Name: Homarus Americanus (Amerykański Homarus Amerykański) Rozwarstwienie stomatożołądkowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Naucz się precyzyjnej preparacji stomatożołądkowego układu nerwowego Homarus americanus w celu badań funkcji neuronów w małych obwodach nerwowych. Ta metoda umożliwia izolację kluczowych gangliów i nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować naszej opiekunce naukowej, dr Eve Marder. Badania te były wspierane przez granty National Institute of Health NS17813 dla Eve Marder oraz NS059255 dla A-E T.

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy usunąć żołądek homara z organizmu i przygotować go zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule JoVE (Bierman &amp; Tobin, 2009). Większość opisanych poniżej kroków powinna być wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym.
Część I – Izolacja zwojów komisuralnych
<ol>
<li>Ustaw szalkę tak, aby koniec przedni (przy wargach) był oddalony od Ciebie, a koniec tylny (przy odźwierniku) znajdował się najbliżej Ciebie. </li>
<li>Upewnij się, że żołądek jest przypięty w taki sposób, aby leżał na szalce jak najpłaskiej.<ol>
<li>Przypnij przełyk po obu stronach warg.</li>
<li>W razie potrzeby przesuń pozostałe szpilki umieszczone podczas sekcji ogólnej.</li>
</ol></li>
<li>Usuń skórę podskórną.<ol>
<li>Chwyć skórę podskórną w pobliżu mięśni gm2/gm3, oddziel ją od tych mięśni i delikatnie pociągnij w kierunku przednim.</li>
<li>Oddziel skórę podskórną od leżącego pod nią tłuszczu, przecinając wszelkie połączenia. Zachowaj szczególną ostrożność w okolicy tętnicy centralnej, która otacza kluczową część układu nerwowego żołądkowo-jamowego. Pozostaw skórę podskórną nienaruszoną w promieniu około 0.5 cm od zwoju żołądkowo-jamowego, który znajduje się pomiędzy mięśniami gm1b.</li>
<li>Odetnij oddzieloną skórę podskórną.</li>
</ol></li>
<li>Oddziel mózg od tkanki podłoża.<ol>
<li>Zidentyfikuj dwa duże nerwy komisuralne, które biegną obustronnie z przedniej części mózgu do zwojów komisuralnych w przedniej części żołądka.</li>
<li>Pozostawiając te nerwy nienaruszone, delikatnie unieś mózg pęsetą i przetnij go, aby oddzielić od reszty tkanki. Zachowaj ostrożność podczas tej czynności, ponieważ pod mózgiem znajduje się nerw żołądkowo-jamowy, który musi pozostać nienaruszony.</li>
</ol></li>
<li>Oddziel zwoje komisuralne od otaczającej tkanki.<ol>
<li>Śledź jeden z nerwów komisuralnych aż do jednego ze zwojów komisuralnych.</li>
<li>Zidentyfikuj ion oraz son – nerwy te muszą pozostać nienaruszone. Zwojów komisuralnych będzie odchodzić wiele nerwów. Przetnij większość z nich (z wyjątkiem ion i son), pozostawiając jeden dodatkowy nerw przymocowany, aby utrzymać zwój komisuralny na miejscu do czasu zakończenia sekcji.</li>
<li>Powtórz czynność z drugim zwojem komisuralnym.</li>
</ol></li>
<li>Oczyść ion i son od strony bocznej do przyśrodkowej. Pozostaw nienaruszony nerw wargowy, aby zakotwiczyć układ nerwowy do żołądka. Zwój przełykowy znajduje się w miejscu przecięcia się nerwów ion. Możesz oczyścić obszar pod nim, chwytając dolny nerw komorowy i pociągając go do góry, aby przeciąć tkankę poniżej.</li>
</ol>
Część II – Izolacja zwoju stomatogastrycznego (STG) i pozostałych nerwów.
<ol start="7">
<li>Oddziel STG od otaczającej go tkanki.<ol>
<li>STG znajduje się wewnątrz tętnicy przebiegającej pomiędzy mięśniami gm1b a mięśniami gm2a i b. Należy zlokalizować odcięty koniec tętnicy w pobliżu mięśni gm2a i b.</li>
<li>Przeciągnij odcięty koniec tętnicy do góry i przednio, aby odsłonić dvnKontynuuj podciąganie, aż osiągniesz poziom pozostałej tkanki podskórnej. Po oddzieleniu tętnicę można przyciąć do poziomu, w którym styka się ona z pozostałą tkanką podskórną.</li>
<li>Odciąć płat mięśniowy znajdujący się w rostrum homara.</li>
