Name: Danio pręgowany Cała góra Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia wizualizację wzorców ekspresji genów i ich nakładania się w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Dörthe Jülich, Jennifer Round oraz Andrew Mara za wkład w opracowanie niniejszego protokołu. Wsparcie badawcze zostało zapewnione przez NICHD, American Cancer Society oraz March of Dimes.

1. FIKSACJA
<ol>
<li>Utrwalaj zarodki przez noc w temperaturze 4°C w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS.</li>
<li>Usuń utrwalacz i przemyj 2 x PBS, po 5 minut każdy w temperaturze pokojowej (RT).</li>
<li>Przeprowadź manualną dechorionację zarodków w PBS w szklanej płytce z zagłębieniami, używając pęsety zegarmistrzowskiej. Po dechorionacji przenoś zarodki za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, ponieważ mogą one przywierać do pipet polipropylenowych.</li>
<li>Przenieś zarodki przez serię roztworów metanolu w PBS o stężeniach 25%, 50% i 75%, po 5 minut w każdym z nich.</li>
<li>Wymień płyn na 100% metanol, inkubuj przez 5 minut, a następnie wymień na świeży metanol.</li>
<li>Przechowuj zarodki w temperaturze -20°C przez co najmniej jedną godzinę. (Zwyczajowo inkubujemy zarodki przez noc. Standardowa hybrydyzacja in situ działa na zarodkach przechowywanych przez ponad rok, jednak nie badaliśmy, czy wysoka rozdzielczość fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ ulega utracie podczas długotrwałego przechowywania).</li>
<li>Przemywaj zarodki przez 5 minut każdy w 75%, 50% i 25% metanolu w PBST w temperaturze RT. Przemyj dwukrotnie po 5 minut w PBST w temperaturze RT.</li>
<li>Ponownie utrwalaj przez 20 minut w 4% PFA w PBS w temperaturze RT.</li>
<li>Przemyj dwukrotnie po 5 minut w PBST w temperaturze RT.</li>
</ol>
UWAGA DOTYCZĄCA PFA: Przechowujemy 4% PFA w alikwotach w temperaturze –20ºC (patrz tabela odczynników). Do pierwszej fiksacji używamy wyłącznie PFA, które nie było wcześniej rozmrażane. Do kolejnych fiksacji często wykorzystujemy PFA, które było już rozmrażane. Pierwsza fiksacja wydaje się być kluczowa dla powodzenia barwienia w tym protokole.
2. PROTEINAZA I POSTFIKSACJA
<ol>
<li>Trawienie proteinazą K (5μg/ml w PBST) w RT przez 3 do 12 minut w celu permeabilizacji embrionów. (Czas inkubacji zależy od wieku embrionów, gdyż wcześniejsze stadia są bardziej wrażliwe. Zależy on również od partii enzymu). W przypadku embrionów w stadium somitogenezy typowo przeprowadzamy permeabilizację przez 3-4 minuty. Podczas tej inkubacji probówkę do mikrocentryfugi kładziemy na boku.</li>
<li>Krótkie płukanie w PBST, a następnie jednokrotne przemycie przez 5 minut w PBST.</li>
<li>Ponowna fiksacja przez 20 minut w 4% PFA w PBS w RT.</li>
<li>Dwukrotne przemycie w PBST w RT po 5 minut każdy z etapów.</li>
</ol>
3. PREHYBRYDYZACJA
<ol>
<li>Inkubować zarodki przez 5 minut w temperaturze 65º C w roztworze HYB-.</li>
<li>Przeprowadzić prehybrydyzację w temperaturze 65º C przez co najmniej 1 godzinę w roztworze HYB+.</li>
</ol>
4. HYBRYDYZACJA
<ol>
<li>Usuń cały preHYB poza 50 μl, dbając o to, aby embriony pozostały całkowicie zanurzone.</li>
<li>Dodaj 1-2 μl każdej sody riboprobe (riboprobe znakowane digoksigeniną i fluoresceiną) do embrionów i wymieszaj, delikatnie potrząsając probówką. Ilość sondy to zazwyczaj 1-2µl z 20µl reakcji syntezy sondy.</li>
<li>Z uwagi na to, że fluoresceina jest światłoczuła, probówki powinny być od tego momentu owinięte folią aluminiową lub w inny sposób chronione przed światłem.</li>
<li>Inkubuj embriony przez noc w temperaturze 65ºC.</li>
</ol>
5. USUWANIE SOND
Należy zwrócić uwagę, że od tego momentu roztwory nie zawierają detergentu. Eliminacja detergentu wydaje się wspomagać reakcje barwienia, ale powoduje, że embriony stają się dość lepkie.
