Name: Rak Borealis Rozwarstwienie stomatożołądkowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 37 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwiania stomatożołądkowego układu nerwowego kraba Cancer borealis w celu przygotowania preparatu do badań elektrofizjologicznych nad funkcją obwodów nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność członkom laboratorium Marder. Dziękujemy naszej mentorce, dr Eve Marder, za wsparcie i zachętę. Badania te były finansowane z grantów NS-17813 oraz NS-058110 przyznanych przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

1. Sekcja makroskopowa
<ol>
	<li>Umieść kraba na lodzie na 30 minut, aby otępić systemy sensoryczne i motoryczne zwierzęcia. Otocz go lodem z każdej strony. Podczas pracy z krabem należy nosić rękawice.</li>
	<li>Przygotuj się do sekcji makroskopowej, rozkładając kuwetę sekcyjną oraz narzędzia, których będziesz używać. Potrzebne będą kleszczyki rongeury, nożyce do kości, małe nożyce, pęseta ząbkowana, szpatułka z zaostrzonym brzegiem, czarna szalka powlekana Sylgardem oraz szpilki entomologiczne.</li>
	<li>Wyjmij kraba z wiadra z lodem, chwytając go za tylną odnóżkę, aby zapobiec uszczypnięciu, i umieść go w kuwecie sekcyjnej.</li>
	<li>Usuń najpierw szczypce, skręcając każde z nich do wewnątrz. Następnie usuń każdą odnóżkę, stosując ten sam ruch obrotowy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków rongeury usuń szczękę (maxilla) zakrywającą otwory gębowe. Usuń również miękką przedszczękę (maxillule).</li>
	<li>Ponownie używając kleszczyków rongeury, zacznij od bocznego tylnego końca pancerza i mocno chwyć jego krawędź. Zaciśnij kleszczyki i odłam ten fragment pancerza. Upewnij się, że usunięto wystarczająco dużo pancerza, aby szpatułka mogła dostać się do otworu. Kontynuuj usuwanie krawędzi pancerza aż do oczu i powtórz czynność po drugiej stronie.</li>
	<li>Zaostrzoną stroną szpatułki delikatnie zeskrob miękką tkankę wewnętrzną z dachu grzbietowego pancerza. Trzymaj szpatułkę w kontakcie z pancerzem, aby uniknąć uszkodzenia STNS. Użyj kleszczyków rongeury, aby odłamać części pancerza, które zostały oddzielone od tkanki. Oddziel również część miękkiej tkanki od brzusznej części pancerza, pamiętając o oddzieleniu wszelkich mięśni przywodzicieli łączących tkankę z pancerzem.</li>
	<li>Odłam pancerz grzbietowy tak daleko w stronę tylną, aż do serca, gdzie z pancerza wystają dwie małe kostki. Tnij tak daleko w stronę przednią, jak to możliwe. Stabilizuj cefalon („twarz”) jednym palcem podczas odłamywania najbardziej przednich części pancerza grzbietowego.</li>
	<li>Na brzusznej stronie pancerza wyciągnij żuwaczki jedna po drugiej, opierając kleszczyki rongeury o żuwaczkę, skręcając je na zewnątrz, aby oderwać żuwaczkę od przymocowanego epistomum i odciągając ją. Jeśli czynność została wykonana prawidłowo, do wyciągniętej żuwaczki powinny być przytwierdzone dwie długie kostki z mięśniami.</li>
	<li>Oddziel tkankę z boków cefalonu w pobliżu oczu za pomocą szpatułki. Małymi nożycami sekcyjnymi przetnij tkankę tak blisko grzebienia kostnego, jak to możliwe, warstwa po warstwie.</li>
	<li>Oprzyj kraba o ściankę kuwety sekcyjnej i podeprzyj go, aby go unieruchomić (do tego celu można wykorzystać szczypce). Odetnij labrum („przednią wargę”) od epistomum, upewniając się, że nie pozostała żadna przytwierdzona tkanka. Używając nożyc do kości, wykonaj dwa skośne cięcia w brzusznej części pancerza, aby usunąć cefalon.</li>
	<li>Chwyć labrum pęsetą ząbkowaną i odetnij labium („tylną wargę”) od kostki po stronie brzusznej. Następnie delikatnie unieś wargę od pozostałej części brzusznego pancerza. Użyj małych nożyc, aby oddzielić brzuszną część żołądka od tkanki wyściełającej pancerz. Gdy ampulle pyloryczne staną się widoczne, odetnij żołądek od tkanki po obu jego stronach, aż żołądek zostanie wyjęty z kraba.</li>
