowanym aminoallylem.</li>
<li>Ostrożnie przenieść eluowane aRNA do nowej płytki PCR (lub probówek PCR).</li>
<li>(Krok opcjonalny) Sprawdzić stężenie RNA w próbkach, mierząc 1,5µl na spektrofotometrze NanoDrop.</li>
<li>Bezzwłocznie przejść do następnego kroku lub przechowywać aRNA w temperaturze –80°C.</li>
</ol>
Tabela 1: cDNA 1st Mieszanina Master Mix do syntezy nici
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>Odczynnik</td>
<td>Ilość na 1 reakcję</td>
</tr>
<tr>
<td>10X bufor do syntezy pierwszej nici</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina dNTP</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Inhibitor rybonukleazy</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Array Script</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2: cDNA 2nd Mieszanina Master Mix do syntezy nici
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>Odczynnik</td>
<td>Ilość na 1 reakcję</td>
</tr>
<tr>
<td>Woda wolna od nukleaz</td>
<td>63 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>10X bufor do syntezy drugiej nici</td>
<td>10 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina dNTP</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Polimeraza DNA</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>RNaza H</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Tabela 3: Mieszanina główna IVT
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>Odczynnik</td>
<td>Ilość na 1 reakcję</td>
</tr>
<tr>
<td>roztwór aaUTP (75 mM)</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>mieszanina ATP, CTP, GTP (25 mM)</td>
<td>12 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>roztwór T7 UTP (75 mM)</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>10X bufor reakcyjny T7</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>mieszanina enzymów T7</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Tabela 4: Mieszanina wiążąca aRNA
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>Odczynnik</td>
<td>Ilość na 1 reakcję</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulek wiążących RNA*</td>
<td>10 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Roztwór do resuspensji kulek*</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>100% izopropanol**</td>
<td>6 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Koncentrat buforu wiążącego aRNA</td>
<td>50 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
* Najpierw wymieszaj kulki do wiązania RNA z roztworem do resuspensji kulek. ** Dodaj izopropanol i dokładnie wymieszaj przed dodaniem koncentratu buforu do wiązania aRNA.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Kluczowe etapy
Nie zaleca się drugiej rundy amplifikacji, ponieważ zaobserwowano błędy w danych z macierzy. Staranne mieszanie na każdym etapie enzymatycznym (synteza 1st i 2nd nici cDNA, IVT) jest krytyczne dla uzyskania dobrych wydajności amplifikacji, podobnie jak inkubacja każdego etapu enzymatycznego w odpowiedniej temperaturze. Preferowany jest termocykler PCR z regulowaną podgrzewaną pokrywą – nawet niewielkie odchylenia rzędu 2-3 stopni podczas IVT w piecu do hybry...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do amplifikacji aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Odczynnik</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Na 20 reakcji</td></tr><tr><td>Zestaw do amplifikacji aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Odczynnik</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Na 100 reakcji, w formacie 96-dołkowym</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS NanoDrop ND-1000</td><td>Inne</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Lub równoważny spektrofotometr</td></tr></tbody></table>

infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

RodzinaPoxviridaeskłada się z wirusów zawierających duże dwuniciowe DNA, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Członkowie grupyorthopoxrodzaj obejmuje variola, czynnik etiologiczny ospy prawdziwej u ludzi, monkeypox oraz vaccinia (VAC), prototypowego przedstawiciela rodziny wirusów. W obrębie stosunkowo dużego (~ 200 kb) genomu vaccinia kodowane są trzy klasy genów: wczesne, pośrednie i późne. Choć wszystkie trzy klasy są transkrybowane przez wirusowe polimerazy RNA, każda z nich pełni inną funkcję w cyklu życiowym wirusa. Poxviruses wykorzystują wiele strategii modulacji środowiska komórkowego gospodarza podczas infekcji. Aby zrozumieć regulację ekspresji genów zarówno gospodarza, jak i wirusa, zastosowaliśmy podejścia genomowe do analizy liczebności transkryptów z komórek wirusowych i gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy przebieg infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz pobieranie RNA w kilku punktach czasowych po infekcji. Całkowite RNA gospodarza i wirusa jest izolowane i amplifikowane w celu hybrydyzacji z mikromacierzą do analizy ekspresji genów.

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 2 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Rodzina Poxviridae składa się z dużych wirusów zawierających dwuniciowy DNA, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Członkowie...