<ol>
<li>Usunąć sondę rybosomową.</li>
<li>Przepłukać 2 x 30 minut w temperaturze 65ºC w 50% formamidzie/2xSSC.</li>
<li>Przepłukać przez 15 minut w temperaturze 65ºC w 2 x SSC.</li>
<li>Przepłukać przez 30 minut w temperaturze 65ºC w 0.2 x SSC.</li>
</ol>
6. INKUBACJA Z PRZECIWCIAŁEM PRZECIW FLUORESCEINIE
<ol>
<li>Blokować przez co najmniej 1 godzinę w RT w 500μl roztworu buforu kwasu maleinowego 1x z dodatkiem 2% odczynnika blokującego (patrz tabela odczynników).</li>
<li>Dodać przeciwciało anty-Fluoresceina-POD, dostarczone przez firmę Roche, w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym.</li>
<li>Inkubować przez noc w 4ºC. Podczas tej inkubacji probówkę do mikrowirówki kładziemy na boku.</li>
<li>Przemyć 4 x 20 minut w buforze kwasu maleinowego 1x. Przemyć dwukrotnie po 5 minut w PBS.</li>
</ol>
7. WYKRYWANIE ZONDY ZNACZONEJ FLUORESCEINĄ
<ol>
<li>Inkubować przez 30-60 minut w roztworze TSA z fluoresceiną. (Przed przygotowaniem roztworu barwiącego należy odwirować substrat TSA. W celu przeprowadzenia reakcji odczynnik tyramidowy rozcieńcza się 1:50 w buforze rozcieńczającym do amplifikacji Perkin Elmer). Podczas tej inkubacji probówkę do mikrocentryfugi kładzie się na boku. Czas reakcji należy określić empirycznie dla każdej sondy. Niestety, reakcji barwienia nie można monitorować wizualnie, ponieważ substrat jest fluorescencyjny i przez cały czas trwania procesu barwienia widoczna będzie wszechobecna zielona fluorescencja.</li>
<li>Przemywać po 10 minut w kolejnych roztworach metanolu w PBS o stężeniach 30%, 50%, 75% i 100%.</li>
<li>Inkubować przez 30 minut w roztworze 1% H202 w metanolu w celu inaktywacji pierwszej peroksydazy.</li>
<li>Przemywać po 10 minut w kolejnych roztworach metanolu w PBS o stężeniach 75%, 50% i 30%. Następnie przemywać dwukrotnie po 10 minut w PBS. Ważne jest, aby całkowicie usunąć cały metanol.</li>
</ol>
UWAGI DOTYCZĄCE WZMACNIANIA SYGNAŁU TYRAMIDOWEGO: Korzystamy z zestawów TSA firmy Perkin Elmer. Stwierdziliśmy, że podłoża Alexa-Tyramide barwią prawidłowo przy użyciu buforu rozcieńczającego do wzmacniania firmy Perkin Elmer, natomiast nie osiągnęliśmy sukcesu, używając buforu do barwienia dołączonego do zestawów Invitrogen/Molecular Probes. Ponadto zauważyliśmy, że fluorescencja Cy5 zostaje usunięta przez następującą po niej obróbkę Metanol/H2O2, podczas gdy fluoresceina i Alexa-647 pozostają niewrażliwe. Cy3 może również ulec negatywnemu wpływowi obróbki Metanol/H2O2, ponieważ jest strukturalnie powiązany z Cy5. Z tego powodu reakcje TSA z użyciem Cy3 i Cy5 powinny być stosowane wyłącznie podczas drugiej reakcji barwienia w podwójnym protokole fluorescencyjnym in situ.