	<li>Wciąż trzymając żołądek za wargę pęsetą, oprzyj go o dłoń i wlej sól fizjologiczną do otworu gębowego. Powoduje to rozszerzenie żołądka i ułatwia jego rozcięcie. Przetnij od otworu gębowego w dół pomiędzy pylorus, bezpośrednio przez kostkę między ampullami. Następnie przetnij ukośnie w dół przez dwa odgałęzienia kardialne. Odetnij wierzchołki trzech zębów wewnątrz żołądka.</li>
	<li>Umieść żołądek na dużej, czarnej szalce powlekanej Sylgardem wnętrzem żołądka do dołu. Przytwierdź pięć rogów preparatu szpilkami entomologicznymi i wypełnij szalkę zimną solą fizjologiczną, zanurzając cały preparat (patrz ryc. 1).</li>
</ol>
2. Precyzyjna sekcja
<ol>
	<li>Do precyzyjnej dysekcji niezbędne są narzędzia do mikrodysekcji. W szczególności wymagane są pęsety i nożyczki sprężynowe, a także uchwyt do pinezek z igłą wolframową. Należy przygotować również przezroczystą szalkę Petriego pokrytą Sylgardem oraz kilka cienkich drucianych pinezek.</li>
	<li>Zacznij od najmniejszego powiększenia, przypinając płaty w pobliżu warg w miejscu, gdzie znajdował się otwór gębowy. Przesuń pozostałe szpilki tak, aby preparat był napięty, i przypnij wszystkie inne niezbędne obszary.</li>
	<li>Ostrożnie unieś nakrapianą skórę podskórną pokrywającą dolną część preparatu i przytnij ją poprzecznie, pozostawiając fragment skóry podskórnej z dwiema białymi kropkami.</li>
	<li>Odsłoń żółtą, włóknistą tkankę błoniastą znajdującą się w dolnej części preparatu. mvns są słabo przytwierdzone do dolnej powierzchni tej tkanki. Ostrożnie oddzielić mvns z żółtej tkanki w miarę jej podciągania. Śledź żółtą tkankę ku górze i wykonaj cięcie wzdłuż mózgu.</li>
	<li>Podążaj za grubymi wypustkami wychodzącymi z mózgu i rozchodzącymi się bocznie. Są to nerwy komisuralne. Po dotarciu do końca nerwu komisuralnego usuń masę gąbczastej, białawej tkanki, która została odcięta z boku mózgu.</li>
	<li>Gdzie jony i synowie znajdź CoGs, odetnij mięśnie i tkankę, aby odsłonić długość jony i synowie.</li>
	<li>Powróć do zaznaczonego fragmentu skóry właściwej i wycięcie go. Powinno to pozostawić otwór w tętnicy otaczającej STG. Przetnij otwór, aby rozdzielić dwa mięśnie flankujące STG. Unieś końce tych mięśni i przetnij obszar bezpośrednio pod nimi, aby oddzielić je od tętnicy i odsłonić alns i aktywne jądra galaktykOddziel mięśnie flankowe tak wysoko, jak to możliwe, aż do chrząstki znajdującej się nad stn.</li>
	<li>Wyciąć tkankę tętniczą otaczającą STG do miejsca, w którym mvns, dgn, i dvn spotkać się. Przesuwać się w dół wzdłuż dvn w kierunku lvns i przeciąć białawą, delikatną tkankę pokrywającą lvns.</li>
	<li>Zlokalizuj psn nad kosteczką słuchową w dolnej części preparatu. Psn można wykorzystać do zlokalizowania lvn i dlvn złącze</li>
	<li>Następnie postępuj zgodnie z dlvn w dół, aby zlokalizować pyn i pdnPrzewód często owija się wokół ampuły odźwiernika w kierunku otworu. pdn odgałęzia się od dlvn i znajduje się pomiędzy ampułą odźwiernika a mięśniami zastawki kardio-pylorycznej. Pozostaw część mięśnia przytwierdzoną do jednego z tych nerwów, ponieważ można je łatwo pomylić podczas przenoszenia preparatu do przezroczystej szalki z Sylgardu.</li>
	<li>Po odsłonięciu wszystkich nerwów należy przeciąć wszelkie pozostałe połączenia między STNS a tkanką oraz niepożądanymi nerwami żołądka. Ostrożnie odsunąć STNS od pozostałej części żołądka, przecinając wszelkie pominięte połączenia.</li>
	<li>Przygotuj przezroczystą szalkę z Sylgardu, pocierając jej powierzchnię pozostałą masą tkanki żołądka, aż powierzchnia Sylgardu przestanie być zbyt lepka lub sucha. Sylgard jest hydrofobowy i w przypadku braku przygotowania szalki w ten sposób, STNS będą silnie do niego przylegać.</li>
	<li>Dodaj do szalki niewielką ilość zimnego roztworu soli fizjologicznej. Chwyć pęsetą górne końce nerwów komisuralnych i przenieś STNS do przezroczystej szalki z Sylgardu.</li>
	<li>Przymocuj STNS do Sylgardu. Oddziel mózg od nerwów komisuralnych, a następnie za pomocą pinów minuten najpierw unieruchom cztery końce CoG. Upewnij się, że preparat jest skierowany stroną górną do góry, sprawdzając, czy ivn jest skierowany w górę, z dala od Sylgardu. dgn powinno wychodzić nieco poniżej STG, gdy STG znajduje się w pozycji prawidłowej. Pozostałe końce nerwu przypnij za pomocą cienkich pinów drucianych.</li>
