Name: Grube i drobne rozwarstwienie nabłonka czuciowego ucha wewnętrznego u dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj technikę rozwarstwienia nabłonka czuciowego ucha wewnętrznego u dorosłego Danio rerio. Ta metoda umożliwia badanie regeneracji komórek włoskowych u kręgowców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Wewnętrzny Program Badawczy Narodowego Instytutu Badań nad Ludzkim Genomem (National Human Genome Research Institute) Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health).

Część 1: Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>Uśmierć dorosłe danio pręgowane, używając buforowanego MS-222 (methanesulfonate salt ethyl 3-aminobenzoate, 0,03%).</li>
	<li>Wykonaj dekapitację ryby. Odetnij dolną szczękę, umieść głowę na podkładce sekcyjnej stroną brzuszną do góry i unieruchom tkankę za pomocą szpilek entomologicznych. Usuń tkankę miękką znajdującą się brzusznie od czaszki, a następnie pod mikroskopem sekcyjnym rozważ szeroko brzuszna część torebki czaszkowej za pomocą pęsety precyzyjnej.</li>
	<li>Utrwal głowę ryby w paraformaldehydzie (4%) w temperaturze 4°C przez noc.</li>
	<li>Przepłucz utrwaloną głowę ryby w PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) trzykrotnie, każdorazowo przez 5 minut.</li>
</ol>
Część 2: Makroskopowa sekcja ucha wewnętrznego
<ol>
	<li>Umieść głowę ryby na podkładce do sekcji stroną brzuszną do góry. Unieruchom ją za pomocą szpilek entomologicznych. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać pod mikroskopem sekcyjnym.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń kość czaszki nad uchem wewnętrznym, a następnie ostrożnie wyciągnij tkanki ucha wewnętrznego: woreczki (saccules), lagenae oraz utriculae. Woreczek i lagena są ściśle ze sobą połączone i tym samym są wyciągane razem, podczas gdy utricula (znajdująca się przed woreczkiem i lageną) prawdopodobnie oddzieli się od pozostałych organów końcowych podczas sekcji.</li>
	<li>Umieść tkanki ucha wewnętrznego w PBS (1X). Jeśli nie jest wymagana dalsza precyzyjna sekcja, przepłucz tkankę 2-3 razy w PBS (1X); można ją następnie wykorzystać do innych doświadczeń, np. do cięć mrożonych.</li>
</ol>
Część 3: Precyzyjna mikrodysekcja nabłonka sensorycznego ucha wewnętrznego
<ol>
	<li>Precyzyjną dysekcję można przeprowadzić w kropli PBS (1X) na czystym szkiełku przedmiotowym.</li>
	<li>Za pomocą dwóch par precyzyjnych pęset wyjmij otolit utriculi z utriculi, a następnie, w razie potrzeby, odetnij nieczuciową tkankę nabłonkową oraz unerwienie nabłonków, używając precyzyjnej pęsety i ostrza igły.</li>
	<li>Przed oddzieleniem nabłonków sakkulum i lagena usuń otolit lagena, starając się zachować sakkulum w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Umieść tkankę w kropli PBS stroną brzuszną do góry. Używając ostrza igły, ostrożnie przetnij tkankę pomiędzy sakkulum a lagena. W razie potrzeby odetnij nadmiar nieczuciowej tkanki nabłonkowej oraz unerwienie, używając precyzyjnych pęset i ostrza igły.</li>
</ol>
Część 4: Barwienie fluorescencyjne komórek rzęskowych w nabłonkach sensorycznych
<ol>
	<li>Przepłucz nabłonki sensoryczne roztworem PBT (1XPBS i 1% Triton X-100) 3 razy, przez 5 min każdego razu.</li>
	<li>Inkubuj nabłonki z faloidyną znakowaną fluorochromem (np. Alexa Flour 488 Phalloidin, rozcieńczenie 1:1 000) przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłucz nabłonki sensoryczne roztworem PBT 3 razy, przez 10 min każdego razu.</li>
	<li>Zamocuj nabłonki na szkiełku za pomocą medium montażowego i sprawdź zabarwioną tkankę pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrami o odpowiedniej długości fali.</li>
	<li>Po prawidłowej dysekcji i barwieniu, pod mikroskopem można zaobserwować nieuszkodzone nabłonki z silnym barwieniem pęczków stereotypowych komórek rzęsatych (Rys. 1).</li>
</ol>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, rozkład zielonych komórek, znaczniki kierunkowe, struktura tkanki." src="/files/ftp_upload/1211/1211fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Komórki rzęsate nabłonka sensorycznego woreczka zostały zabarwione Alexa Flour 488 Phalloidin (zielony). Próbka tkanki została wypreparowana i zabarwiona zgodnie z opisem w artykule. Wykonano kilka zdjęć w różnych miejscach próbki, a następnie połączono je w mozaikę za pomocą programu Adobe Photoshop 7.0. 
Pasek skali = 150µm.