<li>Unieś skórę właściwą wraz z tkanką podskórną nad tętnicą, zwracając uwagę, że tętnica tworzy tunel w tkance tłuszczowej powyżej zwoju trójdzielnego (STG). Wsuń jedno ramię nożyczek wewnątrz tętnicy i przetnij mięsień znajdujący się nad nią. Sprawdź, czy widzisz dvn podczas cięcia należy upewnić się, że znajduje się bezpiecznie powyżej STG. Kontynuuj cięcie w kierunku przednim, prowadząc je wzdłuż tętnicy. Przecinając tkanki powyżej STG, będziesz w stanie zobaczyć stn biegnące przednio z STG i zagłębiające się w mięsień. Kontynuuj cięcie w kierunku przednim, aby całkowicie oddzielić mięsień powyżej STG.</li>
<li>Usuń wszelkie tkanki z obszaru stn.</li>
</ol></li>
<li>Oddzielić agnz otaczającej tkanki. (Nawet jeśli nie planujesz rejestrować sygnałów z) agn(będziesz potrzebować fragmentu nienaruszonego nerwu, aby unieruchomić zwoj w celu przeprowadzenia rejestracji wewnątrzkomórkowych.)<ol>
<li>Aby lepiej zobaczyć agnusunąć pozostałą skórę właściwą oraz cienką warstwę leżącego pod nią mięśnia.</li>
<li>Tuż za górnym zakrętem skroniowym (STG) należy zidentyfikować ciemny tunel w tkance tłuszczowej i mięśniach po obu stronach dvn.</li>
<li>Wprowadź jedno ostrze nożyczek do wnętrza tunelu i przetnij tkankę powyżej nerwu. Kontynuuj cięcie bocznie, prowadząc je wzdłuż nerwu, aby go wyizolować. (Kilka milimetrów wystarczy do przytwierdzenia zwoju szpilkami, jednak należy odsłonić co najmniej 5 mm AGN jeśli planują Państwo z niego rejestrować sygnały).</li>
<li>Odłącz agn z mięśnia, który unerwia, poprzez przecięcie połączeń.</li>
<li>Powtórz czynność po drugiej stronie, aby wyizolować drugą stronę agn.</li>
<li>Gdy obie AGNPo przeprowadzeniu sekcji należy przeciąć wszystkie mięśnie i tkanki łączące STG z żołądkiem.</li>
</ol></li>
<li>Wyizoluj mvnSą to bilateralna para niewielkich nerwów odgałęziających się od lvN i przechodząc bocznie pod tkanką tłuszczową.<ol>
<li>Użyj nożyczek lub dwóch pęset, aby przeciąć tkankę tłuszczową po jednej stronie dvn, w pobliżu miejsca, w którym rozgałęzia się na dwa lvns. Znajdują się Państwo daleko od mvni nie zaryzykują ich przecięcia.</li>
<li>Podnieś warstwę tłuszczową i zidentyfikuj małe mvn poniżej. Nerwy te przebiegają przyśrodkowo do bocznie, tuż za poziomem mięśni gm1b.</li>
<li>Usuń warstwę tłuszczu znajdującą się nad mvnpozostawiając nerw nienaruszony, aby nie splątał się z innymi tkankami. Jego boczny koniec odetnie się od żołądka na zakończenie sekcji.</li>
<li>Powtórz ten proces po drugiej stronie, aby wyizolować pozostały element mvn.</li>
</ol></li>
<li>Wyizoluj Lvnnerwy przednie i tylne.<ol>
<li>Zaczynając od miejsca, w którym lvnodgałęzia się bocznie od dvn, postępuj zgodnie z lvn poprzez wycięcie tkanki tłuszczowej znajdującej się nad nim. W zależności od preparacji czasami można usunąć całą warstwę tłuszczu nad nerwem.</li>
<li>Kontynuuj ujawnianie Lvn do momentu, w którym psn odgałęzia się.</li>
</ol></li>
<li>Wyizoluj pyn.<ol>
<li>Zlokalizuj pynjest to nerw przebiegający tylnie nad odźwiernikiem.</li>
<li>Usuń cienką błonę pokrywającą ten obszar.</li>
<li>Wyizoluj pyn poprzez wycięcie niewielkiego fragmentu odźwiernika, przymocowanego do pyn.</li>
<li>Ostrożnie unieś odcinek odźwiernika i odetnij tkankę po obu stronach pyn aż do momentu dotarcia do odgałęzienia, które przytwierdza się do pdn.</li>
</ol></li>
<li>Wyizoluj pdn.<ol>
<li>Zlokalizuj pdnjest to nerw przebiegający tylnie w stosunku do mięśnia rozszerzacza odźwiernika.</li>
<li>Wyciąć niewielki fragment mięśnia rozszerzacza odźwiernika, przymocowany do pdn.</li>
<li>Ostrożnie unieś wycinek mięśnia rozszerzacza odźwiernika i odetnij tkankę po obu stronach pdn aż do osiągnięcia odgałęzienia, które przytwierdza się do pyn.</li>
</ol></li>
<li>Wyizoluj część brzuszna Lvn, który łączy pyn i pdn do lvN.<ol>
<li>W trójkątnym punkcie rozgałęzienia, w którym pyn i pdn połącz z brzuszną lvnwyizoluj dowolny niewielki odcinek nerwu odgałęziającego się od brzusznej lvn, takich jak vplnSłużyć to będzie jako uchwyt do pociągnięcia strony brzusznej lvn.</li>
<li>Podnieś uchwyt i odetnij tkankę po obu stronach strony brzusznej lvnpracując w kierunku przednim, aż do momentu, w którym psn odgałęzia się.</li>