	<li>Usuń wszelkie pozostałości mięśni lub tkanki z STNS.</li>
	<li>Zdejmij osłonkę z STG, używając uchwytu do pinezek oraz lekko zagiętej, cienkiej igły wolframowej. Wykonaj mały otwór w narożniku osłonki STG, z dala od ciał komórek, i wykorzystaj go, aby przedostać się między warstwy osłonki. Ostrożnie wytnij płat oddzielonej osłonki, aby odsłonić neuropil i ciała komórek STG.</li>
	<li>Przypnij wszelkie klapy osłonki, aby zwiększyć dostęp do ciał komórkowych oraz ustabilizować STG do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Ponownie przypnij pozostałą część STNS, upewniając się, że każdy nerw jest napięty i odpowiednio rozmieszczony do rejestracji zewnątrzkomórkowej (patrz ryc. 3).</li>
</ol>
3. Wyniki
<ol>
	<li>W idealnym przypadku wszystkie nerwy powinny być wolne od nacięć i uszkodzeń, w szczególności te, z których będą pobierane zapisy. Żaden z nerwów nie powinien być zaplątany ani skręcony. STG powinno być nienaruszone, a wszystkie komórki powinny być rozmieszczone w formacji „brody” wokół neuropilu. Nienaruszony STNS jest symetryczny dwustronnie i przypomina homunkulusa, w którym lvns stanowią nogi, mvns ramiona, a koniec przedni głowę.</li>
</ol>
Skróty:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>STNS</td>
			<td>Stomatogastryczny układ nerwowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STG</td>
			<td>Zwoj stomatogastryczny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Środek ciężkości</td>
			<td>Zwoj komisuralny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG</td>
			<td>Zwoje przełykowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mvn</td>
			<td>Środkowy nerw komorowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jon</td>
			<td>Dolny nerw przełykowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syn</td>
			<td>Górny nerw przełykowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGN</td>
			<td>Przedni nerw żołądkowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aln</td>
			<td>Nerw boczny przedni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dgn</td>
			<td>Grzbietowy nerw żołądkowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dvn</td>
			<td>Grzbietowy nerw komorowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lvn</td>
			<td>Nerw komory bocznej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psn</td>
			<td>Tylny nerw żołądka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyn</td>
			<td>Nerw odźwiernikowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pdn</td>
			<td>Nerw rozszerzający odźwiernik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dlvn</td>
			<td>Gałąź grzbietowa nerwu komory bocznej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ivn</td>
			<td>Dolny nerw komorowy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<img alt="Schemat sekcji układu nerwowego skorupiaka, przedstawiający drogi i połączenia nerwowe." src="/files/ftp_upload/1207/1207fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rycina 1: Schemat ilustrujący przybliżone rozmieszczenie STNS w żołądku przed sekcją.
<img alt="Schemat mięśni żołądkowych i odynowca skorupiaka; grupy mięśni oznaczone skrótami anatomicznymi." src="/files/ftp_upload/1207/1207fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rysunek 2: Schemat różnych mięśni w dolnej części żołądka oraz nałożona warstwa STNS w jasnozielonym kolorze. Każdy typ komórki w STG jest wymieniony wraz z mięśniami, które według stanu wiedzy unerwia. Mapa ta jest pomocna podczas planowania sekcji nerwu, który przenosi sygnał z danej komórki ( courtesy of the Nadim lab).
<img alt="Schemat rejestracji neuronalnej; wewnątrzkomórkowe ciało komórki, zewnątrzkomórkowe rejestracje nerwowe w układzie STG." src="/files/ftp_upload/old/1207_2009_1_12_5/figure_3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schematyczny rysunek STNS z elektrodami wewnątrzkomórkowymi i studniami zewnątrzkomórkowymi (za Marder i Bucher, 2007).