W niniejszym protokole opisano metodę preparacji makroskopowej i mikroskopowej nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, co umożliwia przygotowanie próbek tkanki do badania cech komórkowych i subkomórkowych nabłonków sensorycznych.
Aby przeprowadzić udaną sekcję, kluczowy jest pierwszy etap, czyli fiksacja. Należy zawsze używać świeżo przygotowanego roztworu paraformaldehydu, ponieważ stary roztwór doprowadzi do niedostatecznej fiksacji tkanek, co utrudni manipulac...

<table><tbody><tr><td>MS222 (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanianu)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (bufor fosforanowy, 10X)</td><td>Odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Faloidyna Alexa Fluor 488</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe VECTASHIELD Hard Set z DAPI</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Narzędzie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze igłowe</td><td>Narzędzie</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka do sekcji</td><td>Narzędzie</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>Danio pręgowany</td><td>Zwierzę</td><td>Różne</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

makro- i mikrosekcja nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych (danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Nabłonki neurosensoryczne w uchu wewnętrznym są kluczowymi strukturami dla funkcji słuchu i równowagi. Dlatego ważne jest zrozumienie cech komórkowych i molekularnych tych nabłonków, które składają się głównie z dwóch typów komórek: komórek rzęskowych (HCs) oraz komórek podporowych (SCs). W niniejszej pracy zdecydowaliśmy się badać nabłonki sensoryczne ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych nie tylko dlatego, że struktury nabłonkowe są wysoce konserwatywne u wszystkich badanych kręgowców, ale także dlatego, że dorosłe danio pręgowane potrafią regenerować HCs – zdolność, którą ssaki tracą krótko po narodzinach. Wykorzystujemy ucho wewnętrzne dorosłych danio pręgowanych jako system modelowy do badania mechanizmów regeneracji HCs ucha wewnętrznego u dorosłych kręgowców, co może być pomocne w terapii klinicznej deficytów słuchu i równowagi u ludzi wynikających z utraty HCs.
W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić preparację wstępną i precyzyjną nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio prążkowanych. Preparacja wstępna polega na usunięciu tkanek otaczających ucho wewnętrzne i jest pomocna przy przygotowywaniu przekrojów tkankowych, co pozwala nam zbadać szczegółową strukturę nabłonków sensorycznych. Preparacja precyzyjna polega na oczyszczeniu każdego z poszczególnych nabłonków z tkanek niebędących nabłonkiem sensorycznym i umożliwia nam łatwe badanie heterogeniczności całego nabłonka w próbkach przygotowanych metodą whole-mount.

Nabłonek sensoryczny ucha wewnętrznego dorosłych danio przebraniego stanowi dobry model badawczy do zrozumienia mechanizmów regeneracji komórek rzęskowych u dorosłych kręgowców. Niniejszy protokół prezentuje precyzyjną dyssekcję nabłonków, która pozwala na pobranie próbek tkanek do badania procesów regeneracyjnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym.

Makro- i mikrosekcja nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych (Danio rerio)

Nabłonki neurosensoryczne w uchu wewnętrznym są kluczowymi strukturami dla funkcji słuchu i równowagi. Dlatego istotne jest zrozumienie...

W uchu wewnętrznym danio pręgowanego znajduje się trzy pary workowatych narządów końcowych: utriculum, sacculus i lagena. Utriculum znajduje się najbardziej przednio, podczas gdy sacculus i lagena są ze sobą ściśle połączone i zlokalizowane za utriculum. Po sekcji wstępnej sacculus i lagena pozostają połączone, a w każdym z narządów końcowych podczas następnej, szczegółowej sekcji można łatwo dostrzec kamieniowatą strukturę – otolit. Sacculus i lagena są od siebie oddzielane poprzez nacięcie od strony brzusznej.Otolity zostają usunięte, a tkanki nabłonkowe niesensoryczne są odcinane w celu uzyskania tkanek nabłonkowych sensorycznych ze wszystkich trzech organów końcowych. Cześć, jestem Jean Leon z laboratorium Seana Burgessa w sekcji genomiki rozwojowej Narodowego Instytutu Badań nad Ludzkim Genomem. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę precyzyjnej mikrodysekcji nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłego danio pręgowanego.W naszym laboratorium stosujemy ten proces do badania ekspresji genów w nabłonku sensorycznym ucha wewnętrznego. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć sekcję, uśmierć dorosłą rybkę danio w buforowanym roztworze MS 222 0,03%, odetnij głowę ryby, a następnie odetnij

gross-fine-dissection-inner-ear-sensory-epithelia-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Brudne i drobne rozszczepienia nabłonka sensorycznego ucha wewnętrznego u dorosłych danioli pręgowanej (Danio rerio)

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Opisano przejrzystą, zestandaryzowaną metodę sekcji i izolacji serca danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju. Omówiono również techniki adnotacji i kwantyfikacji.

Sekcja serca w larwalnym, młodzieżowym i dorosłym zebrafish, Danio rerio

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.

Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Poznaj technikę rozwarstwienia nabłonka czuciowego ucha wewnętrznego u dorosłego Danio rerio. Ta metoda umożliwia badanie regeneracji komórek włoskowych u kręgowców.

Makro- i mikrosekcja nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych (Danio rerio)

Przeglądaj więcej filmów