</ol></li>
<li>Powtórz kroki 10–13, aby wyizolować lvn oraz nerwy tylne po przeciwnej stronie. </li>
<li>Oddziel układ nerwowy żołądkowo-przełykowy od żołądka.<ol>
<li>Aby całkowicie oddzielić Lvn wyciągnij z żołądka, pociągnij za psn i odciąć wszystkie tkanki oraz nerwy przytwierdzone do lvn i brzuszny lvnz wyjątkiem pdn i pynPowtórz tę procedurę po drugiej stronie.</li>
<li>Odetnij boczny koniec każdego z nich mvnUnieś koniec boczny i odetnij wszelkie zbędne przyczepy między nerwem a leżącą pod nim tkanką żołądka.</li>
<li>Na przednim końcu odetnij wszelkie zbędne połączenia z zwojami komisuralnymi oraz przetnij nerw wargowy po każdej stronie.</li>
<li>Wizualnie obejrzyj układ nerwowy stomatogastryczny, aby zidentyfikować, a następnie odciąć wszelkie dodatkowe połączenia z tkanką żołądka.</li>
<li>Chwyć przednie końce obu nerwów komisuralnych, powyżej zwojów komisuralnych, a następnie odseparuj stomatogastryczny układ nerwowy od żołądka i przesuń go na bok naczynia. Podczas tej czynności przetnij wszelkie pozostałe połączenia, aby całkowicie uwolnić układ nerwowy.</li>
</ol></li>
<li>Przygotuj małą szalkę z Sylgardu.<ol>
<li>Dokładnie potrzyj powierzchnię Sylgardu w małej szalce tkanką żołądka. Zmniejszy to hydrofobowość Sylgardu, dzięki czemu sól fizjologiczna rozprzestrzeni się równomiernie po całej powierzchni szalce.</li>
<li>Opłukać i napełnić naczynie Sylgard schłodzoną solą fizjologiczną.</li>
</ol> </li>
<li>Przenieś układ nerwowy do przygotowanej szalki z Sylgardu, chwytając przednie końce obu nerwów komisuralnych, wyjmując układ nerwowy z dużej szalki i kładąc go w małej szalce. </li>
<li>Ustabilizuj STNS w małym naczyniu, używając kombinacji pinów minuten oraz cieńszych pinów wyciętych z drutu wolframowego.<ol>
<li>Należy upewnić się, że preparat jest ułożony grzbietem do góry, sprawdzając, czy dolny nerw komorowy jest skierowany w stronę przeciwną do Sylgardu.</li>
<li>Usuń mózg i przypnij nerwy komisuralne.</li>
<li>Delikatnie naciągnij układ nerwowy, aby był napięty i płaski, chwytając za każdy z psnod tyłu i z boku, a następnie przypinając je.</li>
<li>Usunąć mięsień rozszerzacza odźwiernika z pdns, a następnie przypnij pdns.</li>
<li>Usunąć segment odźwiernika z pyns, i przypnij pyns.</li>
<li>Ustabilizuj pozostałe odizolowane nerwy, takie jak nerwy wargowe, mvni AGNs.</li>
</ol></li>
<li>Zdejmij osłonkę z STG.<ol>
<li>Należy upewnić się, że STG przylega płasko do Sylgardu i jest napięte przez stabilizatory boczne. AGNs, przedni stn or tylną dvn.</li>
<li>Ustaw oświetlenie w taki sposób, aby umożliwić wizualizację aksonów wewnątrz dvn.</li>
<li>Za pomocą małej szpilki lub cienkiej igły wolframowej wykonaj mały, płytki otwór w osłonce otaczającej dvn, bezpośrednio za zakrętem skroniowym górnym (STG).</li>
<li>Przeciągnij igłę w poprzek dvn, grzbietowo względem aksonów, aby utworzyć poziome nacięcie w osłonce nerwu.</li>
<li>Chwyć płat osłonki nerwu znajdujący się za STG i pociągnij go w kierunku przednim, aby usunąć osłonkę z grzbietowej strony STG.</li>
</ol></li>
</ol> 
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td colspan="2">Skróty:</td>
</tr>
<tr>
<td>STNS</td>
<td>Układ nerwowy stomatogastryczny</td>
</tr>
<tr>
<td>STG</td>
<td>Zwoj stomatogastryczny</td>
</tr>
<tr>
<td>CoG</td>
<td>Zwoj komisuralny</td>
</tr>
<tr>
<td>stn</td>
<td>nerw stomatogastryczny</td>
</tr>
<tr>
<td>mvn</td>
<td>nerw komory przyśrodkowy</td>
</tr>
<tr>
<td>ion</td>
<td>nerw przełykowy dolny</td>
</tr>
<tr>
<td>son</td>
<td>nerw przełykowy górny</td>
</tr>
<tr>
<td>agn</td>
<td>nerw żołądkowy przedni</td>
</tr>
<tr>
<td>dvn</td>
<td>nerw komory grzbietowy</td>
</tr>
<tr>
<td>lvn</td>
<td>nerw komory boczny</td>
</tr>
<tr>
<td>psn</td>
<td>nerw żołądka tylny</td>
</tr>
<tr>
<td>vpln</td>
<td>nerw boczno-tylny brzuszny</td>
</tr>
<tr>
<td>pyn</td>
<td>nerw odźwiernika</td>
</tr>
<tr>
<td>pdn</td>
<td>nerw rozkurczowy odźwiernika</td>
</tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