8. INKUBACJA PRZECIW CIAŁA ANTI-Digoxygenin
<ol>
<li>Ponownie zablokuj zarodki przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) w roztworze 1x buforu kwasu maleinowego z dodatkiem 2% odczynnika blokującego.</li>
<li>Dodaj przeciwciało anty-DIG POD dostarczone przez firmę Roche w rozcieńczeniu 1:1000 w powyższym roztworze blokującym.</li>
<li>Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC. Podczas inkubacji probówkę do mikrocentryfugi układamy na boku.</li>
<li>Przemyj 4 x 20 minut w 1x buforze kwasu maleinowego. Przemyj dwukrotnie po 5 minut w PBS.</li>
</ol>
9. WYKRYWANIE SONDY ZNAZNACZONEJ Digoxygeniną
<ol>
<li>Inkubować przez 30-60 minut w roztworze TSA Plus Cy5 (przed przygotowaniem roztworu barwiącego należy odwirować substrat TSA. W celu przeprowadzenia reakcji odczyn tyramidowy należy rozcieńczyć 1:50 w buforze rozcieńczającym do amplifikacji). Podczas tej inkubacji probówkę do mikrocentryfugi kładziemy poziomo. Czas reakcji musi zostać dobrany empirycznie dla każdej sondy.</li>
<li>Przemyć trzy razy, po 10 minut każdy, w PBST.</li>
</ol>
10. BARWIENIE JODKIEM PROPIDYNYM
<ol>
<li>Przemyć dwukrotnie przez 5 minut za każdym razem w 2 x SSC.</li>
<li>Inkubować zarodki przez 30 minut w temperaturze 37°C w 50 μl 2 x SSCT z dodatkiem 10 μl RNAse (do uzyskania końcowego stężenia 100μg/ml).</li>
<li>Przemyć sześciokrotnie przez 3 minuty za każdym razem w 2 x SSC w temperaturze pokojowej (RT).</li>
<li>Barwić zarodki przez 8 minut w roztworze jodku propidyny o stężeniu 330µg/ml w 2 x SSC.</li>
<li>Przemyć sześciokrotnie przez 3 minuty za każdym razem w 2 x SSC w temperaturze pokojowej (RT).</li>
<li>Utrwalić przez 20 minut w 4% PFA w PBS w temperaturze pokojowej (RT).</li>
<li>Przemyć dwukrotnie, przez 5 minut za każdym razem, w PBST w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
11. MONTAŻ
<ol>
<li>Inkubuj zarodki przez 10 minut najpierw w 25%, a następnie w 50% glicerolu w PBST. Prześwietlaj przez noc w 75% glicerolu w temperaturze 4ºC.</li>
<li>Przeprowadzamy sekcję i usuwamy żółtko z zarodków, a następnie montujemy je płasko na szkiełku przedmiotowym. Żółtko może generować znaczną fluorescencję tła. Sekcja jest znacznie łatwiejsza po tym, jak zarodki zostały prześwietlone przez noc w glicerolu.</li>
</ol>
ROZTWORY:
<table border="1">
<tbody >
<tr >
<td >PBST</td >
<td >PBS plus 0,1% Tween</td >
<td > </td >
</tr >
<tr >
<td >SSCT</td >
<td >SSC plus 0,1% Tween</td >
<td > </td >
</tr >
<tr >
<td >HYB-</td >
<td >50% formamid 5xSSC 0,1% Tween-20</td >
<td > </td >
</tr >
<tr >
<td >HYB+</td >
<td >HYB- 5mg/ml RNA z drożdży torula 50μg/ml heparyny</td >
<td style="width: 300px;">RNA z drożdży torula przygotowuje się poprzez trawienie RNA proteinazą K z następującą ekstrakcją fenolem, fenolem i chloroformem oraz chloroformem. RNA jest wytrącane i rozpuszczane w wodzie traktowanej DEPC.</td >
</tr >
<tr >
<td >1 x bufor kwasu maleinowego</td >
<td >150mM kwasu maleinowego, 100mM NaCl (pH 7,5)</td >
<td > </td >
</tr >
</tbody >
</table>
<img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="Mikroskopia fluorescencyjna genów deltaC i her1; wzorzec ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego." width="600" height="688" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rycina 1. Reprezentatywne wyniki podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w całym preparacie. (A-C). Obrazy przedstawiają pojedynczy przekrój konfokalny przez tylny region zarodka danio pręgowanego w stadium dziesięciu somitów. Widok grzbietowy, góra odpowiada kierunkowi przedniemu. Jądra barwione jodkiem propidyny są koloru niebieskiego. (A) mRNA deltaC wykryto przy użyciu ryboproby znakowanej digoksygeniną i odczynika TSA-Cy5. (B) mRNA transkrybowane z genu her1 wykryto za pomocą ryboproby znakowanej fluoresceiną i odczynika TSA-fluoresceina. (C) Nałożenie kanałów zielonego i czerwonego jednoznacznie identyfikuje obszary odrębnej lub nakładającej się ekspresji tych dwóch genów. (D, E) Detal ekspresji her1 demonstrujący wysoką rozdzielczość tej procedury. Wyraźnie można rozpoznać subkomórkową lokalizację mRNA. Grot strzałki wskazuje komórkę wykazującą aktywną transkrypcję, widoczną jako kropki barwienia w jądrze. Strzałki wskazują komórkę wykazującą cytoplazmatyczną lokalizację mRNA. (F, G) Podwójne barwienie na her1 i deltaC ujawnia komórki transkrybujące oba geny (biały grot strzałki) lub tylko jeden z nich (czerwone i zielone groty strzałek).

