Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Niniejsza procedura pozwala na określenie wzorców ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego z wysoką rozdzielczością; sonda rybonukleinowa antysensowna hybrydyzuje z komplementarnym docelowym mRNA. Znakowana sonda rybonukleinowa jest rozpoznawana przez przeciwciało sprzężone z enzymem peroksydazą; do embrionów dodaje się fluoro-4 sprzężony z amidą, a peroksydaza przekształca IDE w wysoce reaktywny związek. Prowadzi to do stabilnego osadzania fluoro-4; niezwiązane IDE zostaje wypłukane, co ujawnia szczegółowy subkomórkowy wzorzec rozmieszczenia mRNA.

Ekspresję drugiego genu można zaobserwować, używając sondy znakowanej w wyraźny sposób oraz innego fluoroforu, co pozwala na szczegółowe porównanie ekspresji. Cześć, jestem Tim Brent z laboratorium Scotta Holly w Katedrze Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Yale. Dzisiaj przedstawimy procedurę wysokorozdzielczej podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w całym preparacie embrionów zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Niniejszą procedurę stosujemy do badania segmentacji u danio pręgowanego. Przejdźmy zatem do realizacji. Procedurę rozpoczynamy od embrionów, które były utrwalane przez noc w niskiej temperaturze w paraformaldehydzie.

Użycie świeżo rozmrożonego roztworu zapasowego paraformaldehydu do tej fiksacji jest kluczowe dla uzyskania poprawnego barwienia. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć embriony w temperaturze pokojowej dwukrotnie po pięć minut za każdym razem w PBS. Następnie usunąć chorion embrionów.

Zarodki umieszcza się w szklanych płytkach z zagłębieniami. Używając pęsety zegarmistrzowskiej, należy od tego momentu usunąć chorion. Do przenoszenia zarodków należy użyć szklanej pipety pasterowskiej polerowanej ogniowo.

W przeciwnym razie zarodki przykleją się do zwykłych końcówek z polipropylenu. Odchlorowane zarodki przenosi się poprzez serię przemywań w roztworach metanolu o rosnącym stężeniu. Ostatnie przemywanie odbywa się w 100% metanolu.

Na koniec zarodki umieszcza się w świeżym metanolu i przechowuje w temperaturze -20°C przez noc. Następnego dnia zarodki przenosi się przez serię płukań w roztworach o malejącym stężeniu metanolu oraz dwa razy płucze w buforze PBST przez 5 minut. Następnie zarodki utrwala się w paraformaldehydzie przez 20 minut.

Krótką fiksację zakończ dwukrotnym, pięciominutowym płukaniem w roztworze PBST. Teraz możemy przejść do permeabilizacji embrionów. Utrwalone embriony stają się przepuszczalne po inkubacji z proteiną ACE K. Upewnij się, że probówka do mikrowirówki leży na boku.

Czas trwania etapu trawienia zależy od wieku embrionu. Na przykład embriony w stadium agenezy somatycznej inkubuje się przez trzy do czterech minut. Krótko przepłucz w PBST, a następnie raz przemyj w PBST przez pięć minut.

Utrwal zarodki w paraformaldehydzie. Na koniec przemyj zarodki dwukrotnie w PBST przez pięć minut. Zarodki są teraz gotowe do hybrydyzacji z sondami RNA.

Po utrwaleniu i permeabilizacji embrionów rozpoczynamy proces hybrydyzacji od pięciominutowej inkubacji w roztworze HI- w temperaturze 65°C. Należy pamiętać o uprzednim podgrzaniu roztworu HI- przed użyciem. Następnie embriony inkubuje się w roztworze HI+ przez jedną godzinę.

Ponownie przypominamy o konieczności wstępnego podgrzania roztworu Hyb+ . Teraz należy usunąć większość roztworu Hyb+, pozostawiając 50 µL, upewniając się, że embriony są całkowicie zanurzone. Następnie należy dodać po 1 µL każdej sondy i wymieszać, delikatnie stukując probówką.

Od tego momentu należy przykryć probówki folią aluminiową. Ponieważ flurorescyna jest światłoczuła, a hybrydyzacja przebiega podczas inkubacji przez noc w temperaturze 65 °C, proces ten zostaje zakończony. Przejdźmy teraz do usunięcia nadmiaru sond.

Detergent zostaje usunięty w celu poprawy barwienia. Należy jednak zauważyć, że wobec braku detergentu zarodki stają się lepkie. Przemyć dwukrotnie roztworem 50% formamid w 2X SSC, za każdym razem przez 30 minut.

Przemyj raz i dwa razy roztworem 2X SSC przez 15 minut. Na koniec przemyj dwa razy roztworem 0,2X SSC przez 30 minut za każdym razem. Następnie zwizualizujemy każdą sondę.

Teraz możemy rozpocząć detekcję zhybrydyzowanych sond. Najpierw należy wykryć sondę fluoresceinową, ponieważ jest ona mniej stabilna i słabsza niż sonda z digoksygeną. W pierwszej kolejności przeprowadź blokowanie, dodając 500 µL 2% odczynnika blokującego w buforze kwasu maleinowego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie dodać przeciwciało antyfluoresceinowe sprzężone z peroksydazą w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Należy upewnić się, że probówka do mikrocentryfugi leży na boku.