Anatomia żołądka homara oraz STNS została wcześniej szczegółowo opisana5,6, a warianty tej procedury sekcyjnej były wykorzystywane w licznych badaniach. Zalecamy zapoznanie się z anatomią żołądka5-7 oraz STNS5,8 przed rozpoczęciem sekcji. Taka znajomość zmniejszy ryzyko przypadkowego uszkodzenia nerwów i tkanek.
Aby zachować żywotność preparatu, kluczowe jest utrzymywanie go w niskiej temperaturze. Można to łatwo osiągnąć, wymieniając sól fizjologiczną co 30 min na sól fizjologiczną o temperaturze 4˚C przechowywaną w lodówce. Po zanurzeniu w zimnej soli fizjologicznej izolowany preparat STNS pozostaje żywotny przez wiele godzin. Rejestracje przeprowadzone u pokrewnych Homarus gammarus wykazały stabilną aktywność rytmiczną STG przez 5 dni in vitro9; podobna wytrzymałość została zaobserwowana u H. americanus (pers. obs.).
Do zachowania trwających wzorców ruchowych niezbędny jest sygnał modulujący przekazywany do STG z zwojów komisuralnych. W związku z tym, aby utrzymać prawidłową aktywność rytmiczną, zwoje te oraz nerwy ion, son i stn muszą pozostać nienaruszone. Opisana przez nas dyssekcja zachowuje kilka nerwów ruchowych (zawierających aksony neuronów ruchowych): agn (zawierające aksony żołądkowego młyna (GM)), mvn (zawierające aksony bocznego żołądka (LG) i dolnego serca (IC)), pyn (zawierające aksony neuronów pylorycznych (PY)), pdn (zawierające aksony rozkurczowe pyloryka (PD)) oraz lvn (zawierające aksony bocznego pyloryka (LP), środkowego żołądka (MG), LPG, a także aksony z GM, PD i PY). Poprzez dyssekcję dodatkowych (lub innych) nerwów można rejestrować aksony innych neuronów ruchowych. Każdy indywidualny typ aksonu neuronu ruchowego można zarejestrować osobno, przeprowadzając dyssekcję i rejestrację z nerwu unerwiającego mięsień, do którego rzutuje dany typ neuronu.
Niniejszy preparat może być wykorzystany w różnych badaniach koncentrujących się na funkcjonowaniu układu nerwowego. Aktywność neuronów można rejestrować za pomocą wewnątrzkomórkowych rejestracji elektrodami ostrymi z ciał komórek lub aksonów, bądź poprzez pozakomórkową rejestrację impulsów elektrycznych z nerwów. Wiele kanałów jonowych w neuronach STG zostało częściowo sklonowanych, a poziom mRNA można zmierzyć w ręcznie wyizolowanych ciałach komórek10,11.