<ol><li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li>
<li>Jülich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beamter%2FdeltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation%2C+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li>
<li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming%2C+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
</ol>

Przedstawiony tutaj protokół sprawdza się w przypadku sond, które dają wyraźny i silny sygnał po 30–45 minutowym barwieniu w typowej reakcji z udziałem fosfatazy alkalicznej. Przed przeprowadzeniem protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ zawsze testujemy sondy, korzystając ze standardowego protokołu niefluorescencyjnego (dostępnego w materiałach uzupełniających wraz z protokołem syntezy sond). Uzyskano mniejszy sukces w zastosowaniu protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ przy użyciu słabszych sond, choć ...

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd, roztwór 16%, stopień EM</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć do 4% w 1,33x PBS (stężenie końcowe 1x). Przechowywać w aliquotach 2ml w temp. &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, stopień PCR</td><td>Roche Group</td><td>03115879001</td><td>Przygotować roztwór stokowy 20mg/ml w wodzie. Przechowywać w aliquotach 1ml w temp. &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Przygotować 10% roztwór stokowy w 1x buforze kwasu maleinowego. Przechowywać w aliquotach 50ml w temp. &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C. Stabilny po wielokrotnym zamrażaniu i rozmrażaniu.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fluoresceina-POD, fragmenty Fab</td><td>Roche Group</td><td>11426346910</td><td>Podzielić na aliquoty i przechowywać w temp. -20&amp;#x00B0;C. Jedną alikwotę roboczą przechowywać w temp. 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-digoksygenina-POD, fragmenty Fab</td><td>Roche Group</td><td>11207739910</td><td>Jak wyżej.</td></tr><tr><td>System TSA Plus Fluorescein</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL741001KT</td><td>Przygotowywać każdą fiolkę odczynnika TSA dopiero w razie potrzeby. Rozpuścić w 60&amp;#x03BC;l DMSO. Przechowywać w temp. 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>System TSA Plus Cyanine5</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL745001KT</td><td>Jak wyżej</td></tr><tr><td>System TSA Plus Cyanine3</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT</td><td>Jak wyżej</td></tr><tr><td>Zestaw TSA #16 tyramida AlexaFluor647 (plus HRP-kozie przeciwciało anty-królicze IgG)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T20926</td><td>Rozpuścić odczynnik tyramidowy w 150&amp;#x03BC;l DMSO, podzielić na aliquoty i przechowywać w temp. &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz i DNaz</td><td>Roche Group</td><td>11119915001</td><td>Dostarczana jako roztwór 500&amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>P-3566</td><td>Dostarczany jako roztwór 1mg/ml w wodzie.</td></tr></tbody></table>

wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Montaż całego preparatuin situhybrydyzacja jest jedną z najpowszechniej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj wysokorozdzielczą podwójną fluorescencyjnąin situprotokół hybrydyzacji służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz do określenia nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Protokół ten jest zmodyfikowaną wersją standardowejin situhybrydyzacja z wykorzystaniem fosfatazy zasadowej i substratów takich jak NBT/BCIP oraz Fast Red1,2Niniejszy protokół wykorzystuje standardowe sondy znakowane digoksygeniną i fluoresceiną wraz z tyramidową amplifikacją sygnału (TSA)3Dostępne komercyjnie zestawy TSA umożliwiają