<ol><li>Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris-Warrick%2C+RM+%22Dynamic+Biological+Networks%3A+The+stomatogastric+nervous+system%22">Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system</a>. , MIT Press. Boston. (1992).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+Americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).</li>
<li>Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stomatogastric+Nervous+System%3A+Structure+and+function+of+a+small+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network.</a> Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).</li>
</ol>

Disekcja STNS jest pierwszym krokiem w przeprowadzaniu eksperymentu z zakresu elektrofizjologii lub immunohistochemii, a także w pozyskiwaniu komórek do hodowli komórkowych. Niezależnie od planowanego eksperymentu, dyssekcja makroskopowa pozostaje bez zmian, natomiast dyssekcja precyzyjna może się różnić. Ważne jest, aby z wyprzedzeniem zaplanować, z których komórek i nerwów będą pobierane pomiary. Większość neuronów w STG posiada wypustki unerwiające przynajmniej jeden mięsień w żołądku (patrz ryc. 2) i są one klasyfiko...

<table><tbody><tr><td>Czarny Sylgard 170</td><td>Inne</td><td>Dow Corning</td><td>170</td><td>Sekcja makroskopowa</td></tr><tr><td>Nożyczki precyzyjne</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne rozmiar 6</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-65</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-17</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Chirurgia</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>15 V 4313</td><td></td></tr><tr><td>Kuszczyki</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta tkankowa</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>Cienki drut wolframowy (średnica 0.001 in.)</td><td>Chirurgia</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>Sekcja precyzyjna</td></tr><tr><td>Pinceta nr 5</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minuten</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Moria (ostrza 7 mm)</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td></td></tr><tr><td>Szkło Petriego (100x15 mm)</td><td>Inne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do szpilek</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta super precyzyjna nr 5SF</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Inne</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Chirurgia</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Mikroskop</td><td>Wild</td><td>MC3</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Krab borealis (&lt;em&gt;C. borealis&lt;/em&gt;)</td><td>Zwierzę</td><td>Commercial Lobster</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego cancer borealis

