Name: Gene-gun Transfekcja Neurony hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj protokół izolacji hipokampa z mózgu przy użyciu clean slicer stage i transfekcję genową metodą gene gun. Technika ta umożliwia precyzyjne badania neuronów w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

gene-gun transfekcja neurony hipokampa

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfekcja Neurony hipokampa

Witaj, jestem Kma. Pracuję w Case Lab na Uniwersytecie Brown. Etap czystego krojenia z 70% ethanol. Umieść wkład płytki w sześciu.Wypełnić studzienkę płytki pożywką i inkubować w temperaturze 37 °C. Za pomocą pęsety chwycić cały mózg pomiędzy śródmózgiem a czwartą częścią mózgu. Wyizolować hipokamp z jednej strony, a następnie wyizolować hipokamp z drugiej strony. Umieścić hipokampy w kropli PBS.Odssać PBS i wykonać przekroje strzałkowe za pomocą slicera do tkanek. Powtórzyć przeniesienie slicerów na szkiełko przedmiotowe, delikatnie przemywając przekroje poprzez dodawanie i odsysanie PBS oraz medium. Rozdzielić przekroje za pomocą pęsety.Przemyj skrawki w PBS i pożywce. Ponownie przenieś skrawki na płytkę i włóż ją do urządzenia. Odessaj pożywkę ze skrawków za pomocą pęsety.Podłącz wąż gene gun do butli z helem. Przymocuj lufę do gene gun. Wypełnij magazynek pociskami.Włóż magazynek do pistoletu Jing. Dostosuj ciśnienie w zbiorniku z helem. Nanieś kulki powlekane EGFP na skrawki.A teraz.

gene-gun-transfection-of-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę przygotowania złotych mikrocząsteczek (tzw. „bullets”) powlekanych DNA oraz demonstrujemy wykorzystanie tych cząsteczek do biolistycznej transfekcji neuronów w hodowanych plastrach hipokampa.

Przygotowanie mikropocisków do armatki genowej oraz transfekcja biolistyczna neuronów w kulturze plastrów tkankowych

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Źródło: Keener, D. G., et al. Elektroporacja pojedynczych komórek w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących. J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje proces elektroporacji pojedynczej komórki w celu wprowadzenia plazmidowego DNA do neuronów w hodowlach plastrów hipokampa myszy. Procedura obejmuje precyzyjne pozycjonowanie pipety, regulację ciśnienia i impulsy elektroporacyjne w celu przejściowej...

Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Wytrącanie fosforanu wapnia jest wygodną i ekonomiczną metodą transfekcji hodowanych komórek. Dzięki optymalizacji możliwe jest zastosowanie tej metody na trudnych do transfekcji komórkach, takich jak neurony pierwotne. Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół transfekcji fosforanu wapnia neuronów hipokampa hodowanych wspólnie z komórkami astrogleju.

Transfekcja fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa

Ostatnie ulepszenia w organotypowych preparatach do wycinania mózgu pozwoliły na ich wykorzystanie do zastosowań biotechnologicznych. Plastry organotypowe zachowują lokalne cechy strukturalne biologii in vivo, w tym funkcjonalne połączenia synaptyczne. Tutaj przedstawiamy regioselektywną biolistyczną metodę dostarczania do znakowania i genetycznej manipulacji tymi wycinkami.

Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Poznaj protokół izolacji hipokampa z mózgu przy użyciu clean slicer stage i transfekcję genową metodą gene gun. Technika ta umożliwia precyzyjne badania neuronów w neurobiologii.

Gene-gun Transfekcja Neurony hipokampa

Przeglądaj więcej filmów