Name: Brama do mózgu: preparacja oka naczelnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę preparacji siatkówki małpy naczelnej w celu badania jej struktury anatomicznej i procesów starzenia. Technika ta pozwala na szczegółową analizę warstw komórkowych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Ikielowi Ptito za wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni Frankowi Ervinowi, Robercie Palmour oraz personelowi Behavioural Sciences Foundation Laboratories znajdującym się w St Kitts, na Antylach Zachodnich, za nieustające wsparcie naszych prac nad naczelnymi.

Część 1: Obróbka wstępna tkanki
<ol>
<li>Tkanka powinna być dobrze przepłukana paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Można to osiągnąć poprzez standardową perfuzję transkardialną, zazwyczaj stosowaną podczas pobierania innych narządów. Zaleca się, aby krótko po uśmierceniu zwierzęcia wstrzyknąć utrwalacz do oczu tuż pod soczewkę, a następnie przechowywać je w utrwalaczu.</li>
<li>W niniejszym badaniu obiekt głęboko uspokojono za pomocą chlorowodorku ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśmiercono przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddano perfuzji transkardialnej 0.1 M PBS aż do całkowitego upuszczenia krwi. Następnie zastosowano 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 min (~1 liter).</li>
</ol>
Część 2: Usunięcie gałki ocznej z oczodołu
<ol>
<li>Aby ułatwić dostęp do gałki ocznej, zaleca się najpierw usunąć mózg. Po usunięciu mózgu cienkościenna kość oczodołu staje się wyraźnie widoczna. Za pomocą kleszczyków do kości należy powoli odłupywać ścianę oczodołu. Odciąć mięśnie gałki ocznej skalpelem i usunąć tkankę łączną z gałki ocznej. Ostrożnie przeciąć nerw wzrokowy; może on zostać wykorzystany w badaniach z użyciem mikroskopii elektronowej. Gałka oczna powinna zostać teraz uwolniona z jamy oczodołu.</li>
</ol>
Część 3: Wypreparowanie siatkówki z gałki ocznej
<ol>
<li>Umieść oko w szalce Petriego z PBS, aby zapobiec wysychaniu siatkówki. Podczas sekcji pomocny, choć nie niezbędny, jest mikroskop stereoskopowy lub zamontowany na stole statyw z lupą i oświetleniem. Usuń rogówkę, przecinając twardówkę blisko obwodu rogówki na poziomie ora serrata za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie usuń soczewkę pęsetą.</li>
<li>Użyj pędzla, pęsety i nożyczek sprężynowych, aby oddzielić siatkówkę od twardówki. Wykonuje się to poprzez odseparowanie siatkówki od twardówki, a następnie odcięcie twardówki nożyczkami. Proces ten należy przeprowadzać małymi etapami, aby nie uszkodzić i nie przerwać tkanki siatkówki. Twardówka nie oddziela się łatwo od pozostałości nerwu wzrokowego, dlatego należy ostrożnie odciąć twardówkę wokół nerwu wzrokowego.</li>
<li>Na tym etapie siatkówka zachowuje swój zakrzywiony kształt i musi zostać spłaszczona w celu pobrania próbek. Przed spłaszczeniem siatkówki można usunąć w jednej całości ciało szkliste, które ma konsystencję galaretki. Aby spłaszczyć siatkówkę na szkiełku, wykonaj kilka cięć promieniowych ostrzem skalpela. Pozostałości ciała szklistego można teraz usunąć za pomocą zwykłego papieru filtracyjnego i pędzla. Na tym etapie odsłonięta jest warstwa komórek zwojowych siatkówki, dlatego podczas usuwania ciała szklistego niezbędna jest szczególna ostrożność. Jeśli nerw wzrokowy jest nadal przytwierdzony do tarczy nerwu wzrokowego, usuń go za pomocą ostrza skalpela i nożyczek sprężynowych, uważając, aby nie rozerwać siatkówki. Otrzymano w ten sposób preparat siatkówki w montażu płaskim (Rycina 1), a dołek środkowy powinien być widoczny jako ciemna plama w kierunku skroniowym/brzusznym od tarczy nerwu wzrokowego.</li>
</ol>
Część 4: Pobieranie próbek
<ol>
<li>Istnieje szereg opcji pobierania próbek z siatkówki. W tym miejscu opiszemy przygotowanie preparatu typu flatmount oraz pobieranie próbek izodentrycznych. W obu procedurach siatkówkę należy rozłożyć na szkiełku (flatmount) warstwą włókien nerwowych skierowaną od szkiełka. Jeśli celem jest badanie warstwy komórek zwojowych siatkówki w preparacie flatmount, konieczne jest usunięcie lub wybielenie nabłonka pigmentowego. Aby usunąć nabłonek pigmentowy, należy delikatnie użyć pędzla, co jednak ma tendencję do uszkadzania warstwy fotoreceptorów. Wybielanie polega na moczeniu siatkówki w roztworze nadmanganianu potasu (0,25%) przez 1 godzinę, płukaniu w wodzie destylowanej i klarowaniu w kwasie szczawiowym (5%) przez 5 minut.2</li>