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Zwoj stomatogastryczny (STG) stanowi doskonały model do badania interakcji komórkowych i sieciowych, ponieważ składa się z relatywnie niewielkiej liczby komórek (około 25 u C. borealis), które są dobrze scharakteryzowane. Komórki w STG wykazują szeroki zakres sygnałów wyjściowych i odpowiadają za czynności motoryczne żołądka. Żołądek zawiera młyn żołądkowy, który rozdrabnia pokarm za pomocą trzech wewnętrznych zębów, oraz odźwiernik, który filtruje pokarm przed jego przedostaniem się do jelita środkowego. STG generuje dwa rytmiczne sygnały wyjściowe sterujące młynem żołądkowym i odźwiernikiem, znane jako centralne generatory wzorców (CPG). Każda komórka w STG może uczestniczyć w jednym lub obu tych rytmach. CPG umożliwiają badanie neuromodulacji, homeostazy, zmienności komórkowej i sieciowej, rozwoju sieci oraz regeneracji sieci.
Disekcję stomatogastrycznego układu nerwowego (STNS) kraba borealis (Cancer borealis) przeprowadza się w dwóch etapach: dyssekcji ogólnej oraz precyzyjnej. Podczas dyssekcji ogólnej z kraba wycina się cały żołądek. W trakcie dyssekcji precyzyjnej STNS jest wyodrębniany z żołądka przy użyciu mikroskopu stereoskopowego oraz narzędzi do mikrodyssekcji (patrz ryc. 1). STNS obejmuje STG, zwoj przełykowy (OG) oraz zwoje komisuralne (CoG), a także nerwy unerwiające mięśnie żołądka. W niniejszej procedurze pokazujemy, jak przeprowadzić pełną dyssekcję STNS w celu przygotowania do eksperymentu elektrofizjologicznego, w którym rejestrowana będzie aktywność wewnątrzkomórkowa komórek STG, a nerwy obwodowe posłużą do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Przedstawiono właściwą technikę lokalizacji poszczególnych nerwów oraz metodę usuwania osłonki zwoju w celu odsłonięcia somat i neuropila.

Stomatogastryczny układ nerwowy (STNS) kraba Jonah (C. borealis) może być wykorzystywany w badaniach z zakresu elektrofizjologii, immunohistochemii oraz hodowli komórkowych. Ekstrakcja STNS odbywa się w dwóch etapach: preparacji wstępnej oraz precyzyjnej.

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Cancer Borealis

Zwoj stomatogastryczny (STG) stanowi doskonały model do badania interakcji komórkowych i sieciowych, ponieważ zawiera stosunkowo niewielką liczbę...