elastyczne projektowanie eksperymentów, ponieważ emisję fluorescencji od zielonej do dalekiej czerwieni można stosować w połączeniu z różnymi barwnikami jądrowymi, takimi jak jodek propidyny, lub z fluorescencyjną immunohistochemią białek. TSA wytwarza reaktywny substrat fluorescencyjny, który szybko wiąże się kowalencyjnie z grupami, zazwyczaj resztami tyrozyny, znajdującymi się w bezpośrednim sąsiedztwie znakowanej antysensownej sondy rybo-probe. Uzyskane wzory barwienia charakteryzują się wysoką rozdzielczością, co pozwala na obserwację subkomórkowej lokalizacji mRNA przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej laserem.3,4Można zaobserwować powstające transkrypty w locus chromosomowych, odróżnić barwienie jądrowe od cytoplazmatycznego oraz zwizualizować inne wzorce, takie jak kortykalna lokalizacja mRNA. Badania wDrosophilawskazuje, że około 70% mRNA wykazuje specyficzne wzorce lokalizacji subkomórkowej, które często korelują z funkcją kodowanego białka5W połączeniu z rekonstrukcją zestawów danych konfokalnych 3D wspomaganą komputerowo, nasz protokół umożliwia szczegółową analizę rozkładu mRNA z rozdzielczością podkomórkową w całych embrionach kręgowców.

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization) jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. W niniejszej pracy przedstawiamy wysokorozdzielczą podwójną...

Niniejsza procedura pozwala na określenie wzorców ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego z wysoką rozdzielczością; sonda rybonukleinowa antysensowna hybrydyzuje z komplementarnym docelowym mRNA. Znakowana sonda rybonukleinowa jest rozpoznawana przez przeciwciało sprzężone z enzymem peroksydazą; do embrionów dodaje się fluoro-4 sprzężony z amidą, a peroksydaza przekształca IDE w wysoce reaktywny związek. Prowadzi to do stabilnego osadzania fluoro-4; niezwiązane IDE zostaje wypłukane, co ujawnia szczegółowy subkomórkowy wzorzec rozmieszczenia mRNA.Ekspresję drugiego genu można zaobserwować, używając sondy znakowanej w wyraźny sposób oraz innego fluoroforu, co pozwala na szczegółowe porównanie ekspresji. Cześć, jestem Tim Brent z laboratorium Scotta Holly w Katedrze Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Yale. Dzisiaj przedstawimy procedurę wysokorozdzielczej podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w całym preparacie embrionów zebrafish w warunkach laboratoryjnych.Niniejszą procedurę stosujemy do badania segmentacji u danio pręgowanego. Przejdźmy zatem do realizacji. Procedurę rozpoczynamy od embrionów, które były utrwalane przez noc w niskiej temperaturze w paraformaldehydzie.Użycie świeżo rozmrożonego roztworu zapasowego paraformaldehydu do tej fiksacji jest kluczowe dla uzyskania poprawnego barwienia. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć embriony w temperaturze pokojowej dwukrotnie po pięć minut za każdym razem w PBS. Następnie usunąć chorion embrionów.Zarodki umieszcza się w szklanych płytkach z zagłębieniami. Używając pęsety zegarmistrzowskiej, należy od tego momentu usunąć chorion. Do przenoszenia zarodków należy użyć szklanej pipety pasterowskiej polerowanej ogniowo.W przeciwnym razie zarodki przykleją się do zwykłych końcówek z polipropylenu. Odchlorowane zarodki przenosi się poprzez serię przemywań w roztworach metanolu o rosnącym stężeniu. Ostatnie przemywanie odbywa się w 100% metanolu.Na koniec zarodki umieszcza się w świeżym metanolu i przechowuje w temperaturze -20°C przez noc. Następnego dnia zarodki przenosi się przez serię płukań w roztworach o malejącym stężeniu metanolu oraz dwa razy płucze w buforze PBST przez 5 minut. Następnie zarodki utrwala się w paraformaldehydzie przez 20 minut.Krótką fiksację zakończ dwukrotnym, pięciominutowym płukaniem w roztworze PBST. Teraz możemy przejść