Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli
13 marca 2009
Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.
Witajcie. Nazywam się Bruce Reed. Jestem adiunktem w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Waterloo w Waterloo w prowincji Ontario w Kanadzie. Tworzymy to archiwum wideo, aby udokumentować nową technikę, którą opracowaliśmy w celu przygotowania embrionów ryb z rodzaju *Oryzias* do analizy obrazowania na żywo.
Podczas przeprowadzania analizy obrazowania na żywo z wykorzystaniem embrionów drozoldżek często stosujemy akwizycję time-lapse, która może trwać kilka godzin. Dlatego istotne jest zastosowanie techniki, w której embriony są chronione zarówno przed odwodnieniem, jak i hipoksją. Ponadto chcemy opracować metodę, która pozwoliłaby uniknąć jakiegokolwiek ucisku embrionu.
W kwestii montowania opracowaliśmy bardzo prostą, tanią i skuteczną metodę, którą nazywamy preparatem w kropli wiszącej. Metoda kropli wiszącej jest odpowiednia do analizy obrazowania na żywo embrionów przy użyciu stereomikroskopu lub dowolnego pionowego mikroskopu złożonego. Ten film time-lapse przedstawia osiem embrionów wykazujących ekspresję GFP, przygotowanych zgodnie z protokołem kropli wiszącej i obrazowanych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii time-lapse.
Ta sekwencja obrazowania reprezentuje ponad cztery godziny czasu rzeczywistego. Początek ruchu wskazuje, że zarodki te są w stanie żywotnym. Przedstawimy teraz szczegółowy, krok po kroku opis tego, jak przeprowadzić protokół wiszącej kropli.
Zarodki zbiera się z płytek z sokiem z winogron, jajkiem lub standardowych płytek. Przy użyciu zautomatyzowanego kolektora jaj dsof FLA firmy Fly max scientific equipment, urządzenie to umożliwia zsynchronizowany zbiór zarodków na określonym etapie rozwoju. W celu przygotowania do ręcznego rozmieszczania zarodków, do szkiełka przedmiotowego przykleja się kawałek dwustronnej taśmy klejącej, a następnie usuwa się jej warstwę ochronną.
Protokół kropli wiszącej wymaga zastosowania specjalnej komory wykonanej z pięciomilimetrowej płyty z poliwęglanu. Płytę wycina się do wymiarów szkiełka przedmiotowego, a za pomocą freza wykonuje się wgłębienie o głębokości 3 mm. Nawilżenie komory do obrazowania na żywo uzyskuje się za pomocą kawałka chusteczki, dociętej do rozmiaru wgłębienia komory i nasączonej wodą destylowaną.
Olej Halo Carbon jest idealny do obrazowania na żywo unieruchomionych embrionów Drosophila, ponieważ jest przepuszczalny dla gazów i optycznie przejrzysty. Zmieszanie olejów Halo Carbon z serii 700 i 56 w stosunku jeden do jednego pozwala uzyskać lepkość odpowiednią do pracy z embrionami Drosophila. Embriony można zbierać z agarowych płytek z sokiem z winogron, używając pęsety jubilerskiej lub bardzo cienkiego pędzla.
Zarodki przywierają do siebie oraz do końcówek pincety. Łatwo gromadzą się w grudkach, tworząc skupiska zarodków. Przywierają do pincety.
Końcówki są delikatnie opuszczane na lepką powierzchnię taśmy na wcześniej przygotowanym szkiełku do dekoracji. Obserwując embriony przez stereomikroskop, należy delikatnie je popchnąć lub przesunąć bokiem pęsety. Należy przerwać koronę, nie rozdzierając przy tym wewnętrznej błony witelińskiej.
Wymaga to pewnej ręki, cierpliwości oraz wprawy. Po przerwaniu zewnętrznej osłonki, zdechlorowany embrion ma tendencję do przyklejania się do pincety. Należy uważać, aby zdechlorowany embrion nie zetknął się z lepką powierzchnią taśmy.
Szybkie wyjęcie go z taśmy może być bardzo trudne, dlatego przeniesiono zdechlorowane embriony do kropelki oleju mineralnego na szkiełku podstawowym. Warto trzymać go w pobliżu, dotykając końcówką pęsety powierzchni kropelki oleju mineralnego.
Przeniesienie zarodka z pęsety do kropli oleju można potwierdzić gołym okiem, wykorzystując czarne tło i źródło światła światłowodowego ustawione pod kątem, przed pobraniem kolejnego zarodka. Warto wytrzeć pęsetę z oleju ze względu na wyporność w oleju halokarbonowym. Koordynowane zarodki unoszą się na powierzchni kropli oleju.
Pozycję i orientację zarodków możemy kontrolować, dociskając je do dna kropli oleju i szybko odwracając szkiełko podstawowe w protokole wiszącej kropli. Odwracamy szkiełko podstawowe nad nawilżanym dołkiem komory do obrazowania na żywo. Po odwróceniu szkiełka zarodki spoczną na jego dolnej powierzchni.
Pozycje spoczynkowe embrionów można sprawdzić pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli nie są one zadowalające, procedurę można powtórzyć. Gdy embriony znajdą się w pożądanej pozycji, szkiełko nakrywkowe należy przymocować do komory do obrazowania na żywo za pomocą taśmy.
Komorę wentyluje się poprzez wykonanie otworów w taśmie. Zarodki są teraz gotowe do obrazowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prostą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy obrazowania na żywo. Protokół ten zapewnia odpowiednią wilgotność i wymianę gazową, zapobiegając jednocześnie kompresji embrionów, co czyni go odpowiednim do obrazowania w oparciu o GFP.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Techniki obrazowania
Wprowadzenie
- Analiza obrazowania na żywo embrionów Drosophila jest powszechnie przeprowadzana z wykorzystaniem akwizycji time-lapse.