Procedura ta rozpoczyna się od makroskopowej sekcji żołądka kraba, podczas której usuwa się wyrostki oraz grzbietową część nadgarstka. Cały żołądek zostaje wypreparowany z organizmu zwierzęcia. Żołądek jest następnie rozcinany i przypinany na płasko do czarnego naczynia sardynowego.W ramach przygotowania do precyzyjnej sekcji, układ nerwowy żołądka Steamatic zostaje wypreparowany z żołądka i przeniesiony do przezroczystej szalki Petriego powleczonej Sard, gdzie zostaje odsłonięty z osłonki w celu przygotowania do eksperymentu z zakresu elektrofizjologii. Cześć, nazywam się Rachel Au z laboratorium Martyr na Uniwersytecie Brandeis. A ja jestem Gabrielle Gutierrez, również z laboratorium Martyr.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wypreparowania somatycznego układu nerwowego żołądka u kraba Cancer borealis. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten układ nerwowy do badań z zakresu elektrofizjologii, immunohistochemii oraz hodowli komórkowych. Dzięki tej sieci neuronowej możemy badać kilka fundamentalnych zasad neurobiologii, takich jak homeostaza neuromodulacyjna, zmienność sieci, rozwój sieci oraz regeneracja sieci.Zacznijmy zatem. Przed przystąpieniem do sekcji kraba należy znieczulić, zakopując go w lodzie na 30 minut. Należy upewnić się, że zwierzę jest z każdej strony otoczone lodem.Lód upośledza systemy sensoryczne i motoryczne kraba, jednak zwierzę może nadal reagować po jego usunięciu w trakcie schładzania. Przed rozpoczęciem należy przygotować się do sekcji anatomicznej, gromadząc sprzęt wymagany do tej części protokołu: kuwetę do sekcji, szczypce, nożyczki do wycinania kości, małe nożyczki, pęsetę stomatologiczną, szpatułkę z zaostrzonym brzegiem, czarną płytkę z powłoką silikonową oraz szpilki entomologiczne.Przygotuj się, zakładając rękawiczki. Po upływie 30 minut wyjmij kraba z wiaderka z lodem, chwytając go za odnóże chodne. Aby uniknąć uszczypnięcia i umożliwić umieszczenie zwierzęcia w kuwecie sekcyjnej, najpierw usuń szczypce, skręcając każde z nich do wewnątrz.Następnie usuń każdą odnóżkę, stosując ten sam ruch obrotowy. Gdy zwierzę nie posiada już wyrostków, użyj kleszczy Ron Jos, aby usunąć szczękę zakrywającą otwór gębowy oraz miękką część szczęki. Ponownie używając kleszczy Ron Jos, zacznij od bocznego końca tylnego odcinka nadgarstka (carpus) i mocno chwyć jego krawędź. Zaciśnij kleszcze Ron Jos i odłam ten fragment nadgarstka.Należy upewnić się, że usunięto wystarczającą część nadgarstka, aby szpatułka mogła wniknąć do otworu. Kontynuuj usuwanie krawędzi nadgarstka aż do oczu i powtórz czynność po drugiej stronie. Używając zwężonej strony szpatułki, delikatnie zeskrob miękką tkankę wewnętrzną z górnej części grzbietowej strony nadgarstka.Podczas wykonywania tej czynności utrzymuj szpachelkę w kontakcie z carusem. Aby uniknąć uszkodzenia STNS, użyj Ron Jos do odłamania części carusa, które oddzieliły się od tkanki. Odłam grzbietowy carus do miejsca, w którym z carusa wystają dwa małe S.Wykonaj cięcie tak przednio, jak to możliwe. Stabilizuj cephalon jednym palcem, odłamując najbardziej przednie części grzbietowego carus. Oddziel część tkanek miękkich od brzusznego carus.Należy upewnić się, że wszystkie mięśnie przywodziciele mocujące tkankę do carusu po stronie brzusznej carusu zostały oddzielone. Wyciągaj żuwaczki po jednej, zakotwiczając szczypce na żuwaczce, obracając je na zewnątrz i pociągając; do wyciągniętej żuwaczki powinny być przytwierdzone dwie długie przeszkody z mięśniami. Jeśli czynność zostanie wykonana prawidłowo, tkanka zostanie oddzielona od boków cephalonu w pobliżu oczu.Używając szpatułki i małych nożyczek sekcyjnych, wycinaj tkankę warstwa po warstwie w poprzek, tuż przy krawędzi kostki słuchowej. Oprzyj pozostałą część kraba o kuwetę sekcyjną. Używając oddzielonych szczypiec, oddziel całą wargę górną od epigastrium.Za pomocą małych nożyczek do cięcia kości wykonaj dwa ukośne nacięcia w obrębie brzusznej części nadgarstka. Aby usunąć cefalon, chwyć wargę górną pęsetą z ząbkami i odetnij wargę dolną od otworów po stronie brzusznej. Delikatnie unieś wargę od pozostałej części brzusznej carus.Za pomocą małych nożyczek oddziel brzuszną część żołądka od tkanki wyścielającej carus. Gdy kaniule pori staną się widoczne, wytnij żołądek z otaczających go tkanek z obu stron, aż do całkowitego usunięcia go z kraba, trzymając żołądek za wargę pęsetą. Oprzyj żołądek o dłoń i wlej sól fizjologiczną do otworu gębowego.Dzięki temu żołądek rozszerzy się, co ułatwi jego rozcięcie za pomocą małych nożyczek. Przetnij od otworu gęby w dół pomiędzy ula, przechodząc bezpośrednio przez przeszkodę. Następnie wykonaj cięcie ukośnie w dół przez dwie gałęzie cardio.Na koniec odetnij końcówki trzech zębów znajdujących się wewnątrz żołądka. Umieść żołądek stroną wewnętrzną do dołu na szalce pokrytej czarnym woskiem, aby przygotować go do precyzyjnej dysekcji. Przymocuj pięć narożników żołądka za pomocą szpilek entomologicznych i zanurz preparat w zimnej soli fizjologicznej.Precyzyjna sekcja jest przeprowadzana pod stereomikroskopem i wymaga użycia pęsety i nożyczek sprężynowych, a także uchwytu do szpilek z igłą wolframową. Należy wcześniej przygotować szalkę Petriego z przezroczystą osłoną silikonową oraz kilka cienkich szpilek drucianych. Rozpoczynając od najmniejszego powiększenia, należy przypiąć zakładki w pobliżu wargi, która wcześniej stanowiła otwór gębowy. Następnie należy odpowiednio naciągnąć preparat, reorganizując i dodając szpilki w miarę potrzeb.Za pomocą pęsety ostrożnie unieś nakrapianą skórę podskórną pokrywającą dolną część preparatu i przytnij ją poprzecznie. Powinna pozostać niewielka część skóry podskórnej z dwiema białymi kropkami. Następnie odwarstw żółtą, włóknistą tkankę błoniastą znajdującą się przy dolnej krawędzi preparatu. M vns są słabo przytwierdzone do dolnej strony tej tkanki.Używając ostrza nożyczek, ostrożnie oddziel M VNS od żółtej tkanki podczas jej podciągania. Wycięcie żółtą tkankę wzdłuż kilku widocznych grubych białych wyrostków mózgu. Większość mózgu jest obecnie zagłębiona w tkance.