Name: Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Naucz się metody wiszącej kropli do obrazowania na żywo zarodków Drosophila. Protokół zapobiega odwodnieniu i hipoksji, zachowując żywotność embrionów podczas długotrwałej akwizycji czasowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Z wdzięcznością potwierdzamy wsparcie udzielone B.H.R. w ramach Discovery Grant, a także Research Tools and Instrument Grant z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Dziękujemy również H. Odzie oraz Bloomington Drosophila Stock Center za udostępnienie linii genetycznych wykorzystanych w przykładowych sekwencjach obrazowania na żywo.

Przygotowanie
<ol>
<li>Zebrać zarodki na standardowych płytkach z agarem z sokiem z winogron4. Wygodne jest użycie automatycznego kolektora jaj Drosophila (Flymax Scientific Equipment Ltd.). Stosowanie zsynchronizowanych zbiorów zarodków w określonych stadiach pozwoli zmniejszyć liczbę koniecznych zabiegów dechorionacji w celu uzyskania odpowiedniej liczby zarodków w pożądanym stadium rozwojowym.</li>
<li>Przygotować szkiełko do dechorionacji, przyklejając kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka przedmiotowego, a następnie zdjąć warstwę ochronną z taśmy.</li>
<li>Przygotować komorę do obrazowania żywych tkanek, wycinając kawałek tkanki pasujący do otworu komory. Umieścić tkankę w otworze i zwilżyć ją wodą destylowaną.</li>
<li>Wymieszać olej halowęglowy (Halocarbon Products Corp.) z serii lepkości 700 i 56 w stosunku 1:1. Mieszaninę można przechowywać i używać bezterminowo.</li>
<li>Nanieść kilka małych kropel oleju halowęglowego na powierzchnię szkiełka nakrywkowego (22 X 40 mm, No. 2). Objętość nie jest krytyczna, ale powinna wynosić około 20-40 µl.</li>
</ol>
Procedura
<ol>
<li>Przy pomocy stereomikroskopu zebrać embriony z płytek z agarem z sokiem z winogron, używając pęsety jubilerskiej (nr 5) lub bardzo cienkiego pędzla. Embriony mają tendencję do przyklejania się do siebie i do końcówek pęsety; łatwo gromadzą się w skupiskach.</li>
<li>Przy pomocy stereomikroskopu delikatnie opuścić skupiska embrionów, które przylgnęły do końcówek pęsety, na powierzchnię taśmy na szkiełku do dechorionacji.</li>
<li>Ponownie używając stereomikroskopu, delikatnie popchnąć lub przesunąć embriony bokiem pęsety, aby przerwać zewnętrzną woskową chorion, nie rozrywając wewnętrznej błony żółtkowej (embrion pęknie, jeśli błona żółtkowa zostanie przerwana).</li>
<li>Po przerwaniu zewnętrznej chorion oddzielić embrion od chorion; zdechorionowany embrion ma tendencję do przylegania do powierzchni pęsety. Należy uważać, aby zdechorionowany embrion nie dotknął powierzchni taśmy.</li>
<li>Natychmiast po zdechorionowaniu embrionu szybko przenieść go do wcześniej przygotowanej kropli oleju halokarbonowego na szkiełku nakrywkowym. Dotknąć końcówką pęsety z zdechorionowanym embrionem powierzchni kropli oleju halokarbonowego – spowoduje to oderwanie embrionu od pęsety i jego przedostanie się do oleju.</li>
<li>Potwierdzić przeniesienie embrionu do kropli oleju. Można to zrobić gołym okiem, pod warunkiem pracy na czarnym tle i zastosowania światłowodowego źródła oświetlenia ustawionego pod kątem ukośnym.</li>
<li>Przed próbą zdechorionowania kolejnego embrionu oczyścić pęsetę z oleju. Pęseta pokryta olejem ma słabszy chwyt na powierzchni chorion, co utrudnia dechorionację.</li>
<li>Zdechorionowane embriony wypływają w oleju halokarbonowym. Używając pęsety lub pędzla i obserwując przez stereomikroskop, docisnąć embrion do dna kropli oleju i ułożyć go w pożądanej pozycji.</li>
<li>Szybko odwrócić szkiełko nakrywkowe nad otworem komory do obrazowania na żywo. Potwierdzić, że embriony spoczywają przy szkiełku nakrywkowym w pożądanej orientacji. Ze względu na wyporność w oleju, embriony będą teraz unosić się przy dolnej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Przymocować szkiełko nakrywkowe do komory do obrazowania na żywo za pomocą taśmy. Przewietrzyć komorę, wycinając otwory w taśmie w obszarze, w którym taśma zasłania szczelinę między końcem szkiełka nakrywkowego a końcem otworu komory do obrazowania na żywo.</li>
<li>Do obrazowania embrionów można teraz użyć prostego mikroskopu fluorescencyjnego lub stereomikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Opisujemy nową metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy obrazowania na żywo, którą nazywamy protokołem kropli wiszącej. Niestety, protokołu kropli wiszącej nie można zastosować w przypadku pracy z mikroskopem odwróconym. W takim przypadku należy zastosować technikę kanapkową (opisaną w powyższym streszczeniu), a kompresja embrionów pozostaje problemem.
W eksperymentach, w których mierzy się kształt i rozmiar komórek w celu obliczenia sił związanych z ruchem morfogenetycznym, prefe...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Standardowy sprzęt i materiały wymagane do przygotowania embrionów do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli obejmują następujące elementy: szkiełka przedmiotowe</td></tr><tr><td>laminki (22 x 40 mm, nr 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>taśma dwustronna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>jubiler&amp;rsquo;pinceta (typ Dumont nr 5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ole halowęglowe serii 56 i serii 700 (Halocarbon Products Corp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nóż introligatorski lub jednostronne ostrze do golenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ręcznik papierowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>woda destylowana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>taśma uniwersalna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta odpowiednia do pobierania objętości 20-40 &amp;mu;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Protokół obrazowania na żywo wymaga również specjalnie wykonanej komory do obrazowania żywych komórek. Przygotowuje się ją poprzez wycięcie z arkusza poliwęglanu o grubości 5 mm kawałka o wymiarach standardowego szkiełka przedmiotowego (75 x 25 mm), a następnie za pomocą freza wykonuje się w nim wgłębienie o głębokości 3 mm (20 x 55 mm). Wymagany jest również dostęp do stereomikroskopu (mikroskopu sekcyjnego) oraz światłowodowego źródła oświetlenia.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie zarodków drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Obrazowanie na żywo w trybie timelapse z wykorzystaniem białka zielonej fluorescencji (GFP) jest potężną techniką badania regulacji genetycznej procesów dynamicznych, takich jak morfogeneza tkanek, adhezja międzykomórkowa czy śmierć komórek. Zarodki *Drosophila* wykazujące ekspresję GFP można łatwo obrazować przy użyciu mikroskopii stereoskopowej lub konfokalnej. Celem każdego protokołu obrazowania na żywo jest zminimalizowanie szkodliwych efektów, takich jak odwodnienie i hipoksja. Poprzednie protokoły przygotowania zarodków *Drosophila* do analizy obrazowania na żywo polegały na umieszczaniu zdechorionowanych zarodków w oleju halokarbonowym i zamykaniu ich pomiędzy przepuszczalną dla gazów membraną halokarbonową a szkiełkiem podstawowym.1-3Wprowadzenie kompresji poprzez montowanie embrionów w ten sposób stanowi niepożądane utrudnienie dla każdej analizy morfogenezy opartej na biomechanice. Nasza metoda, którą nazywamy protokołem wiszącej kropli, zapewnia doskonałą żywotność embrionów podczas obrazowania na żywo i nie wymaga ich kompresji. W skrócie, protokół wiszącej kropli polega na umieszczeniu embrionów w kropli oleju halowęglowego zawieszonej na szkiełku nakrywkowym, które z kolei jest przymocowane nad komorą wilgotną. Oprócz zapewnienia wymiany gazowej i zapobiegania odwodnieniu, układ ten wykorzystuje wyporność embrionów w oleju halowęglowym, aby zapobiec ich przemieszczaniu się podczas akwizycji timelapse. Niniejsze wideo szczegółowo opisuje sposób zbierania i przygotowywania embrionów Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli. Protokół ten jest odpowiedni do obrazowania zdechorionowanych embrionów przy użyciu stereomikroskopii lub dowolnego pionowego złożonego mikroskopu fluorescencyjnego.