<li>Jeśli celem jest badanie rozkładu komórek i morfologii każdej warstwy w całej siatkówce, sugerujemy izometryczne pobieranie próbek z siatkówki. Siatkówkę należy rozłożyć na szkiełku (flatmount) i utrzymywać w wilgotności za pomocą PBS. Do pobierania izometrycznego należy wyciąć małe fragmenty tkanki w równych odległościach od tarczy nerwu wzrokowego w kierunkach: nosowym, skroniowym, górnym i dolnym (Rycina 1). W tym preparacie wybielanie nabłonka pigmentowego nie jest konieczne. Fragmenty te można teraz kroić w płaszczyźnie czołowej za pomocą kriotomu, wibratomu lub ultramikrotomu, w zależności od pytania badawczego. Do krojenia kriotomem fragmenty powinny być krio-chronione w 30% sacharozy przez noc i zamrożone w medium montującym na suchym lodzie. Alternatywnie próbki można zatopić w agarze i kroić na wibratomie. Preparaty z kriotomu i wibratomu pozwalają na uzyskanie przekrojów o grubości nawet 4 m. Jeśli wymagane są cieńsze przekroje (np. do preparacji do mikroskopu elektronowego), konieczne jest przygotowanie próbek do ultramikrotomu. W tym celu przekroje powinny zostać poddane post-fiksacji w tetroksydzie osmu przez 1 godzinę pod wyciągiem. Następnie przeprowadza się odwadnianie w szeregu stężeń etanolu (50, 70, 95, 95, 100, 100%) i 100% tlenku propylenu. Tkankę zatapia się następnie w Epon (zestaw do zatapiania EMBed-812).</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
W naszym laboratorium rutynowo wykonujemy immunohistochemię na krioprzestrojach siatkówki (Rysunek 2). W tym przypadku interesuje nas gęstość receptorów kannabinoidowych (CB1) w siatkówce naczelnych. Badamy również wpływ prenatalnej ekspozycji na etanol na układ wzrokowy naczelnych. W tym celu analizujemy gęstość komórek i grubość warstw w dołeczku środkowym oraz w obwodowej części siatkówki. Aby to osiągnąć, zatapiamy fragmenty siatkówki w Epon, wykonujemy skrawki o grubości 700nm przy użyciu ultramikrotomu i barwimy 1% błękitem toluidyny (Rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="Wynik mikroskopii histologicznej rośliny; analiza struktury komórkowej; badania biologiczne; obraz mikrograficzny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1 Preparat płaski siatkówki. Do spłaszczenia siatkówki zastosowano cięcia radialne.
<img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="Obraz histologiczny warstw siatkówki; schemat przedstawiający strukturę od fotoreceptorów do komórek zwojowych siatkówki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2 Immunobarwienie. Krioprzekrój obwodowej części siatkówki poddany immunobarwieniu na CB1, w którym komórki zwojowe siatkówki wykazują silne znakowanie, z częściowym znakowaniem w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie jądrowej. Grubość przekroju wynosi 14 m; barwienie wykonano bezpośrednio na szkiełku. RG – warstwa zwojowa siatkówki; IP – wewnętrzna warstwa splotowata; IN – wewnętrzna warstwa jądrowa; OP – zewnętrzna warstwa splotowata; ON – zewnętrzna warstwa jądrowa.
<img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopowy warstw siatkówki; oznakowana struktura komórkowa, badanie okulistyczne i histologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 3"> Rycina 3 Dołek środkowy. Przekrój przez dołek środkowy, który został zatopiony w Epon i pocięty na ultramikrotomie na grubość 700nm. Do wyrównania przekrojów wykorzystano warstwę fotoreceptorów (PR). Zauważalna jest pełna rozciągłość fotoreceptorów, co wskazuje na odpowiedni kąt w płaszczyźnie czołowej. Pomiary gęstości wykonano w odległości 300 m, 500 m i 800 m od centrum dołka środkowego przy użyciu systemu obrazowania Bioquant. RG – warstwa zwojowa siatkówki; IP – wewnętrzna warstwa splotowa; IN – wewnętrzna warstwa jądrowa; OP – zewnętrzna warstwa splotowa; ON – zewnętrzna warstwa jądrowa; pasek skali = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