do permeabilizacji embrionów. Utrwalone embriony stają się przepuszczalne po inkubacji z proteiną ACE K. Upewnij się, że probówka do mikrowirówki leży na boku.Czas trwania etapu trawienia zależy od wieku embrionu. Na przykład embriony w stadium agenezy somatycznej inkubuje się przez trzy do czterech minut. Krótko przepłucz w PBST, a następnie raz przemyj w PBST przez pięć minut.Utrwal zarodki w paraformaldehydzie. Na koniec przemyj zarodki dwukrotnie w PBST przez pięć minut. Zarodki są teraz gotowe do hybrydyzacji z sondami RNA.Po utrwaleniu i permeabilizacji embrionów rozpoczynamy proces hybrydyzacji od pięciominutowej inkubacji w roztworze HI- w temperaturze 65°C. Należy pamiętać o uprzednim podgrzaniu roztworu HI- przed użyciem. Następnie embriony inkubuje się w roztworze HI+ przez jedną godzinę.Ponownie przypominamy o konieczności wstępnego podgrzania roztworu Hyb+ . Teraz należy usunąć większość roztworu Hyb+, pozostawiając 50 µL, upewniając się, że embriony są całkowicie zanurzone. Następnie należy dodać po 1 µL każdej sondy i wymieszać, delikatnie stukując probówką.Od tego momentu należy przykryć probówki folią aluminiową. Ponieważ flurorescyna jest światłoczuła, a hybrydyzacja przebiega podczas inkubacji przez noc w temperaturze 65 °C, proces ten zostaje zakończony. Przejdźmy teraz do usunięcia nadmiaru sond.Detergent zostaje usunięty w celu poprawy barwienia. Należy jednak zauważyć, że wobec braku detergentu zarodki stają się lepkie. Przemyć dwukrotnie roztworem 50% formamid w 2X SSC, za każdym razem przez 30 minut.Przemyj raz i dwa razy roztworem 2X SSC przez 15 minut. Na koniec przemyj dwa razy roztworem 0,2X SSC przez 30 minut za każdym razem. Następnie zwizualizujemy każdą sondę.Teraz możemy rozpocząć detekcję zhybrydyzowanych sond. Najpierw należy wykryć sondę fluoresceinową, ponieważ jest ona mniej stabilna i słabsza niż sonda z digoksygeną. W pierwszej kolejności przeprowadź blokowanie, dodając 500 µL 2% odczynnika blokującego w buforze kwasu maleinowego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie dodać przeciwciało antyfluoresceinowe sprzężone z peroksydazą w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Należy upewnić się, że probówka do mikrocentryfugi leży na boku.Następnie należy rozpocząć detekcję przy użyciu systemu wzmacniania sygnału tyrom lub TSA TYROM, w którym IDE jest sprzężone z fluoroforem. Peroksydaza chrzanowa znajdująca się na przeciwciele przekształca TY IDE w wysoce reaktywny produkt pośredni. Reaktywne TY IDE tworzy wiązanie kowalencyjne z resztami znajdującymi się w bliskim sąsiedztwie przeciwciała, co skutkuje lokalnym osadem fluoroforu.Zacznij od czterech 20-minutowych przemyć w jednokrotnym buforze kwasu maleinowego w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj dwa razy w PBS. Fluoresceinowy TY IDE został wcześniej rozpuszczony w DMSO w celu przechowywania. Krótko odwiruj ten substrat TSA.Następnie rozcieńcz substrat TSA w stosunku 1:50 w buforze rozcieńczającym do amplifikacji. Dodaj roztwór do embrionów i inkubuj przez 45 minut. Połóż probówkę do mikrocentryfugi na boku.Podczas tego etapu inkubacji należy poddać embriony serii 10-minutowych przemywań w roztworach metanolu o rosnącym stężeniu. Ostatnie przemywanie trwa 10 minut w 100% metanolu. Następnie inkubować przez 30 minut w roztworze 1% nadtlenku wodoru w celu inaktywacji peroksydazy obecnej na przeciwciele. W przeciwnym razie może ona zakłócić detekcję digoksygenu.Przenieś zarodki za pomocą sondy przez serię przemyć z malejącym stężeniem metanolu oraz dwa 10-minutowe przemycia buforem PBS. Zapewnia to całkowite usunięcie metanolu. Oznaczanie przeciwciałami digoxigenu i sondy rozpoczyna się od blokowania, analogicznie jak w przypadku poprzedniego przeciwciała.Następnie dodaj przeciwciało