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Obrazowanie na żywo w trybie timelapse z wykorzystaniem białka fluorescencyjnego GFP (green fluorescent protein) jest potężną techniką badania regulacji genetycznej procesów dynamicznych, takich jak ...

Witajcie. Nazywam się Bruce Reed. Jestem adiunktem w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Waterloo w Waterloo w prowincji Ontario w Kanadzie. Tworzymy to archiwum wideo, aby udokumentować nową technikę, którą opracowaliśmy w celu przygotowania embrionów ryb z rodzaju *Oryzias* do analizy obrazowania na żywo.Podczas przeprowadzania analizy obrazowania na żywo z wykorzystaniem embrionów drozoldżek często stosujemy akwizycję time-lapse, która może trwać kilka godzin. Dlatego istotne jest zastosowanie techniki, w której embriony są chronione zarówno przed odwodnieniem, jak i hipoksją. Ponadto chcemy opracować metodę, która pozwoliłaby uniknąć jakiegokolwiek ucisku embrionu.W kwestii montowania opracowaliśmy bardzo prostą, tanią i skuteczną metodę, którą nazywamy preparatem w kropli wiszącej. Metoda kropli wiszącej jest odpowiednia do analizy obrazowania na żywo embrionów przy użyciu stereomikroskopu lub dowolnego pionowego mikroskopu złożonego. Ten film time-lapse przedstawia osiem embrionów wykazujących ekspresję GFP, przygotowanych zgodnie z protokołem kropli wiszącej i obrazowanych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii time-lapse.Ta sekwencja obrazowania reprezentuje ponad cztery god

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo przy użyciu protokołu zwisającej kropli

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten film opisuje, jak wykonywać mikrozastrzyki, które dostarczają odczynniki do żywych zarodków Drosophila. Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do wprowadzenia związków egzogennych, takich jak kwasy nukleinowe i białka, we wczesnych stadiach rozwoju zarodka. Przedstawiony protokół pokazuje, jak skonfigurować i wykonać procedurę wstrzykiwania dowolnego rozpuszczalnego odczynnika - w tym przypadku białka fluorescencyjnego do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.

Mikroiniekcja żywych zarodków Drosophila: wczesne dostarczenie odczynników do rozwijającego się zarodka

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Naucz się metody wiszącej kropli do obrazowania na żywo zarodków Drosophila. Protokół zapobiega odwodnieniu i hipoksji, zachowując żywotność embrionów podczas długotrwałej akwizycji czasowej.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Przeglądaj więcej filmów