Witajcie, jestem Judy Yen z laboratorium Kate Rubins w Whitehead Institute for Biomedical Research. Po zainfekowaniu komórek HeLa wirusem ospy krowiej (vaccinia virus) i wyizolowaniu całkowitego RNA, co pokazano w poprzednim protokole wideo JoVE, RNA wirusowe można wyizolować i namnożyć za pomocą odwrotnej transkrypcji oraz transkrypcji in vitro. Namnożone RNA zostanie później wykorzystane w analizie mikromacierzy w celu zbadania ekspresji genów wirusowych i gospodarza. Zaczynajmy.Aby rozpocząć syntezę cDNA z RNA, przed użyciem zestawu Ambient Amino Allele Message AMP 2, należy dodać zalecaną objętość 100% etanolu do buforów płuczących. Do probówki PCR należy dodać od 100 ng do 5 µg całkowitego RNA oraz 1 µl oligoprimera T7. Objętość należy uzupełnić wodą wolną od nukleaz do 12 µl. Próbki należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 70 °C przez 10 minut.Następnie wyjmij próbki RNA z temperatury 70 °C w wirówce. Po wirowaniu krótko schłodź próbki na lodzie. Przygotuj master mix do syntezy pierwszej nici z 10% nadmiarem objętości, aby zrekompensować błędy podczas pipetowania.Pozostawić w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetować master mix lub potrząsnąć w celu wymieszania, a następnie krótko odwirować. Po odwirowaniu przenieść 8 µL master mixu do każdej próbki RNA i wymieszać, pipetując w górę i w dół trzy lub cztery razy. Inkubować w temperaturze 42 °C przez dwie godziny w termocyklerze. Po inkubacji krótko odwirować próbki i umieścić na lodzie. Natychmiast przejść do następnego etapu syntezy cDNA.Przygotować mieszaninę master mix do syntezy drugiej nici w lodzie, z nadmiarkową objętością 10%, aby zrekompensować błędy pipetowania; delikatnie pipetować mieszaninę lub potrząsnąć probówką, a następnie krótko odwirować w wirówce. Przenieść 80 µL do każdej próbki i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół od trzech do czterech razy. Inkubować w temperaturze 16 °C przez dwie godziny w termocyklerze.Po dwugodzinnej inkubacji należy przejść do etapu oczyszczania cDNA lub natychmiast zamrozić próbkę w temperaturze -20 °C. Aby rozpocząć oczyszczanie dwuniciowego cDNA, najpierw należy wyjąć cDNA pure z lodówki i pozostawić go na 30 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Przed użyciem wstrząsnąć butelką, aby w pełni resuspendować magnetyczne kulek wiążące cDNA. Następnie odmierzyć odpowiednią ilość wody wolnej od nukleaz do probówki 1,5 ml i inkubować w temperaturze od 50 do 60 °C przez co najmniej 10 minut.Podczas poprzedniej dwugodzinnej inkubacji dodać 180 µL CD NA pure do każdej próbki i dokładnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Przenieść próbki do płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym. Po przeniesieniu próbek do płytki kontynuować mieszanie, delikatnie wstrząsając płytką na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej dwie minuty.Przenieś płytkę na statyw magnetyczny, aby uchwycić kuleczki magnetyczne. Pozostaw płytkę na statywie przez około sześć minut lub do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kuleczki wiążące utworzą osad.Alternatywnie, ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety i go wylej. Po usunięciu supernatantu zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego. Dodaj 150 µL buforu do przemywania cDNA do każdej dołki i inkubuj płytkę przez jedną minutę na wytrząsacie orbitalnym przy umiarkowanej prędkości.Na tym etapie kuleczki nie rozproszą się ze względu na niskie napięcie powierzchniowe buforu płuczącego. Po wstrząśnięciu należy umieścić płytkę z powrotem na statywie magnetycznym. Aby zatrzymać kuleczki magnetyczne, należy ostrożnie odessać nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, uważając, by nie poruszyć kuleczek magnetycznych.Lub ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety i go wylej. Zdejmij płytkę z podstawy magnetycznej. Powtórz płukanie drugi raz, używając 150 µL buforu do płukania CDNA.Po drugim płukaniu osusz kuleczki, potrząsając płytką przez dwie minuty na wytrząsaczu orbitalnym z maksymalną prędkością. Ważne jest, aby nie dopuścić do nadmiernego wyschnięcia kuleczek. Następnie eluuj cDNA z kuleczek, energicznie dodając 18 µL podgrzanej wody wolnej od nukleaz do każdej próbki.Wstrząsaj płytką przez trzy minuty na wytrząsarce orbitalnej. Następnie sprawdź, czy kulki magnetyczne są całkowicie zdyspergowane. Jeśli nie, kontynuuj wstrząsanie.Po całkowitym rozproszeniu kulek magnetycznych, przenieś płytkę na statyw magnetyczny. Aby odzyskać kulki magnetyczne, ostrożnie przenieś eluat cd NA do nowej płytki PCR lub probówek PCR. Odzyskiwana objętość eluatu powinna wynosić około 16 µL na próbkę.Należy przejść bezpośrednio do następnego kroku lub zamrozić cDNA w temperaturze -20°C. Przygotować master mix do IVT w temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszać master mix za pomocą pipety lub poprzez potrząsanie, a następnie krótko odwirować.Po wirowaniu należy dodać 24 µL do każdej próbki i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 14 godzin w termocyklerze. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przejścia do kolejnego kroku; przed użyciem krótko wymieszać kuleczki do wiązania RNA za pomocą vortexa, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Mieszaninę A do wiązania RNA przygotować w temperaturze pokojowej.Można to zrobić z wyprzedzeniem. Przygotowaną mieszaninę wiążącą można przechowywać w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia. Wymieszać dokładnie za pomocą wirówki vortex, przenieść alikwot buforu do elucji RNA A do probówki o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze od 50 do 60 °C przez co najmniej 10 minut.Następnie do każdej próbki należy dodać 70 µL mieszaniny wiążącej RNA A i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół od trzech do czterech razy. Przenieś próbki z płytki PCR do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem. Następnie do każdej próbki dodaj 50 µL stuprocentowego izopropanolu i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół od trzech do czterech razy.Delikatnie potrząsaj płytką na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej dwie minuty. Aby dokładnie wymieszać próbki, przenieś płytkę na statyw magnetyczny w celu wychwycenia kulek magnetycznych.Pozostaw płytkę na stojaku do momentu, aż mieszanina stanie się przezroczysta, a kulki wiążące opadną w postaci pelletu. Po opadnięciu kulek ostrożnie odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając kulek magnetycznych. Alternatywnie, ostrożnie usunąć supernatant pipetą i go odrzucić.Zdejmij płytkę z podstawki magnetycznej. Następnie dodaj 100 µL roztworu do przemywania RNA do każdej studni i potrząśnij płytką przez jedną minutę na wytrząsarku orbitalnej przy umiarkowanej prędkości; kulek nie trzeba całkowicie rozproszyć. Na tym etapie przenieś płytkę na podstawkę magnetyczną.Aby odseparować kuleczki magnetyczne. Ostrożnie odessać nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego, nie poruszając kuleczkami magnetycznymi. Alternatywnie, ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety i go wylać.Po usunięciu supernatantu zdejmij płytkę ze statywu magnetycznego. Powtórz płukanie drugi raz, używając 100 µL roztworu do płukania RNA. Po drugim płukaniu osusz kuleczki, potrząsając płytką przez jedną minutę na wytrząsarce orbitalnej z maksymalną prędkością.Należy pamiętać, aby nie przesuszyć próbek. Eluuj RNA A z kulek, dodając 40 µL podgrzanego buforu do eluowania RNA A. Każdą płytkę z próbkami intensywnie wstrząsaj na wytrząsarce orbitalnej przez trzy minuty. Następnie sprawdź, czy kulki magnetyczne są całkowicie rozproszone.Jeśli nie, kontynuuj mieszanie. Gdy kuleczki magnetyczne zostaną całkowicie rozproszone, przenieś płytkę na stojak magnetyczny, aby przechwycić kuleczki magnetyczne. Nadpłyn zawiera oczyszczony allel aminowy włączony do RNA.Ostrożnie przenieś wyeluowany RNA do nowej płytki PCR lub probówek PCR. Na tym etapie można sprawdzić stężenie RNA w próbkach, mierząc 1,5 µl na spektrofotometrze NanoDrop. Natychmiast przejdź do następnego kroku lub przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób fluorescencyjnego znakowania amplifikowanych próbek RNA z wbudowanymi allelami immunologicznymi do hybrydyzacji mikromacierzy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że druga runda amplifikacji nie jest zalecana. Ze względu na zaobserwowane błędy systematyczne w danych z macierzy, istotne jest również dokładne mieszanie na każdym etapie enzymatycznym, zarówno w przypadku pierwszej, jak i drugiej nici.Synteza cDNA lub etap IVT jest kluczowa dla uzyskania dobrej wydajności amplifikacji, podobnie jak inkubacja każdego etapu enzymatycznego w odpowiedniej temperaturze. Zaleca się stosowanie termocyklera PCR z regulowaną grzaną pokrywą, ponieważ nawet odchylenia rzędu dwóch do trzech stopni podczas transkrypcji in vitro w piecu do hybrydyzacji powietrznej lub w kąpieli wodnej mogą znacząco wpłynąć na wydajność amplifikowanego produktu.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów. Zachęcamy do obejrzenia pozostałych filmów z tej serii, w których pokazujemy, jak przeprowadzić infekcję wirusem vaccinia w zależności od czasu, jak wyekstrahować RNA z próbek oraz jak przygotować i oczyścić RNA znakowane fluorescencyjnie.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zakażenie wirusem ospy prawdziwej i czasowa analiza ekspresji genów wirusa: Część 2

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 1 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 3 opisuje proces znakowania fluorescencyjnego namnożonego RNA z próbek gospodarza i wirusa poprzez sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallilowych. Część 3 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusowych: Część 3

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Wirusy onkolityczne stanowią obiecującą metodę terapeutyczną w leczeniu nowotworów. Zdolność do oceny podatności na zakażenie żywych próbek tkanek pobranych od pacjentów przed rozpoczęciem leczenia jest unikalną zaletą tego podejścia terapeutycznego. Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania tkanek do zakażenia ex vivo wirusem onkolitycznym oraz późniejszą kwantyfikację wirusa.

Ex Vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę syntezy cDNA z RNA po zakażeniu komórek HeLa wirusem vaccinia. Protokół obejmuje izolację RNA, transkrypcję odwrotną i amplifikację do analizy mikromacierzowej ekspresji genów.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Przeglądaj więcej filmów