Następnie należy rozpocząć detekcję przy użyciu systemu wzmacniania sygnału tyrom lub TSA TYROM, w którym IDE jest sprzężone z fluoroforem. Peroksydaza chrzanowa znajdująca się na przeciwciele przekształca TY IDE w wysoce reaktywny produkt pośredni. Reaktywne TY IDE tworzy wiązanie kowalencyjne z resztami znajdującymi się w bliskim sąsiedztwie przeciwciała, co skutkuje lokalnym osadem fluoroforu.

Zacznij od czterech 20-minutowych przemyć w jednokrotnym buforze kwasu maleinowego w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj dwa razy w PBS. Fluoresceinowy TY IDE został wcześniej rozpuszczony w DMSO w celu przechowywania. Krótko odwiruj ten substrat TSA.

Następnie rozcieńcz substrat TSA w stosunku 1:50 w buforze rozcieńczającym do amplifikacji. Dodaj roztwór do embrionów i inkubuj przez 45 minut. Połóż probówkę do mikrocentryfugi na boku.

Podczas tego etapu inkubacji należy poddać embriony serii 10-minutowych przemywań w roztworach metanolu o rosnącym stężeniu. Ostatnie przemywanie trwa 10 minut w 100% metanolu. Następnie inkubować przez 30 minut w roztworze 1% nadtlenku wodoru w celu inaktywacji peroksydazy obecnej na przeciwciele. W przeciwnym razie może ona zakłócić detekcję digoksygenu.

Przenieś zarodki za pomocą sondy przez serię przemyć z malejącym stężeniem metanolu oraz dwa 10-minutowe przemycia buforem PBS. Zapewnia to całkowite usunięcie metanolu. Oznaczanie przeciwciałami digoxigenu i sondy rozpoczyna się od blokowania, analogicznie jak w przypadku poprzedniego przeciwciała.

Następnie dodaj przeciwciało anty-digoksygieninę w rozcieńczeniu 1:1000. Połóż probówkę do mikrocentryfugi na boku i inkubuj przez noc w niskiej temperaturze. Następnego dnia przemyj próbkę w temperaturze pokojowej buforem kwasu maleinowego.

Następnie za pomocą PBS szybko przepłukać substrat SCI five tyrom. Rozcieńczyć go w stosunku 1:50 i dodać do embrionów. Inkubować przez 45 minut, kładąc probówkę na boku.

Na koniec przemyj próbkę trzykrotnie w PBST. Końcowy etap barwienia jodekiem propidium służy do znakowania jąder komórkowych. Rozpocznij od dwóch pięciominutowych płukań w 2XSSC.

Następnie inkubować z RNA przez 30 minut w temperaturze 37°C. Przemyć sześciokrotnie w roztworze 2X SSC w temperaturze pokojowej, a następnie dodać roztwór jodku propidyny i barwić przez osiem minut. Przemyć sześciokrotnie w roztworze 2X SSC.

Utrwal embriony w paraformaldehydzie przez 20 minut. Następnie przeprowadź dwa pięciominutowe płukania w PBST. Przygotowanie embrionów do obserwacji rozpoczyna się od dwóch 10-minutowych inkubacji w 25% oraz 50% glicerolu.

Następnie umieść próbki w 75% glicerolu i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten nocny etap przejaśniania ułatwia sekcję embrionów. Na koniec przeprowadź sekcję i usuń żółtko z embrionów.

Aby zredukować fluorescencję tła, należy zamocować embriony płasko na szkiełku przedmiotowym i zbadać je pod mikroskopem. Przedstawione obrazy ukazują pojedynczy przekrój konfokalny przez tylny koniec embrionu zebrafish na etapie 10 somytów. Czerwone barwienie wskazuje mRNA delta C wykryte za pomocą sondy znakowanej digoksigeniną oraz odczynnika TSA sci-fi.

Zielone barwienie reprezentuje jeden mRNA wykryty za pomocą sondy znakowanej fluoresceiną. I odczynnik TSA fluorescein, a jądra barwione jorkiem propidylo są koloru niebieskiego w podwójnie barwionym embrionie.

Można jednoznacznie określić obszary odrębnej lub nakładającej się ekspresji. Ta procedura ujawnia subkomórkową lokalizację mRNA, co widać na tych zbliżeniach barwienia. Aktywna transkrypcja genu jest widoczna jako kropki barwienia w jądrze komórkowym.

Inne komórki wykazują cytoplazmatyczną lokalizację mRNA. W zarodku poddanym podwójnemu barwieniu można zaobserwować komórki transkrybujące oba geny lub tylko jeden z nich.

Osobno przedstawiliśmy sposób przeprowadzenia wysokorozdzielczej podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w preparatach całych embrionów ryb zebrafish. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że najpierw testujemy sondy za pomocą standardowego barwienia z wykorzystaniem fosfatazy alkalicznej; sondy dające czysty i silny sygnał będą działać prawidłowo w fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Z sukcesem zastosowaliśmy również immunolokalizację beta-kateniny zamiast barwienia jodkiem propidyny. W przypadku tej modyfikacji reakcje hybrydyzacji przeprowadzamy w temperaturze 55 °C zamiast 65 °C. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.