Name: Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli u S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę wizualizacji morfologii organelli w S. cerevisiae przy użyciu markerów GFP i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia efektywny screening mutacji wpływających na strukturę organelli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Biotechnology and Biological Sciences Research Council (grant 31/C15982), Canadian Institutes of Health Research, Canada Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund, Michael Smith Foundation for Health Research (grant dla C.J.R. Loewen) oraz Fight For Sight.

Materiały i metody:
<ol>
<li>Szczepy drożdży: 
<ul>
<li>Acp1-GFP (GFP::His): znacznik GFP na końcu C-terminalnym Acp1 został wprowadzony poprzez homologiczną rekombinację zapśredniczoną przez PCR z użyciem plazmidu pKT128 (zawierającego GFP i HIS5). Pozytywne transformanty potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej i PCR kolonii. Tłem szczepu był BY7043 (MAT alpha can1∆::STE2pr-lue2 lyp1∆ his3∆1 leu2∆0 ura3∆0 met15∆0) z laboratorium Boone (Tong i Boone, 2006).</li>
<li>Deletion Mutant Array (DMA) (xxx::KanR): jest to macierz około 5000 mutantów z delecjami genów nieessentialnych. Wszystkie te geny nieessentialne zostały wyłączone przy użyciu G418. Tłem szczepów w macierzy jest BY4741 (MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Nasza macierz DMA pochodziła pierwotnie z laboratorium Boone.</li>
</ul>
</li>
<li>Wprowadzenie Acp1-GFP do macierzy DMA:
 Poniższy protokół tworzenia macierzy GFP został zaadaptowany z technologii Syntetycznej Analizy Genetycznej (SGA) (Tong i Boone, 2006) z modyfikacjami. Wszystkie etapy przenoszenia kolonii (replica pinning) są wykonywane przy użyciu zautomatyzowanego systemu do tworzenia macierzy o wysokiej gęstości Singer ROTOR. Alternatywnie można zastosować manualne przenoszenie kolonii lub robota do macierzy o wysokiej gęstości w systemie ciekłym. Skróty: YPD, ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza; SD, syntetyczna pożywka z brakami (dropout); LRK, pożywka z brakiem Lue/Arg/Lys; LHRK, pożywka z brakiem Lue/His/Arg/Lys Przygotowanie
<ol>
<li>Wyhodować trawnik komórek Acp1-GFP, wylewając 5 ml nocnej hodowli Acp1-GFP na płytkę YPD. Pozostawić płytkę do całkowitego wyschnięcia nad płomieniem lub w biologicznej komorze z wyciągiem.</li>
<li>Inkubować płytkę w temperaturze 30˚C przez noc.</li>
<li>Za pomocą robota nanieść szczep Acp1-GFP w formie 1536 kolonii na płytkę. Jednocześnie przygotować świeżą kopię DMA poprzez przeniesienie kolonii na płytki YPD + G418.</li>
<li>Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc. 
Krzyżowanie i selekcja diploidów </li>
<li>Skrzyżować szczep Acp1-GFP z macierzą DMA poprzez przeniesienie kolonii i nałożenie ich na płytki YPD.</li>
<li>Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc.</li>
<li>Przenieść kolonie na płytki SD – His + G418 w celu wyselekcjonowania komórek diploidowych (MATa/MATalpha).</li>
<li>Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc. 
Sporulacja i kiełkowanie </li>
<li>Przenieść kolonie diploidowe na pożywkę do wzmocnionej sporulacji, która zawiera obniżone poziomy źródeł węgla i azotu w celu indukowania tworzenia zarodników meiotycznych.</li>
<li>Inkubować płytki w temperaturze 25˚C przez minimum 5 dni.</li>
<li>Wyhodować progeny meiotyczne MATa, przenosząc kolonie na pożywkę LRK i inkubując płytki w temperaturze 30˚C przez dwa dni.</li>
<li>Pożywka ta indukuje kiełkowanie haploidalnych komórek z zarodników. Ponieważ otwarta ramka odczytu (ORF) LUE2 jest zintegrowana z promotorem STE2 specyficznym dla MATa, wszystkie wykiełkowane haploidy będą posiadały typ MATa. 
Selekcja obu alleli </li>
<li>Konieczne jest teraz wyselekcjonowanie zarówno allelu GFP, jak i allelu pojedynczego mutanta. W tym celu komórki MATa przenosi się na pożywkę LRK + G418, która selekcjonuje haploidy posiadające delecję genu (xxx::kanR).</li>
<li>Inkubować płytki w temperaturze 30˚C przez noc.</li>
<li>Na koniec progeny meiotyczne MATa przenosi się na pożywkę LHRK + G418 , aby wyselekcjonować wzrost pojedynczych mutantów (xxx::kanR) posiadających również Acp1-GFP (GFP::His). Płytki te można przechowywać w temperaturze 4˚C przez maksymalnie 3 miesiące.</li>
</ol>