<table><tbody><tr><td>Cienki drut wolframowy (średnica 0.001 in.)</td><td>Narzędzie</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>Pociąć na kawałki 1-2mm do wykorzystania jako cienkie piny.</td></tr><tr><td>Pinceta nr 5</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Piny Minuten</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Moria (ostrza 7mm)</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Są to narzędzia najwyższej klasy. Od tego samego producenta dostępne są bardziej ekonomiczne nożyczki sprężynowe.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100x15mm)</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Wypełnić warstwą Sylgard 182 o grubości 2-4mm.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Inne</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do pinów</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Opcjonalnie. Usuwanie osłonki można przeprowadzić przy użyciu samych nożyczek i cienkiej pincety.</td></tr><tr><td>Super cienka pinceta nr 5SF</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Opcjonalnie. Usuwanie osłonki można przeprowadzić nożyczkami lub pinami wyciętymi z cienkiego drutu wolframowego.</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego homarus americanus

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

W celu zrozumienia, w jaki sposób układy nerwowe generują aktywność i reagują na środowisko, neuronaukowcy korzystają z systemów modelowych, które wykazują interesującą ich aktywność oraz są dostępne i podatne na metody eksperymentalne. Układ nerwowy stomatogastryczny (STNS) homara amerykańskiego (Homarus americanus(znany również jako homar amerykański lub homar z Maine) został ustanowiony jako modelowy układ do badania sieci generujących rytm oraz neuromodulacji sieci. STNS składa się z 3 zwojów przednich (2 zwojów komisuralnych i zwoju przełykowego), zawierających neurony modulujące, które rzutują centralnie do zwoju stomatogastrycznego (STG). STG zawiera około 30 neuronów, które tworzą dwie sieci generujące centralne wzorce: sieć pyloryczną i sieć żołądkową, które leżą u podstaw zachowań żywieniowych skorupiaków1,2Choć możliwe jest badanie tego układuin vivo3STNS nadal wykazuje rytmiczną aktywność po izolacjiin vitroFizyczna izolacja STNS w szalce umożliwia łatwy dostęp do somatów w zwojach w celu przeprowadzenia wewnątrzkomórkowych pomiarów elektrofizjologicznych oraz do nerwów STNS w celu przeprowadzenia pomiarów zewnątrzkomórkowych. Izolacja STNS jest procesem dwuetapowym. Pierwszy etap, polegający na wypreparowaniu żołądka z organizmu zwierzęcia, opisany jest w towarzyszącym artykule wideo4W tym artykule wideo zastosowano precyzyjne techniki sekcji w celu wyizolowania STNS z żołądka. Procedura ta pozwala na uzyskanie preparatu układu nerwowego przeznaczonego do rejestracji elektrofizjologicznych.

Opisujemy precyzyjną dyssekcję układu nerwowego stomatogastrycznego z żołądka homara amerykańskiego (Homarus americanus).

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Homarus Americanus

W celu zrozumienia, w jaki sposób układy nerwowe generują aktywność i reagują na środowisko, neuronaukowcy korzystają z systemów modelowych, które wykazują...