Śledź procesy rozciągające się bocznie i w kierunku wargi. Są to dwa nerwy komisuralne. Po odnalezieniu końca nerwu komisuralnego usuń masywną, gąbczastą, złamanobiałą tkankę, która została odcięta z boku mózgu.Zlokalizuj nerwy iOS i sos w miejscu ich połączenia z zwojami komisuralnymi (commis ganglia). Odetnij mięśnie i tkankę, aby odsłonić przebieg nerwów IO ns i so ns; oba te nerwy biegną przyśrodkowo od zwojów komisuralnych i łączą się z nerwem przełykowym. Wróć do zaznaczonego fragmentu skóry i odetnij go.Powinno to pozostawić otwór w tętnicy otaczającej STG. Przetnij tkankę przez ten otwór, aby rozdzielić dwa mięśnie flankujące STG. Unieś końce tych mięśni i przetnij je od spodu, aby oddzielić je od tętnicy. Ten krok odsłania ALNs.Usuń mięśnie boczne aż do linii chrząstki nad STN. TN to nerw biegnący w górę od STG, który posiada niewielkie wybrzuszenie. Następnie wycięcie tkankę tętniczą otaczającą STG w dół, aż do miejsca, w którym M vns DGN i DVN się łączą.Podążaj za DVN aż do miejsca, w którym rozdziela się on na dwa LVN. Przecinaj białawą, delikatną tkankę, aż każdy LVN zostanie całkowicie odsłonięty i połączy się z DLVN. Zlokalizuj PSN nad Osco.W pobliżu dolnej części preparatu PSN można wykorzystać do zlokalizowania połączenia LVN i DLVN. Zatem DV DLV biegnie w tę stronę. Schodzi tutaj. Tak.Następnie rozdziela się i idzie w tę stronę. Właśnie. Zazwyczaj to, co robię, to znajduję je tutaj na dole i stopniowo przesuwam się w górę. PDN odgałęzia się od DLVN i znajduje się pomiędzy ULA a mięśniami zastawki cardio Pylori. Tak. Tutaj jest ampule ula, ula ampule, P, PYN tutaj.Należy pozostawić fragment mięśnia przyczepiony do jednego z tych nerwów, aby służył jako znacznik umożliwiający ich rozróżnienie. Po odsłonięciu wszystkich nerwów należy przeciąć wszelkie pozostałe połączenia między STNS a żołądkiem. Na koniec ostrożnie odsunąć STNS od pozostałej części żołądka.Odcięcie wszelkich pominiętych połączeń. Przygotuj przezroczystą szalkę S guard, pocierając o nią fragment tkanki żołądka, aż stanie się wilgotna i mniej lepka. STNS będą mocno przylegać do szalki.Jeśli szalka nie została w ten sposób przygotowana, należy dodać do niej świeży, zimny roztwór soli fizjologicznej. Za pomocą pincety chwyć górne końce nerwów komisuralnych i przenieś st NS do czystej szalki Soga. Mózg powinien pozostać przyczepiony do nerwów komisuralnych, aby zapobiec ich splątaniu.Następnie przygotuj STNS do przypięcia, oddzielając mózg od nerwów Commis. Użyj szpilek minuchina, aby przymocować cztery końce nerwów Commis do osłony progu. Upewnij się, że preparat jest skierowany stroną górną do góry, sprawdzając, czy IVN jest skierowany w górę, a DGN wychodzi nieco poniżej szpilki STG.Pozostałą część nerwu odcinamy za pomocą cienkich pinset i nożyczek. Należy starannie oczyścić STNS z wszelkich pozostałości mięśni lub tkanek. Następnie, używając uchwytu do pinset i lekko zagiętej, cienkiej igły wolframowej, należy zdjąć osłonkę z STG.Wykonaj niewielki otwór w narożniku osłonki STG, z dala od ciał komórkowych. Delikatnie wprowadź igłę wolframową do otworu, umieszczając ją pomiędzy osłonką a Samarą. Odetnij lub delikatnie oderwij fragment oddzielonej osłonki, aby odsłonić neuropill STG oraz ciała komórkowe.Przypnij wszelkie klapy osłonki, aby zwiększyć dostęp do ciał komórkowych i ustabilizować STG do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Naciągnij pozostałą część STNS, upewniając się, że każdy nerw jest napięty i odpowiednio rozmieszczony do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Idealnie wszystkie nerwy powinny być wolne od zagięć i uszkodzeń, w szczególności te, z których będą prowadzone pomiary.Żaden z nerwów nie powinien być splątany ani skręcony. STG powinno być nienaruszone, a wszystkie jego komórki powinny być ułożone w formację przypominającą brodę wokół dzioba NI. TNS wykazuje symetrię dwustronną i przypomina homunkulusa, w którym LVN stanowią nogi.M vns to ramiona, a koniec przedni to głowa. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić sekcję somatycznego układu nerwowego żołądka kraba w ramach przygotowania do eksperymentu z elektrofizjologii. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wypreparować nerwy, z których planuje się rejestrację, podążając wzdłuż wybranych nerwów do mięśni, które są przez nie unerwione.Upewnij się, że STNS jest mocno naciągnięty i przytwierdzony do przezroczystej szalki typu „cigar dish”, tak aby odsłonięta strona STG była skierowana do góry. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