anty-digoksygieninę w rozcieńczeniu 1:1000. Połóż probówkę do mikrocentryfugi na boku i inkubuj przez noc w niskiej temperaturze. Następnego dnia przemyj próbkę w temperaturze pokojowej buforem kwasu maleinowego.Następnie za pomocą PBS szybko przepłukać substrat SCI five tyrom. Rozcieńczyć go w stosunku 1:50 i dodać do embrionów. Inkubować przez 45 minut, kładąc probówkę na boku.Na koniec przemyj próbkę trzykrotnie w PBST. Końcowy etap barwienia jodekiem propidium służy do znakowania jąder komórkowych. Rozpocznij od dwóch pięciominutowych płukań w 2XSSC.Następnie inkubować z RNA przez 30 minut w temperaturze 37°C. Przemyć sześciokrotnie w roztworze 2X SSC w temperaturze pokojowej, a następnie dodać roztwór jodku propidyny i barwić przez osiem minut. Przemyć sześciokrotnie w roztworze 2X SSC.Utrwal embriony w paraformaldehydzie przez 20 minut. Następnie przeprowadź dwa pięciominutowe płukania w PBST. Przygotowanie embrionów do obserwacji rozpoczyna się od dwóch 10-minutowych inkubacji w 25% oraz 50% glicerolu.Następnie umieść próbki w 75% glicerolu i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten nocny etap przejaśniania ułatwia sekcję embrionów. Na koniec przeprowadź sekcję i usuń żółtko z embrionów.Aby zredukować fluorescencję tła, należy zamocować embriony płasko na szkiełku przedmiotowym i zbadać je pod mikroskopem. Przedstawione obrazy ukazują pojedynczy przekrój konfokalny przez tylny koniec embrionu zebrafish na etapie 10 somytów. Czerwone barwienie wskazuje mRNA delta C wykryte za pomocą sondy znakowanej digoksigeniną oraz odczynnika TSA sci-fi.Zielone barwienie reprezentuje jeden mRNA wykryty za pomocą sondy znakowanej fluoresceiną. I odczynnik TSA fluorescein, a jądra barwione jorkiem propidylo są koloru niebieskiego w podwójnie barwionym embrionie.Można jednoznacznie określić obszary odrębnej lub nakładającej się ekspresji. Ta procedura ujawnia subkomórkową lokalizację mRNA, co widać na tych zbliżeniach barwienia. Aktywna transkrypcja genu jest widoczna jako kropki barwienia w jądrze komórkowym.Inne komórki wykazują cytoplazmatyczną lokalizację mRNA. W zarodku poddanym podwójnemu barwieniu można zaobserwować komórki transkrybujące oba geny lub tylko jeden z nich.Osobno przedstawiliśmy sposób przeprowadzenia wysokorozdzielczej podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w preparatach całych embrionów ryb zebrafish. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że najpierw testujemy sondy za pomocą standardowego barwienia z wykorzystaniem fosfatazy alkalicznej; sondy dające czysty i silny sygnał będą działać prawidłowo w fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.Z sukcesem zastosowaliśmy również immunolokalizację beta-kateniny zamiast barwienia jodkiem propidyny. W przypadku tej modyfikacji reakcje hybrydyzacji przeprowadzamy w temperaturze 55 °C zamiast 65 °C. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

zebrafish-whole-mount-high-resolution-double-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kurczyk całkowitej gęstości wysokiej rozdzielczości podwójne fluorescencyjne in situ hybrydyzacja

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Gruczoł międzynerkowy u danio pręgowanego jest teleosteańskim odpowiednikiem nadnerczy ssaków. Protokół ten przedstawia, jak przeprowadzić test aktywności enzymatycznej dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej (izomerazy Δ5-4; 3β-Hsd), który wykrywa zróżnicowane komórki steroidogenne u rozwijającego się danio pręgowanego.

Wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Poznaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia wizualizację wzorców ekspresji genów i ich nakładania się w biologii rozwoju.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Przeglądaj więcej filmów