Procedurę izolacji somatycznego układu nerwowego żołądka u homara można podzielić na dwie części: sekcję ogólną oraz sekcję precyzyjną. Niniejsze wideo obejmuje precyzyjną sekcję somatycznego układu nerwowego żołądka, w tym zwoju żołądkowo-tłuszczowego, określanego jako STG, oraz zwojów komisuralnych, określanych jako cgs. W zasadzie nerwy i zwoje muszą zostać oddzielone od otaczającej tkanki, zaczynając od izolacji cgs, a następnie izolacji STG. Wynikiem tej procedury jest systematycznie wyizolowany układ nerwowy żołądka, przypięty w szalce, gotowy do wykorzystania w różnych badaniach koncentrujących się na funkcjonowaniu układu nerwowego.Witajcie, jestem Annalise Tobin z laboratorium dr Eve Martyr z wydziału biologii na Uniwersytecie Brandeis. Witajcie, jestem Hillary Burman, również z laboratorium dr Martyr. Dzisiaj zaprezentujemy protokół izolacji somatycznego układu nerwowego żołądka z żołądka homara Homarus americanus, aby pokazać sposób usunięcia żołądka.Zapraszamy do zapoznania się z towarzyszącym protokołem wideo w JoVE. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania funkcji neuronów w małych obwodach neuronalnych odpowiedzialnych za generowanie zachowań rytmicznych. Zacznijmy zatem.Na początek wymagane jest przygotowanie żołądka homara, aby zaprezentować sposób wykonania tej procedury. Patrząc na towarzyszący film Beermana i Tobina, najpierw zorientuj preparat tak, aby koniec przedni (znajdujący się przy wargach) był skierowany od Ciebie, a koniec tylny był skierowany w Twoją stronę. Ta część procedury rozpoczyna się od dokładniejszego przypięcia preparatu.Przytwierdź przełyk szpilkami po obu stronach wargi, a w razie potrzeby przesuń pozostałe szpilki umieszczone podczas sekcji makroskopowej tak, aby żołądek leżał płasko. Następnie usuń tkankę podskórną, chwytając ją najpierw w pobliżu mięśnia gm, dwóch mięśni GM trzy, oddzielając ją od tych mięśni i delikatnie ciągnąc w kierunku przednim. Oddziel tkankę podskórną od leżącego pod nią tłuszczu, przecinając wszelkie połączenia za pomocą nożyczek chirurgicznych wokół tętnicy centralnej, która otacza część somatycznego układu nerwowego żołądka; pozostaw tkankę podskórną nienaruszoną.W promieniu około 0.5 centymetra od somatycznego zwoju żołądkowego, znajdującego się pomiędzy mięśniami GM one B, można teraz odciąć oddzieloną hipodermę. Następnym krokiem jest oddzielenie mózgu od tkanki podścielającej. Należy rozpocząć od zlokalizowania dwóch dużych nerwów komisuralnych, które biegną dwustronnie z przedniej części mózgu do zwojów komisuralnych w przedniej części żołądka.Pozostawiając te nerwy nienaruszone, ostrożnie unieś mózg pęsetą i przetnij go, aby oddzielić go od pozostałej tkanki. Zachowaj ostrożność podczas tej czynności, ponieważ pod mózgiem znajduje się somatyczny nerw żołądkowy, który musi pozostać nienaruszony. Aby oddzielić zwoje komisuralne od otaczającej tkanki, najpierw zlokalizuj je, prowadząc jeden z nerwów komisuralnych do zwoju.Teraz należy zidentyfikować nerwy ION oraz SON. Nerwy te muszą pozostać nienaruszone. Z każdego zwoju komisuralnego odchodzi wiele nerwów.Przetnij większość z nich z wyjątkiem ION i SON. Pozostaw jeden dodatkowy nerw przyczepiony, aby utrzymać zwoje komisuralne na miejscu do czasu zakończenia sekcji. Następnie zlokalizuj i przytnij nerwy z drugiego zwoju komisuralnego w ten sam sposób.Następnie oczyść ION i SON od strony bocznej do przyśrodkowej. Pozostaw nienaruszony nerw wargowy, aby przymocować preparat do żołądka. Zwoj ganglion esophageal znajduje się w miejscu przecięcia iOS.Można oczyścić przestrzeń poniżej, chwytając dolny nerw komorowy i kierując narzędzie ku górze, aby przeciąć tkanki pod nim. Kolejnym krokiem jest oddzielenie STG od otaczających go tkanek. STG znajduje się wewnątrz tętnicy, która biegnie pomiędzy mięśniami GM 1 B a mięśniami GM 2 a B.Zlokalizuj przecięty koniec tętnicy w pobliżu gm. Dwa mięśnie AB odciągnij tętnicę do góry i do wewnątrz, aby odsłonić DVN. Kontynuuj odciąganie do góry aż do pozostałej tkanki podskórnej.Po oddzieleniu tętnicę można przyciąć do poziomu, w którym styka się ona z pozostałą skórą właściwą. Następnie odetnij płat mięśniowy, który znajdował się w rostrum homara. Potem unieś skórę właściwą nad tętnicą.Tętnica tworzy tunel w tkance tłuszczowej powyżej STG. Wprowadź jedno ostrze nożyczek do wnętrza tętnicy i przetnij mięsień znajdujący się nad nią.Podczas cięcia upewnij się, że widzisz DVN, aby zagwarantować bezpieczeństwo zabiegu. Nad STG kontynuuj cięcie w kierunku przednim, prowadząc je wzdłuż tętnicy. Przecinając tkanki powyżej STG, zobaczysz STN odchodzący przednio od STG i zagłębiający się w mięsień.Kontynuuj nacinanie w kierunku przednim, aby całkowicie oddzielić mięsień powyżej STG. Usuń wszelkie tkanki z okolic STN. Teraz możemy przejść do izolacji kilku innych nerwów.Kolejnymi nerwami, które należy oddzielić od otaczającej tkanki, są AGNs. Nawet jeśli nie planujesz rejestracji z AGN, będziesz potrzebować jego fragmentu do unieruchomienia zwoju za pomocą szpilek. Aby lepiej widzieć AGNs, usuń pozostałą skórę właściwą oraz cienką warstwę leżącego pod nią mięśnia bezpośrednio za STG.Należy odnaleźć ciemny tunel w tkance tłuszczowej i mięśniowej po obu stronach trzcionki DVN, wprowadzić jedno ostrze nożyczek do wnętrza tunelu i przeciąć tkankę nad nerwem. Kontynuuj cięcie bocznie wzdłuż nerwu, aby go wyizolować. Kilka milimetrów jest wystarczające do przypięcia zwoju, jednak jeśli planujesz z niego rejestrować sygnały, odsłoń co najmniej pięć milimetrów A GN.Oddziel n. vagus (GN) od unerwianego przez niego mięśnia, przecinając połączenia. Następnie powtórz ten proces po drugiej stronie, aby wyizolować drugi n. vagus (AGN). Po wypreparowaniu obu nerwów vagus, przetnij wszystkie mięśnie i tkanki łączące splot żołądkowo-jelitowy (STG) z żołądkiem. Następnie wyizoluj n. vagus (M vns).Stanowią one bilateralną parę małych nerwów odgałęziających się od LVN i przebiegających bocznie pod tkanką tłuszczową. Należy użyć nożyczek lub dwóch pęset, aby przeciąć tkankę