Name: ES pochodzące z komórek nabłonka Cell Cultures (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metodę uzyskiwania prekursorów neuroepitelialnych z komórek ES przy użyciu aktywności indukującej pochodzącej z komórek stromalnych SDIA. Technika ta wspiera badania nad rozwojem nerwowym i inżynierią tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Krok 1 <ol><li> Płyta mitomycyna-C ggrowth hamowanej (10 mg / ml do 2,5 godziny) MS5 komórek przy gęstości 70000 / cm2 żelatyna powlekane (0,01% przez 30 minut) 6 płyt oraz w α-MEM mediów. </li><li> Gdy komórki są związane i tworzą monowarstwy (ponad wzrostu noc), przejdź do SRM. </li><li> Ręcznie izolować kolonie komórek ES z hodowli komórek ES za pomocą strzykawki z igłą 27 G ½. </li><li> Tritrurate kolonii dokładnie z 1 ml końcówka niebieski i płytki w niskiej gęstości na MS5 komórek (zwykle 2-3 kolonie na 6 i płyty). </li></ol> Uwaga: Komórki ES mogą być również pobrane od enzymatycznej propagacji za pomocą kolagenazy lub trypsyny. Krok 2 <ol><li> Wzrost komórek ES na MS5 podajniki do 14-21 dni do rozety zawierających tworzyć kolonie. </li></ol> Uwaga: media często się zmieniają. Rozety są zazwyczaj na zewnętrznych krawędziach kolonii i ich tworzenie może być znacznie większe, gdyby 300-500 ng / ml kubek jest dodawany do SRM (3). W niektórych protokołów zróżnicowanie, SRM mogą być wymieniane z N2-mediów i uzupełnione wzrostu lub innych czynników promowanie specyfikacji komórki (2-5). Krok 3 <ol><li> Wyizolować i wybrać rozety z 27 ½ igły G pod mikroskopem. </li></ol> Uwaga: Należy unikać cięcia i zbieranie MS5 komórki podścieliska. Jeśli kolonie są pakowane z rozetami, można również izolować całej kolonii. Krok 4 <ol><li> Zaaspiruj grup rozety, tritrurate ostrożnie z 1 niebieski ml końcówki, a płyta je poli-L-ornityny (0,001%) i fibronektyny (1 mg / ml) lub lamininy (1 mg / ml) powlekane 6 studni w N2-media zwykle uzupełnione bFGF (20 ng / ml). Rozety będzie reform i rozszerzenia. </li></ol> Uwaga: Aby zwiększyć przeżywalność komórek, można płyty małych klastrów w kropelki w celu zwiększenia gęstości komórek. Ten krok może być modyfikowane poprzez dodanie N2-mediów, dodatkowy wzrost lub inne czynniki promowanie specyfikacji komórki (2-5).

<ol>
	<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).</li><li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations.">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li><li>Sonntag, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin.">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li><li>Ko, J. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous,+stable,+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons.">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li><li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages,+including+dopaminergic+neurons.">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li><li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells.">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts:+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro.">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li><li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li></ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten pokazuje różne etapy w tworzeniu i izolowanie komórki nabłonka nerwowego z ludzkich komórek ES pomocą SDIA. Zastosowanie tej metody jest wieloraki i jest stosowany w wielu protokołów do produkcji określonych neuronów (np. 1, 2, 5-9). Uważa się, że rozety przypominają komórki nerwowe rury z przednim fenotyp (2, 5, 10), a także zawierać neuronowych przodków szczytu (11, 12). Ponadto, zachowują pewien stopień plastyczności, ponieważ mogą one być wzorowane przez szczególne czynniki w określonych warunkach hodowli. Tak więc, SDIA po...

<table><tbody><tr><td>L-glutamina</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout serum replacement</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM nieessentialny roztwór aminokwasów</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12383</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2-A</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07152</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna-C</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0503</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna typu A</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-ornityna</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>roztwór 0,01%</td></tr><tr><td>Laminina</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronaiektyna</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13256</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 mL z igłą 27 1/2 G</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka N2-A</td><td>pożywka</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 + 1% suplementu N2-A</td></tr><tr><td>Pożywka z zamiennikiem surowicy (SRM)</td><td>pożywka</td><td></td><td></td><td>Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement + 1% MEM nieessentialnego roztworu aminokwasów + 2 mM L-glutaminy</td></tr><tr><td>Pożywka &amp;alpha;-MEM</td><td>pożywka</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutaminy + 1% penicyliny/streptomycyny</td></tr><tr><td>MS5</td><td>linia komórkowa</td><td></td><td></td><td>komórki zrębu</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td></td><td></td><td></td><td>do hodowli tkanek</td></tr></tbody></table>

es pochodzące z komórek nabłonka cell cultures

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

Komórek ES mają możliwość różnicowania się komórek ze wszystkich listków zarodkowych, co czyni je atrakcyjnym narzędziem do rozwoju nowych terapii. Ogólnie rzecz biorąc, różnicowania komórek ES następujące pojęcia najpierw wygenerować niedojrzałe komórki progenitorowe, które następnie mogą być propagowane i zróżnicowane w dojrzałych komórek fenotypy. Dotyczy to również ES pochodzące z komórek nerwowych, w którym rozwój komórek nerwowych na dwa główne etapy: po pierwsze, pochodzenie i rozwój niedojrzałych prekursorów nabłonka i drugim, ich różnicowanie się w dojrzałe komórki nerwowe. Powszechną metodą produkcji nerwowych komórek progenitorowych z komórek ES jest oparta na embryoid ciała (EB) formacja, która ujawnia różnicowanie komórek ze wszystkich listków zarodkowych w tym neuroectoderm. Alternatywnych i bardziej efektywna metoda rozwoju komórek nabłonka wywoływać wykorzystuje pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA), które można osiągnąć przez wspólne hodowanie komórek ES z kości czaszki pochodzące ze szpiku komórki podścieliska (1). Zarówno tworzenie EB i SDIA, ujawniają rozwoju struktur rozeta-podobne, które są uważane przypominają cewy nerwowej i / lub grzebienia nerwowego-jak przodkowie. Prekursorów komórek nerwowych mogą być izolowane, rozszerzone i dalsze zróżnicowane w specyficzne neurony i komórki gleju za pomocą określonych warunkach hodowli. Poniżej opiszemy w zakresie wytwarzania i izolacji takich rozet współpracy kultury eksperymenty z linii komórek podścieliska MS5 (2-5).

Wyprowadzenie nabłonka prekursorów z zarodkowych komórek macierzystych (ES) komórki za pochodzące z komórek podścieliska działalności wywołujących (SDIA).

ES pochodzące z komórek nabłonka Cell Cultures

Komórki ES mają potencjał do różnicowania się w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, co czyni je atrakcyjnym narzędziem w opracowywaniu nowych terapii. W ...

es-cell-derived-neuroepithelial-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC). Technika ta polega na mikrodysekcji mieszków włosów wibrysów, izolacji wybrzuszenia (bulge) i umieszczeniu go w hodowli tkankowej. EPI-NCSC zaczynają emigrować z eksplantów wybrzuszenia na podłoże w ciągu 3 - 4 dni.

Hodowle mysich macierzystych komórek grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC)

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj metodę uzyskiwania prekursorów neuroepitelialnych z komórek ES przy użyciu aktywności indukującej pochodzącej z komórek stromalnych SDIA. Technika ta wspiera badania nad rozwojem nerwowym i inżynierią tkanek.

ES pochodzące z komórek nabłonka Cell Cultures

Przeglądaj więcej filmów