Przygotowanie siatkówki w formie preparatu całego organu (wholemount) umożliwia analizę topografii i rozkładu przestrzennego warstwy komórek zwojowych lub komórek śródbłonka naczyń krwionośnych siatkówki3. Ilościowe określenie gęstości komórek w obwodowej części siatkówki naczelnych jest łatwe do przeprowadzenia. Jednak w obszarach okołopławkowych i w obrębie plamki żółtej nakładanie się wielu warstw w warstwie komórek zwojowych utrudnia kwantyfikację. Aby uniknąć tego potencjalnego błędu, plamkę żółtą oraz ob...

<table><tbody><tr><td>Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Wystarczy dowolny rodzaj nożyczek chirurgicznych</td></tr><tr><td>Kleszczyki kostne</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel z włosia wielbłąda lub sobola</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Układ wzrokowy u ludzi jest uważany za bramę do świata i odgrywa główną rolę w licznych procesach sensorycznych, percepcyjnych i poznawczych. Nie jest zatem zaskakujące, że jakość widzenia jest powiązana z jakością życia. Pomimo szeroko zakrojonych badań klinicznych i podstawowych nad przyczynami zaburzeń widzenia, wiele form upośledzenia wzroku, takich jak retinitis pigmentosa i zwyrodnienie plamki żółtej, nie posiada skutecznych metod leczenia. Naczelne niebędące ludźmi posiadają cechy rozwoju oka najbliższe tym u ludzi. Mają one nie tylko podobną anatomię naczyniową, ale spośród wszystkich ssaków naczelne charakteryzują się unikalną cechą w postaci obszaru w czasowej części siatkówki wyspecjalizowanego pod kątem wysokiej ostrości widzenia, czyli dołka środkowego.1W niniejszej pracy opisujemy ogólną technikę preparowania siatkówki naczelnych w celu pozyskania tkanki do badań histologicznych siatkówki, immunohistochemii, mikrodysekcji laserowej oraz mikroskopii świetlnej i elektronowej. Wraz z coraz szerszym wykorzystaniem naczelnych innych niż człowiek jako modelu translacyjnego, mamy nadzieję, że lepsze zrozumienie budowy i funkcji siatkówki pozwoli na opracowanie skutecznych metod łagodzenia lub odwracania negatywnego wpływu zaburzeń wzrokowych na jakość życia dotkniętych nimi osób.

Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia rozwoju i starzenia się. Organizacja anatomiczna siatkówki naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.

Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

Układ wzrokowy u ludzi jest uważany za bramę do świata i odgrywa główną rolę w niezliczonych procesach sensorycznych, percepcyjnych i poznawczych ...

Procedurę rozpoczyna się od dobrze ukrwionej głowy małpy. Po usunięciu mózgu wypreparowuje się gałki oczne i łączy je. Następnie usuwa się tkanki otaczające, a następnie ostrożnie usuwa rógówki, soczewki, twardówki i ciało szkliste, aby uwolnić siatkówkę.Siatkówkę kładzie się płasko na szkiełku przedmiotowym i usuwa pozostałości ciała szklistego. Następnie pobiera się próbki Iso Dentrix i poddaje je krioterapeutyzacji. Witam, jestem dr Mark Burke z Laboratorium Neuronauk Wizualnych w School of Optometry na Uniwersytecie w Montrealu.Witam, jestem dr Shaheen Zur, również z Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Dzień dobry, jestem dr Tito, dyrektor Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę preparowania siatkówki naczelnego niebędącego człowiekiem.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania różnych aspektów organizacji siatkówki w prawidłowym rozwoju oraz w odpowiedzi na zakłócenia rozwojowe. Przejdźmy zatem do pracy. Protokół należy rozpocząć od głowy naczelnego, która została uprzednio poddana perfuzji.W przypadku stosowania utrwalacza, takiego ja

the-gateway-to-the-brain-dissecting-the-primate-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Brama do mózgu: Analiza oka ssaka naczelnego

Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia prawidłowych procesów zachodzących w mózgu. Organizacja anatomiczna mózgu naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.