cancer-borealis-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cancer Borealis Sekcja nerwowa żołądkowo-jamista

Opisujemy precyzyjną dyssekcję układu nerwowego stomatogastrycznego z żołądka homara amerykańskiego (Homarus americanus).

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Homarus Americanus

Opisujemy makroskopową sekcję żołądka homara amerykańskiego (Homarus americanus).

Makroskopowa sekcja żołądka homara, Homarus Americanus

Współpraca między aktywowanym onkogenem, takim jak RASV12, a mutacjami w genach polaryzacji komórek, takimi jak bazgroły, powoduje wzrost guza u Drosophila, gdzie komórki nowotworowe również wykazują inwazyjne zachowania. W tym miejscu przedstawiono prosty protokół indukcji i obserwacji nowotworów łagodnych i inwazyjnych.

Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Ten artykuł wideo pokazuje zastosowanie modelu zwojów korzenia grzbietowego (DRG)/komórek rakowych w gruczolakoraku przewodowym trzustki.

In vitro Modelowanie nowotworowej inwazji neuronalnej: model zwoju korzenia grzbietowego

Inwazja okołonerwowa (PNI) jest powszechną cechą raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), powodując niższe wskaźniki przeżycia. Jego mechanizmy są słabo poznane. Wykorzystując neuryty generowane z mysich zwojów korzenia grzbietowego ograniczonych do półstałej matrycy, można badać szlaki zaangażowane w PNI linii komórkowych HNSCC.

Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Tutaj prezentujemy protokół minimalnie inwazyjnego chirurgicznego uszkadzania mięśni nieodłącznie związanych z aparatem żywieniowym morskiego Aplysia californica, aby zrozumieć rolę tych mięśni podczas zachowania żywieniowego.

Minimalnie inwazyjna technika zmiany mięśni nieodłącznie związana z odontoforem Aplysia californica

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Obecny protokół opisuje mysi model ablacji unerwienia adrenergicznego poprzez identyfikację i resekcję górnego zwoju szyjnego.

Technika chirurgiczna dla górnej ganglionektomii szyjki macicy w modelu mysim

Poznaj metodę rozwarstwiania stomatożołądkowego układu nerwowego kraba Cancer borealis w celu przygotowania preparatu do badań elektrofizjologicznych nad funkcją obwodów nerwowych.

Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Cancer Borealis

Przeglądaj więcej filmów