tłuszczową po jednej stronie DVN w pobliżu miejsca, w którym rozdziela się on na dwa LVN. W tym miejscu znajduje się daleko od M VNS, co eliminuje ryzyko ich przecięcia.Odchyl warstwę tłuszczową i odszukaj pod nią mały nerw. MVN przebiega bocznie, tuż za poziomem mięśni GM. Usuń warstwę tłuszczu nad MVN, pozostawiając nerw na razie nienaruszony, aby zapobiec jego zaplątaniu.Na koniec sekcji układu nerwowego należy odciąć jego koniec boczny oraz wszelkie połączenia z M VNS. Powtórz tę procedurę po drugiej stronie, aby wyizolować drugie MVN. Kolejnym etapem izolacji są LVN w nerwach tylnych.Zacznij od zlokalizowania LVN, które odgałęziają się bocznie od DVN. Śledź LVN, nacinając znajdujący się nad nim tłuszcz. W zależności od preparatu, czasami całą warstwę tłuszczu nad nerwem można odciągnąć.Kontynuuj odsłanianie LVN aż do miejsca, w którym odgałęzia się PSN. Następnie zlokalizuj PYN. Jest to nerw biegnący tylnie nad pori.Usuń cienką błonę pokrywającą ten obszar. Wyizoluj PYN, wycinając mały fragment pori przymocowany do osłonki PYN. Następnie ostrożnie unieś wycięty fragment i odcinaj tkankę po obu stronach PYN, aż dotrzesz do odgałęzienia łączącego się z PDN.Przejdź do izolacji nerwu PDNA biegnącego tylnie do mięśnia rozszerzacza źrenicy. Najpierw odetnij niewielki fragment mięśnia rozszerzacza źrenicy przyczepiony do PDN. Następnie delikatnie unieś odcięty fragment mięśnia rozszerzacza źrenicy.Odetnij tkankę po obu stronach PDN, aż dotrzesz do odgałęzienia łączącego się z PYN. Następnie zlokalizuj brzuszny LVN, który łączy PYN i PDN z LVN w trójkątnym punkcie rozgałęzienia, gdzie PYN i PDN łączą się z brzusznym LVN; wyizoluj dowolny niewielki odcinek nerwu odchodzący od brzusznego LVN, taki jak VPLN. Posłuży on jako uchwyt do pociągania za brzuszny LVN poprzez unoszenie uchwytu.Odetnij tkankę po obu stronach brzusznego LVN, kierując się ku przodowi, aż do miejsca, w którym odgałęzia się PSN. W ten sposób pomyślnie wypreparowano nerwy tylne po jednej stronie żołądka. Teraz wyizoluj LVN oraz nerwy tylne po drugiej stronie.Całkowicie oddziel LVN od żołądka. Pociągnij za PSN i przetnij wszystkie tkanki oraz nerwy przytwierdzone do LVN i brzusznej części LVN, z wyjątkiem PDN i PYN. Powtórz ten proces po drugiej stronie.Następnie przetnij boczny koniec każdego nerwu MVN. Unieś boczny koniec i przetnij wszelkie przyczepy do MVN na końcu przednim. Przetnij wszelkie przyczepy do zwojów komisarzy oraz nerw wargowy po każdej stronie.Wizualnie obejrzyj somatyczny układ nerwowy żołądka, aby zidentyfikować, a następnie przeciąć wszelkie dodatkowe przyczepy do tkanki żołądka. Po przecięciu wszystkich połączeń będzie można chwycić przedni koniec obu nerwów commis powyżej zwojów Commis, oddzielić somatyczny układ nerwowy żołądka od żołądka i przesunąć go na bok naczynia. Podczas tej czynności przecinaj wszelkie dodatkowe przyczepy, aby całkowicie uwolnić układ nerwowy.Sekcja została zakończona. Należy rozpocząć od przygotowania szalki agarowej, do której zostanie przypięty układ nerwowy. Dokładnie potrzeć powierzchnię agaru w małej szalce tkanką żołądka.Zmniejszy to hydrofobowość agaru, dzięki czemu roztwór soli fizjologicznej rozłoży się równomiernie po całej szalce. Przepłucz i napełnij szalkę z agarem schłodzoną solą fizjologiczną. Przenieś układ nerwowy do przygotowanej szalki z agarem, chwytając przednie końce obu nerwów komisuralnych.Wyjęcie układu nerwowego z dużej szalki i umieszczenie go w małej szalce. Aby unieruchomić układ nerwowy, należy użyć kombinacji bardzo cienkich szpilek oraz jeszcze cieńszych szpilek. Wykonaj nacięcia z drutu wolframowego, upewniając się, że preparat znajduje się stroną grzbietową do góry, sprawdzając, czy nerw komorowy dolny jest skierowany w stronę przeciwną do syl guard.Następnie należy usunąć mózg i przytwierdzić szpilkami nerwy komisuralne. Delikatnie rozciągnij i rozpłaszcz układ nerwowy, pociągając każdy z PSN w kierunku tylnym i bocznym, a następnie przytwierdź je szpilkami. W kolejnym kroku usuń mięsień rozszerzacza źrenicy (P dilator muscle) z PNS i przytwierdź szpilkami te nerwy.Następnie usuń segment odźwiernikowy z GYN i przytwierdź GYN szpilkami. Na koniec przytwierdź pozostałe izolowane nerwy, takie jak nerwy wargowe, m vns oraz AGNs. Kolejnym krokiem jest odsłonięcie S st.Po pierwsze, należy upewnić się, że S st G przylega płasko do S guard i jest mocno utrzymywany przez boczne AGNs. Przedni STN oraz tylny DVN ustawiają oświetlenie w sposób umożliwiający wizualizację aksonów wewnątrz DVN. Następnie należy użyć małej szpilki lub cienkiej igły wolframowej.Wykonaj mały, płytki otwór w osłonce otaczającej DVN, tuż za STG. Przesuń igłę w poprzek DVN, grzbietowo względem aksonów, aby stworzyć poziomy rozdarcie w osłonce nerwu. Następnie chwyć fragment osłonki nerwu za STG, pociągnij go w kierunku przednim i przetnij, aby usunąć osłonkę z grzbietowej strony STG.Po usunięciu pochewki preparat jest gotowy do eksperymentów, pod warunkiem że jest przechowywany w temperaturze od około 4 do 15°C. Odnotowano, że preparat ten zachowuje stabilność eksperymentalną przez okres do pięciu dni. Nienaruszony układ nerwowy żołądka Sato należy przypiąć szpilkami do szalki Sylgard.Jak pokazano, nerwy powinny być wolne od uszkodzeń i dostępne do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Ciała komórek nienaruszonego STG powinny być widoczne i dostępne do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować somatyczny układ nerwowy żołądka homara Homa Americana.Podczas przeprowadzania tej sekcji ważne jest dokładne zapoznanie się z anatomią, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i nerwów. Kluczowe jest również utrzymywanie preparatu w niskiej temperaturze, w przedziale od 4 do 15°C. Podczas sekcji można to łatwo osiągnąć, wymieniając co pół godziny sól fizjologiczną na chłodną sól fizjologiczną przechowywaną w lodówce w temperaturze 4°C, co zapewni odpowiednie chłodzenie preparatu.Pozostaje żywotne od kilku godzin do kilku dni. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