 Poniższy protokół tworzenia macierzy GFP został zaadaptowany z technologii Syntetycznej Analizy Genetycznej (SGA) (Tong i Boone, 2006) z modyfikacjami. Wszystkie etapy przenoszenia kolonii są wykonywane przy użyciu zautomatyzowanego systemu do tworzenia macierzy o wysokiej gęstości Singer ROTOR. Alternatywnie można zastosować manualne przenoszenie kolonii lub robota do macierzy o wysokiej gęstości w systemie ciekłym. Skróty: YPD, ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza; SD, syntetyczna pożywka z brakami (dropout); LRK, pożywka z brakiem Lue/Arg/Lys; LHRK, pożywka z brakiem Lue/His/Arg/Lys Przygotowanie
</li>
<li>Mikroskopia:<ol>
<li>Wybrać wybrany mutant lub mutanty wykazujące ekspresję Acp1-GFP bezpośrednio z płytki.</li>
<li>Hodować komórki w temperaturze 30 °C w pożywce YPD lub SD – His do wczesnej fazy logarytmicznej.</li>
<li>Wizualizować za pomocą mikroskopii konfokalnej z użyciem zestawu filtrów GFP. Przykład oczekiwanego wyniku przedstawiono na Rysunku 1.</li>
</ol></li>
</ol>
Pożywka SGA:
Pożywka wzrostowa (YPD) oraz pożywka selekcyjna (SD) wykorzystywane w tym protokole są rutynowo stosowane w biologii molekularnej drożdży. Szczegółowe opisy znajdują się w publikacji Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).
pożywki LRK, LHRK (łącznie 400 ml)
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Dodawać w podanej kolejności</td>
<td>Ilość</td>
</tr>
<tr>
<td>Azotowa baza drożdżowa z siarczanem amonu</td>
<td>2.7 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina aminokwasów</td>
<td>0.8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
<td>360 mL</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Autoklawować</td>
</tr>
<tr>
<td>20 % dekstroza</td>
<td>40 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Schłodzić do 65˚C</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml kanawanina</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml tializyna</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Wymieszać, wlewać 50 ml na płytkę</td>
</tr>
</tbody>
</table>
pożywka LRK, LHRK + G418 (łącznie 400 ml)
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Kolejność dodawania</td>
<td>Ilość</td>
</tr>
<tr>
<td>Azotowa baza dla drożdży bez siarczanu amonu</td>
<td>0.7 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina aminokwasów</td>
<td>0.8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutaminian monosodowy</td>
<td>0.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
<td>360 mL</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Autoklawowanie</td>
</tr>
<tr>
<td>20 % dekstrozy</td>
<td>40 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Schłodzić do 65˚C</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml kanawaniny</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>100 mg/ml tializyny</td>
<td>0.2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>200 mg/ml G418</td>
<td>0.4 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Wymieszać, wlać 50 ml na płytkę</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Wzbogacona pożywka do sporulacji (na całkowitą objętość 400 ml)
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Kolejność dodawania</td>
<td>Ilość</td>
</tr>
<tr>
<td>Octan potasu</td>
<td>4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Ekstrakt drożdżowy</td>
<td>0.4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Dekstroza</td>
<td>0.2 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina aminokwasów do sporulacji</td>
<td>0.04 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>8 g</td>
</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
<td>360 mL</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Autoklawowanie</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Schładzanie do 65˚C</td>
</tr>
<tr>
<td>200 mg/ml G418</td>
<td>0.4 ml</td>
</tr>
<tr>
<td colspan="2">Wymieszać, wylać po 50 ml na płytkę</td>
</tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Ta metoda pozwala na efektywne wprowadzenie markera mitochondrialnego, Acp1-GFP, do różnych tła mutantów. Opiera się ona na wykorzystaniu systemu robotycznego i może zostać łatwo zaadoptowana do pracy z dowolnym systemem robotycznym.&nbsp;Procedurę tę można również stosować do wprowadzania innych rodzajów markerów. Na przykład do wizualizacji ER rutynowo stosujemy marker Erg11-GFP. Na naszych reprezentatywnych obrazach mutant oraz typ dziki z markerem Acp1-GFP zostały poddane mikroskopii konfokalnej w celu zbadania morfo...