- Embriony są podatne na odwodnienie i hipoksję podczas przedłużonych sesji obrazowania.
- Technika zapobiegająca kompresji embrionów jest niezbędna dla zapewnienia dokładnego obrazowania.
- Obrazowanie oparte na GFP wymaga specyficznych warunków w celu uzyskania optymalnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie metody chroniącej embriony Drosophila przed odwodnieniem.
- Zapewnienie odpowiedniej wymiany gazowej podczas obrazowania.
- Uniknięcie kompresji embrionów podczas obrazowania na żywo.
Zastosowane metody
- Przygotowanie embrionów Drosophila do obrazowania na żywo.
- Wdrożenie kontroli wilgotności podczas sesji obrazowania.
- Użycie stereomikroskopu lub prostego mikroskopu złożonego do obrazowania.
- Zastosowanie technik obrazowania opartych na GFP.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie zapewnia utrzymanie wilgotności i wymiany gazowej dla zarodków.
- Zarodki nie są uciskane, co pozwala na uzyskanie lepszej jakości obrazowania.
- Obrazowanie oparte na GFP daje wyraźne wyniki w dłuższych okresach czasu.
- Technika ta jest prosta i kosztowo efektywna dla badaczy.
Wnioski
- Ta metoda poprawia jakość obrazowania na żywo embrionów Drosophila.
- Stanowi ona niezawodne podejście dla badaczy w tej dziedzinie.
- Protokół ten można łatwo zastosować w różnych warunkach laboratoryjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie na żywo organizmów modelowych ma kluczowe znaczenie dla walidacji celów i badań fenotypowych w wczesnych etapach odkrywania leków. Protokół kropli wiszącej eliminuje główne ograniczenia, takie jak odwodnienie, hipoksja i kompresja mechaniczna, które obniżają żywotność embrionów oraz jakość danych podczas przedłużonego obrazowania poklatkowego. Umożliwiając obrazowanie embrionów Drosophila w warunkach fizjologicznych i bez kompresji, metoda ta wspiera mechanistyczną analizę ryzyka interwencji genetycznych i farmakologicznych w skalowalnym i kosztowo efektywnym formacie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie regulacji genetycznej w procesach dynamicznych, takich jak morfogeneza tkanek i adhezja komórek, bez artefaktów mechanicznych wynikających z kompresji.
- Wartość operacyjna: Pozwala na utrzymanie żywotności embrionu przez ponad cztery godziny, co wspiera podłużną obserwację funkcji genów i dynamiki szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z fenotypów indukowanych stresem, zwiększając pewność w testach walidacji celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do obrazowania na żywo w oparciu o GFP, która minimalizuje zmienność środowiskową.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje tanie, łatwo dostępne materiały (olej halokarbonowy, komora z poliwęglanu, taśma), które nadają się do adaptacji w badaniach wysokoprzepustowych.
- Gotowość do analizy: Wykorzystuje wyporność embrionów w oleju w celu utrzymania stabilności pozycji, co redukuje dryf i poprawia spójność sygnału podczas akwizycji time-lapse.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera obrazowanie konserwowanych procesów rozwojowych istotnych dla modeli chorób ludzkich, ułatwiając ekstrapolację międzygatunkową.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia obserwację zachowań komórkowych (np. śmierci komórki, adhezji) w warunkach fizjologicznych, zwiększając pewność prognostyczną dla późniejszych modeli przedklinicznych.
- System istotny dla jednostek chorobowych: Zarodki Drosophila wykazujące ekspresję reporterów GFP związanych z chorobami mogą być wykorzystywane do monitorowania modulacji szlaków in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Protokół kropli wiszącej wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, szczególnie w przypadku testów wymagających dynamicznego obrazowania nieściśniętych reporterów kodowanych genetycznie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji efektów wyciszenia lub nadekspresji genów w morfogenezie embrionalnej.
- Screening: Zapewnia ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty fluorescencji, niezbędne do porównywania efektów działania związków chemicznych lub uwarunkowań genetycznych.
- Analityka: Generuje stabilne, wysokiej jakości dane z obrazowania timelapse, odpowiednie do analizy morfometrycznej i kwantyfikacji fenotypowej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne u Drosophila z konserwatywnymi szlakami sygnałowymi, co pomaga w wyborze celów dla modeli kręgowców.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Prostota i niski koszt protokołu umożliwiają jego szerokie wprowadzenie w różnych zespołach jako ustandaryzowana metoda przygotowania próbek do obrazowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawia pewność predykcyjną poprzez eliminację artefaktów kompresji i utrzymanie warunków fizjologicznych podczas obrazowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej kontroli wilgotności, wymianie gazowej i obsłudze embrionów.
- Wartość strategiczna: Redukuje szum biologiczny w kampaniach przesiewowych, zwiększając czułość testów i zmniejszając odsetek wyników fałszywie dodatnich.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie bardziej wiarygodnych decyzji go/no-go w walidacji celów poprzez dostarczanie danych fenotypowych o wyższej wierności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z zarodkami Drosophila oraz w technikach usuwania chorionu.
- Zależne od dostępu do olejów halocarbonowych i podstawowych narzędzi do mikrofabrykacji w celu przygotowania komory.
- Konieczna jest standaryzacja wieku zarodków, genotypu oraz spójności montażu pomiędzy różnymi użytkownikami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji wyporności w oleju oraz geometrii komory.
- Ograniczenie praktyczne: Metoda najlepiej sprawdza się w przypadku zarodków, które zachowują wyporność w oleju halocarbonowym; nie ma zastosowania do gęstszych lub adhezyjnych typów komórek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