homarus-americanus-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Homarus Americanus Przecięcie układu nerwowego żołądka

Stomatogastryczny układ nerwowy (STNS) kraba Jonah (C. borealis) może być wykorzystywany w badaniach z zakresu elektrofizjologii, immunohistochemii oraz hodowli komórkowych. Ekstrakcja STNS odbywa się w dwóch etapach: preparacji wstępnej oraz precyzyjnej.

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Cancer Borealis

Opisujemy makroskopową sekcję żołądka homara amerykańskiego (Homarus americanus).

Makroskopowa sekcja żołądka homara, Homarus Americanus

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie, w jaki sposób pierwotne neurony sensoryczne przekazują informacje o ruchach i pozycjach stawów jako informacje proprioceptywne u zwierzęcia. Dodatkowym celem niniejszego raportu jest przedstawienie anatomii preparatu poprzez sekcję i obserwację neuronów pod mikroskopem stereoskopowym.

Organy receptorowe mięśni w odwłoku raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów z zakresu propriocepcji

W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię szybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie w celu analizy szczegółowej aktywności neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba.

Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Testy behawioralne dostarczają potężnych narzędzi do zrozumienia funkcji neuronów. W tym miejscu przedstawiamy kilka protokołów ilościowego określania zachowań żywieniowych drapieżników występujących u modelowego nicienia Pristionchus pacificus i jego krewnych. Dodatkowo udostępniamy metody analizy adaptacji żywieniowych drapieżników, w tym budowy jamy ustnej i zębów.

Badanie drapieżnych zachowań żywieniowych u Pristionchus i innych nicieni

Tutaj prezentujemy protokół minimalnie inwazyjnego chirurgicznego uszkadzania mięśni nieodłącznie związanych z aparatem żywieniowym morskiego Aplysia californica, aby zrozumieć rolę tych mięśni podczas zachowania żywieniowego.

Minimalnie inwazyjna technika zmiany mięśni nieodłącznie związana z odontoforem Aplysia californica

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Naucz się precyzyjnej preparacji stomatożołądkowego układu nerwowego Homarus americanus w celu badań funkcji neuronów w małych obwodach nerwowych. Ta metoda umożliwia izolację kluczowych gangliów i nerwów.

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Homarus Americanus

Przeglądaj więcej filmów