Disekcja mózgu naczelnych zwierząt niebędących ludźmi w przestrzeni stereotaksycznej

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Niniejsza prezentacja wideo przedstawia metodę pozyskiwania dwóch najważniejszych, silnie unaczynionych struktur wspierających funkcje przedmózgowia. Są to naczynia powierzchniowe kory mózgowej wraz z powiązanymi z nimi oponami (MAV) oraz sploty naczyniowe, które są niezbędne dla przepływu krwi mózgowej i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).

Wizualny opis sekcji naczyń powierzchniowych mózgowia oraz powiązanych opon mózgowych i splotów naczyniowych z mózgu szczura

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować mózg dorosłego Drosophila - procedura niezbędna do wizualizacji narządu, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez naskórek, oko i tkankę tchawicy. Przykładowy protokół przedstawia szczegółową demonstrację dającą wysokiej jakości preparaty, które można stosować do barwienia immunologicznego i metod obrazowania w neurobiologii Drosophila.

Drosophila Sekcja mózgu osoby dorosłej: metoda w neurobiologii much

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować kompleks oko-mózg od poczwarek Drosophila. Przedstawiony protokół pokazuje, że procedura pozwala uzyskać wysokiej jakości tkankę, kompatybilną na przykład z barwieniem immunologicznym, a także innymi eksperymentami z ekspresją genów.

Rozwarstwienie kompleksu oko-mózg z poczwarek much: metoda izolacji tkanki siatkówki

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Celem tego artykułu i filmu instruktażowego jest opisanie jak odsłonić i usunąć pośmiertny mózg świni i przysadkę mózgową w stanie nienaruszonym, nadającym się do późniejszej analizy makroskopowej i histologicznej.

Ekspozycja OUN świni do analizy histologicznej: podręcznik dekapitacji, otwierania czaszki i usuwania mózgu

Mimika twarzy to sposób komunikacji wizualnej wytwarzany przez mięśnie mimetyczne. W tym miejscu przedstawiamy protokoły dla nowatorskich technik odwrotnej sekcji i DiceCT w celu pełnej wizualizacji i oceny mięśni mimetycznych. Te połączone techniki mogą badać zarówno morfologiczne, jak i fizjologiczne aspekty mięśni mimetycznych w celu określenia aspektów funkcjonalnych.

Odwrotna sekcja i DiceCT ujawniają ukryte dane dotyczące ewolucji twarzy naczelnych

Ten protokół opisuje wykonanie kraniektomii przy użyciu szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej na 3-miesięcznej duńskiej świni rasy Landrace. Dostęp odbywa się przez kość czołową i odsłania brzuszną oponę twardą i leżące poniżej półkule mózgowe. Procedura ta pozwala na dostęp do dużej części mózgu świni.

Dostęp do mózgu świni za pomocą szybkoobrotowej wiertarki pneumatycznej Kraniektomia

Dokładne ubruttowienie i standaryzowane przekroje kul nienowotworowych są ważne dla uzyskania wysokiej jakości powtarzalnych przekrojów histopatologicznych. Wytyczne dotyczące standaryzowanego ubruttowienia kul nienowotworowych dla dorosłych i płodów są podane w niniejszym dokumencie. Zademonstrowano i omówiono różne opcje podziału na kule ziemskie, w tym kryteria podejmowania decyzji w oparciu o konkretne przypadki.

Ubruttowienie kul nienowotworowych, w tym oczu płodu

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę preparacji siatkówki małpy naczelnej w celu badania jej struktury anatomicznej i procesów starzenia. Technika ta pozwala na szczegółową analizę warstw komórkowych siatkówki.

Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

Przeglądaj więcej filmów