Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania macierzy CP one GFP poprzez uprawę linii komórek, a następnie przeniesienie macierzy na nową płytkę za pomocą igły do transferu (pinning). Jednocześnie należy przygotować nową kopię DMA. Następnie przeprowadzamy krzyżowanie macierzy ACP one GFP z DMA i selekcjonujemy diploidy, które są następnie poddawane sporulacji na podłożu do sporulacji.

Pięć dni później potomstwo Myotic jest wysiewane na podłoże LRK, na którym rosną wyłącznie haploidy MAT A. Poprzez dwie dodatkowe rundy selekcji otrzymujemy komórki haploidalne zawierające zarówno ACP one GFP, jak i gen znokautowany w obrębie kanamycyny. Na koniec możemy wyselekcjonować poszczególne szczepy bezpośrednio z płytki i obserwować morfologię mitochondriów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Cześć, jestem Chap T z laboratorium Law z Katedry Biologii Komórki i Rozwojowej Instytutu Nauk o Życiu na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Cześć, jestem Jesse Chao, również z laboratorium Loan. Dzisiaj zaprezentujemy wysokoprzepustową metodę wprowadzania markerów GFP do różnych mutantów drożdży przy użyciu systemu robotycznego.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfologii organelli, takich jak D, retikulum endoplazmatyczne i mitochondria. Przejdźmy zatem do działania. W tym protokole wykorzystujemy dwa różne szczepy drożdży.

Szczep CP one GFP posiada znacznik GFP na końcu C białka ACP one, który został wprowadzony poprzez homologiczną rekombinację zapośredniczoną przez PCR z użyciem plazmidu PKT 1 28. Tłem szczepu jest BY 7 0 4 3. Wykorzystujemy również szczep DMA lub tablicę mutantów delecyjnych (deletion mutant array), która stanowi zbiór około 5 000 mutantów delecyjnych genów nieessentialnych.

Wszystkie te geny nieessentialne zostały usunięte w szczepie G four 18. Tłem genetycznym macierzy jest BY 47 41. Aby rozpocząć hodowlę kolonii komórek ACP one GFP, należy wylać 5 ml nocnej hodowli ACP one GFP na płytkę z histydyną.

Pozostaw płytkę do całkowitego wyschnięcia nad płomieniem lub w dygestorium biologicznym. Po wyschnięciu inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji użyj robota do naniesienia szczepu A CP one GFP w układzie 1 536 kolonii na płytkę.

W tym samym czasie przygotuj świeżą kopię DMA, przenosząc szczepy metodą replica pinning na cztery płytki YPDG 18. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 30°C przez noc, aż szczepy urosną. Przygotuj szczep A CP one GFP z DMA za pomocą replica pinningu i nakładając kolonie na płytki YPD, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 30°C przez noc.

Po inkubacji płyt replikacyjnych, kolonie na płytach SD hiss G four 18 w celu wyselekcjonowania komórek diploidalnych należy inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Aby rozpocząć sporulację i kiełkowanie, najpierw przenieś diploidy metodą replikacji na płyty YPDG four 18 w celu zwiększenia wydajności sporulacji w kolejnym kroku. Po inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden dzień, przenieś diploidy metodą replikacji na pożywkę wzmacniającą sporulację, która zawiera obniżone poziomy źródeł węgla i azotu, aby indukować tworzenie zarodników meiotycznych.

Następnie inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez co najmniej pięć dni. Po inkubacji przeprowadzić kiełkowanie macierzy, czyli potomstwa meiotycznego, poprzez przeniesienie kolonii metodą replica plating na podłoże LRK. Podłoże to indukuje kiełkowanie komórek z przetrwalników; inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez dwa dni, aby wyselekcjonować komórki posiadające zarówno allel GFP, jak i pojedynczy allel mutanta.

Komórki Matt A są przenoszone metodą replikacji na podłoże lade G four 18, które selekcjonuje komórki haplo posiadające delecję genu; płytki te należy inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Następnie potomstwo mejotyczne mat a przenosi się metodą replikacji na podłoże L-H-R-K-G four 18, aby wyselekcjonować wzrost pojedynczych mutantów, które dodatkowo posiadają ACP one GFP; inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.

Następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie trzy miesiące. Aby zwizualizować pożądane mutanty wykazujące ekspresję CP one GFP bezpośrednio z płytki, należy rozpocząć od wybrania odpowiednich kolonii z płytek. Hodować komórki w temperaturze 30°C na podłożach YPD lub SD hiss do wczesnej fazy logarytmicznej.

Na koniec należy zwizualizować mutanty za pomocą mikroskopii konfokalnej z zestawem filtrów GFP; na tym obrazie konfokalnym zwizualizowano mutanta oraz typ dziki z markerem ACP one GFP w celu zbadania morfologii mitochondriów. Ten konkretny mutant wykazuje zaburzony fenotyp mitochondrialny, co czyni go dobrym kandydatem do dalszych badań. Przedstawiliśmy sposób na efektywne włączenie markera multiklonalnego, CP one GFP, do macierzy mutantów delecyjnych z wykorzystaniem systemu robotycznego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przygotowanie świeżych pożywek oraz zapewnienie odpowiedniego czasu na ich wyschnięcie. Zbyt wysoka wilgotność doprowadzi do powstania kondensacji, co zwiększy ryzyko kontaminacji. Należy również dwukrotnie sprawdzić, czy wszystkie pożywki selekcyjne zostały przygotowane prawidłowo, ponieważ są one kluczowe dla tego protokołu.

Tę procedurę można zastosować również do innych rodzajów markerów. Na przykład, aby zwizualizować er, rutynowo używamy markerów air 11 oraz GSP. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.