<table><tbody><tr><td>Pożywki SGA</td><td></td><td></td><td>Pożywki wzrostowe (YPD) oraz syntetyczne pożywki selekcyjne (SD), w tym LRK i LHRK, a także wzbogacone pożywki do sporulacji wykorzystane w tym protokole, są rutynowo stosowane w biologii molekularnej drożdży. Szczegółowe opisy znajdują się w publikacji Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *s. cerevisiae*

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Wysokoprzepustowe metody badania lokalizacji białek lub morfologii organelli stanowią skuteczne narzędzie do analizy interakcji białkowych i mogą pomóc w uzyskaniu kompleksowego zrozumienia szlaków molekularnych. W przypadku *Saccharomyces cerevisiae*, dzięki opracowaniu kolekcji mutantów z delecją genów nieessentialnych, możliwe jest globalne badanie morfologii różnych organelli, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER) i mitochondria, z wykorzystaniem markerów GFP (lub ich wariantów) na tle różnych genotypów. Jednak wprowadzanie markerów GFP do każdego pojedynczego mutanta z osobna jest procesem pracochłonnym. W niniejszym materiale opisujemy procedurę rutynowo stosowaną w naszym laboratorium. Dzięki zastosowaniu systemu robotycznego do obsługi wysokogęstościowych macierzy drożdży oraz technik selekcji za pomocą leków, możemy znacznie skrócić wymagany czas i poprawić powtarzalność badań. W skrócie: za pomocą robotycznego przeniesienia kolonii (replica pinning) krzyżujemy marker mitochondrialny znakowany GFP (Apc1-GFP) z wysokogęstościową macierzą 4672 mutantów z delecją genów nieessentialnych. Poprzez selekcję diploidów, sporulację, kiełkowanie i podwójną selekcję markerową odzyskujemy oba allele. W rezultacie każdy haploidalny pojedynczy mutant zawiera Apc1-GFP wbudowany w locus genomowe. Dzięki temu możemy badać morfologię mitochondriów na tle wszystkich mutantów nieessentialnych. Wykorzystując to wysokoprzepustowe podejście, możemy w wygodny sposób badać i określać szlaki oraz geny zaangażowane w dziedziczenie i formowanie organelli w skali całego genomu.

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Wysokoprzepustowe metody badania lokalizacji białek lub morfologii organelli stanowią skuteczne narzędzie do analizy oddziaływań białkowych i mogą pomóc...

Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania macierzy CP one GFP poprzez uprawę linii komórek, a następnie przeniesienie macierzy na nową płytkę za pomocą igły do transferu (pinning). Jednocześnie należy przygotować nową kopię DMA. Następnie przeprowadzamy krzyżowanie macierzy ACP one GFP z DMA i selekcjonujemy diploidy, które są następnie poddawane sporulacji na podłożu do sporulacji.Pięć dni później potomstwo Myotic jest wysiewane na podłoże LRK, na którym rosną wyłącznie haploidy MAT A. Poprzez dwie dodatkowe rundy selekcji otrzymujemy komórki haploidalne zawierające zarówno ACP one GFP, jak i gen znokautowany w obrębie kanamycyny. Na koniec możemy wyselekcjonować poszczególne szczepy bezpośrednio z płytki i obserwować morfologię mitochondriów za pomocą mikroskopii konfokalnej.Cześć, jestem Chap T z laboratorium Law z Katedry Biologii Komórki i Rozwojowej Instytutu Nauk o Życiu na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Cześć, jestem Jesse Chao, również z laboratorium Loan. Dzisiaj zaprezentujemy wysokoprzepustową metodę wprowadzania markerów GFP do różnych mutantów drożdży przy użyciu systemu robotycznego.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfologii organelli,

a-high-throughput-method-to-globally-study-organelle-morphology-s

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda wysokowydajnościowa do globalnego badania morfologii organelli w S. cerevisiae

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj wysokoprzepustową metodę wizualizacji morfologii organelli w S. cerevisiae przy użyciu markerów GFP i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia efektywny screening mutacji wpływających na strukturę organelli.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów