Name: Pomiar wydłużenia ściany komórkowej rośliny (pełzania) wywołanego kwaśnym pH i alfa-ekspansyną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę pomiaru pełzania ścian komórkowych roślin przy użyciu ekstensometru o stałej sile. Technika ta pozwala badać wpływ kwaśnego pH i ekspansyn na rozciągliwość ścian komórkowych ogórka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Techniki zaprezentowane w niniejszym materiale zostały opracowane dzięki dofinansowaniu z grantów przyznanych przez Departament Energii (Bioenergy Sciences) oraz Narodową Fundację Nauki (National Science Foundation).

Część 1: Hodowla i przechowywanie odpowiedniego materiału roślinnego
<ol>
<li>Z naszego doświadczenia wynika, że młode podkiełkowie z etiolowanych siewek ogórka stanowią wygodne źródło materiału ścian komórkowych do tych eksperymentów. Nasiona ogórka wysiewa się na mokry papier w świetłoszczelnym pudełku, które umieszcza się w ciemnej szafce w pomieszczeniu o stałej temperaturze ustawionej na 26 °C. Dokładna temperatura nie jest krytyczna, gdyż jakakolwiek wartość między 22° a 30 °C powinna być odpowiednia, jednak temperatura ta determinuje szybkość osiągania przez siewki właściwego stadium rozwoju. Im wyższa temperatura, tym szybciej siewki będą rosnąć. Zazwyczaj wykorzystujemy siewki, gdy osiągną one długość około 5 cm, co następuje 3-4 dni po wysiewie. Ważne jest, aby siewki rosły w ciemności, ponieważ nawet niewielkie ilości światła wpływają zarówno na tempo rozwoju siewek, jak i na właściwości ścian komórkowych, które mierzymy za pomocą tej techniki. W 3. dniu można zajrzeć do pudełka, używając słabego światła z zielonym filtrem, aby sprawdzić stopień rozwoju siewek.</li>
<li>Siewki należy szybko odciąć, zapakować do małych plastikowych pudełek (100-150 siewek na pudełko) i przechowywać w temperaturze -80 °C. W tej temperaturze pozostają one użyteczne przez wiele tygodni.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie próbek ścian komórkowych
<ol>
<li>Małe grupy (8-10) zamrożonych, przeciętych siewek przenosi się z zamrażarki do izolowanego pojemnika zawierającego wkład chłodzący do zamrażarki -80°C.</li>
<li>Kutikula pokrywająca podkiełkusz jest ścierana karborundem. Wykonuje się to poprzez wielokrotne przeciąganie podkiełkusza między kciukiem a palcem wskazującym, które są pokryte gęstą zawiesiną mokrego proszku karborundowego. Wymaga to pewnego doświadczenia, aby dobrać odpowiednią siłę nacisku: zbyt duży nacisk spowoduje poszarpanie i rozerwanie warstwy epidermy, natomiast zbyt mały sprawi, że kutikula nie zostanie przepuszczalna. Należy również pracować szybko, ponieważ zamrożony podkiełkusz podczas rozmrażania staje się wiotki i trudny w manipulacji.</li>
<li>Ścierany podkiełkusz zanurza się w lodowatej wodzie, aby usunąć większość przylegającego karborundu, a następnie przechowuje w lodowatej wodzie, podczas gdy pozostałe podkiełkusze przygotowuje się w podobny sposób.</li>
<li>Podkiełkusze przycina się do pożądanej długości, zazwyczaj 1,2 cm, nowym jednostronnym ostrzem brzytwy, a następnie układa się je równolegle na szkiełku przedmiotowym.</li>
<li>Następnie należy spłaszczyć ściany, aby usunąć sok komórkowy i ułatwić zaciskanie. Drugie szkiełko przedmiotowe kładzie się na wierzchu grupy 8-10 próbek, tworząc kanapkę. Na szkiełku kładzie się obciążnik (400-500 g) na 5 min. Jako obciążnika rutynowo używamy zlewki zawierającej odpowiednią ilość wody.</li>
<li>Krok opcjonalny: W zależności od eksperymentu, podkiełkusze można w tym momencie inaktywować za pomocą krótkiej obróbki termicznej. Aby to zrobić, związujemy szkiełka przedmiotowe gumkami recepturkami, umieszczamy zestaw w pojemniku z 100 mL zdejonizowanej wody w temperaturze pokojowej i wkładamy do kuchenki mikrofalowej na pełnej mocy. W przypadku naszej kuchenki woda zaczyna wrzeć po około 50 s i wyłączamy urządzenie 15 s po rozpoczęciu wrzenia. Gorącą wodę szybko wylewa się i zastępuje zimną wodą, aby zatrzymać denaturację. Może być konieczna zmiana tych czasów, ponieważ Państwa kuchenka mikrofalowa może różnić się od naszej. Przy nadmiernym ogrzewaniu próbki stają się słabe i łatwo pękają. Przy niewystarczającym ogrzewaniu endogenna ekspansyna nie zostaje inaktywowana, a próbki ścian zachowują pewną reaktywność na niskie pH.</li>
</ol>
Część 3: Konfiguracja ekstensometru
<ol>
<li>Próbki ścian komórkowych są teraz zaciskane w ekstensometrze o stałej sile. Jest to urządzenie zbudowane na zamówienie, które składa się z kuwety z Pleksiglasu do utrzymywania podstawowego końca próbki ściany oraz ruchomego zacisku przymocowanego do końca wierzchołkowego próbki. Ruchomy zacisk jest zamontowany na końcu pręta, który przechodzi przez otwarte cewki czujnika położenia LVDT (Linear Variable Differential Transformer), który elektronicznie wykrywa położenie małego metalowego cylindra, tzw. rdzenia, przymocowanego do pręta. Górny koniec pręta jest połączony z dźwignią z regulowanym przeciwwagą. Dźwignia ta wywiera regulowaną siłę skierowaną w górę na próbkę ściany. Siłę reguluje się poprzez dodawanie lub usuwanie skalibrowanych ciężarków metalowych z przeciwległego końca dźwigni.</li>
<li>Wracając do próbki ściany – podstawowy koniec próbki podkotylonu chwyta się precyzyjną pincetą, a ~2-3 mm końca wierzchołkowego umieszcza się pomiędzy otwartymi szczękami ruchomego zacisku. Zacisk ten jest sprężynowym zaciskiem typu krokodylk, którego metalowe szczęki są pokryte plastikiem, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi metalowej powierzchni z roztworem buforowym lub próbką ściany. Z naszego doświadczenia wynika, że jony metali mogą wymywać się z zacisku i hamować zdolność ściany do rozciągania, dlatego metal pozostaje zakryty.</li>
<li>Trzymając zespół ruchomego zacisku w jednej ręce, podstawowy koniec próbki ściany manewruje się pomiędzy dwiema zawiasowymi częściami kuwety z Pleksiglasu, a następnie części kuwety zbliża się do siebie i mocno przykręca, blokując tym samym dolny koniec próbki ściany w kuwecie.</li>
<li>Zespół ruchomego zacisku jest teraz delikatnie zwalniany, co pozwala na przekazanie pełnej siły przeciwwag na próbkę ściany. W przypadku próbek ścian przygotowanych z podkotylonów ogórka rutynowo stosujemy całkowitą przeciwwagę 20 g. Inne materiały ściany lub eksperymenty mogą wymagać zastosowania innych ciężarów.</li>
<li>Kuwetę wypełnia się buforem (200 µL), a położenie kuwety przesuwa się w górę lub w dół za pomocą śruby regulacyjnej tak, aby ruchomy zacisk znalazł się w dolnym zakresie pomiarowym LVDT. Nasz LVDT jest podłączony do jednostki akwizycji danych mikrokomputera, dzięki czemu monitorujemy położenie LVDT za pomocą komputera. Mamy osiem zespołów LVDT podłączonych równolegle do jednego komputera, co pozwala nam na jednoczesne badanie 8 próbek ścian. Komputer rejestruje położenie każdego z zespołów LVDT co 30 s.</li>
</ol>
Część 4: Pomiar odpowiedzi rozciągania na niskie pH lub ekspansynę – reprezentatywne wyniki
<ol>
<li>[Pierwszy eksperyment] W celu pomiaru rozciągania indukowanego kwasem rozpoczynamy od natywnych próbek ścian komórkowych (tj. nieinaktywowanych termicznie) i do kuwety dodajemy bufor obojętny. Próbki ścian rozciągają się przez kilka minut w odpowiedzi na przyłożone naprężenie, jednak po kilku minutach tempo rozciągania spada do niskiej wartości. Nasz komputer pozwala monitorować albo zmianę długości próbki (tj. zmianę pozycji ruchomego zacisku po rozpoczęciu eksperymentu), albo pochodną czasu pozycji, innymi słowy tempo rozciągania. Tempo rozciągania stabilizuje się z czasem na niskim poziomie.</li>
<li>Po około 20 min bufor obojętny jest usuwany. Używamy do tego cienkiej metalowej rurki wykonanej z igły hipodermicznej o dużym rozmiarze, podłączonej do pompy próżniowej, aby szybko usunąć bufor przy minimalnym zakłóceniu ściany lub zespołu mechanicznego. Następnie dodaje się bufor kwasowy, czasami wykonując 1-2 szybkie wymiany, aby zapewnić całkowite przejście na bufor kwasowy. Następnie obserwujemy reakcję ściany. Zazwyczaj szybsze tempo rozciągania można wykryć w ciągu kilku minut. Po 60 min dysponujemy zazwyczaj wystarczającymi informacjami do oceny odpowiedzi w postaci rozciągania, choć w niektórych przypadkach pomiary mogą trwać dłużej.</li>
<li>[Drugi eksperyment] W celu pomiaru rozciągania ściany komórkowej indukowanego przez ekspansynę rozpoczynamy od próbek ścian inaktywowanych termicznie i do kuwety dodajemy bufor kwasowy. Podobnie jak w Pierwszym eksperymencie, tempo rozciągania ściany komórkowej stopniowo stabilizuje się na niskim poziomie ze względu na brak funkcjonalnej ekspansyny.</li>
<li>Po około 20 min do kuwety dodaje się białko ekspansyny poprzez „spikowanie” buforu w kuwecie 10-20 µL roztworu ekspansyny. Ekspansyna szybko przenika do próbki ściany komórkowej i w ciągu kilku minut zauważamy wzrost tempa rozciągania. Tę odpowiedź rozciągania można monitorować przez godzinę lub dłużej.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="Schemat procesu wzrostu i pomiaru wydłużenia etiolowanych siewek ogórka z konfiguracją ekstensometru." width="600" height="469" data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 1: Schemat procedur przygotowania ścian komórkowych w celu oceny rozciągania ścian indukowanego kwasem lub ekspansyną.

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li>
<li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li>
<li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li>
<li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li>
</ol>

W tej demonstracji wykorzystaliśmy ściany komórkowe z podkotylowych części pędów ogórka, ponieważ okazały się one niezawodnym źródłem próbek ścian, które są łatwe w obróbce i wykazują wysoką czułość. Odnieśliśmy również sukcesy w przypadku ścian z innych siewek, a także materiałów dostępnych w supermarketach, takich jak młode liście szpinaku i łodygi selera naciowego. W zasadzie młode, miękkie i szybko rosnące tkanki roślinne prawdopodobnie będą łatwe do pomiaru za pomocą tej techniki, natomiast tkanki twarde, stare, utl...

pomiar rozciągania ściany komórkowej roślin (pełzania) indukowanego niskim ph oraz alfa-ekspansyną

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Ścianki komórkowe rosnących roślin charakteryzują się właściwością znaną jako „wzrost kwasowy” (acid growth), co oznacza, że są one bardziej rozciągliwe przy niskim pH (&lt; 5) 1. Hormon roślinny auksyna szybko stymuluje wydłużanie komórek w młodych łodygach i podobnych tkankach, przynajmniej częściowo poprzez mechanizm wzrostu kwasowego 2, 3. Auksyna aktywuje pompę H+ w błonie plazmatycznej, co powoduje zakwaszenie roztworu w ścianie komórkowej. Zakwaszenie ściany aktywuje ekspansyny, które są endogennymi białkami rozluźniającymi ścianę komórkową 4, co sprawia, że ściana komórkowa ulega naprężeniom wywołanym turgorem komórki. W rezultacie komórka zaczyna się gwałtownie powiększać. Zjawisko „wzrostu kwasowego” można łatwo zmierzyć w izolowanych (nieżyjących) próbkach ścian komórkowych. Zdolność ścian komórkowych do rozciągania indukowanego kwasem nie jest jedynie wynikiem strukturalnego układu polisacharydów ściany komórkowej (np. pektyn), lecz zależy od aktywności ekspansyn 5. Ekspansyny nie wykazują znanej aktywności enzymatycznej, a jedynym sposobem na oznaczenie aktywności ekspansyn jest pomiar indukowania przez nie rozciągania ściany komórkowej. Niniejszy raport wideo szczegółowo opisuje źródła i techniki przygotowania odpowiednich materiałów ściennych do testów ekspansyn, a następnie prezentuje rozciąganie indukowane kwasem oraz rozciąganie indukowane ekspansynami w próbkach ścian przygotowanych z rosnących podkotylowych łodyżek ogórka.
 Aby uzyskać odpowiednie próbki ścian komórkowych, siewki ogórka są hodowane w ciemności, a następnie ich podkotylony są odcinane i mrożone w temperaturze -80 °C. Zamrożone podkotylony są ścierane, spłaszczane, a następnie mocowane pod stałym napięciem w specjalnej kuwecie do pomiarów ekstensometrycznych. Aby zmierzyć rozciąganie indukowane kwasem, ściany są początkowo buforowane w neutralnym pH, co skutkuje niską aktywnością ekspansyn będących składnikami natywnych ścian komórkowych. Po wymianie buforu na taki o kwasowym pH ekspansyny zostają aktywowane, a ściany komórkowe gwałtownie się rozciągają. Wykazujemy również aktywność ekspansyn w teście rekonstytucyjnym. W tej części stosujemy krótką obróbkę termiczną w celu denaturacji natywnych ekspansyn w próbkach ścian komórkowych. Te dezaktywowane ściany komórkowe nie rozciągają się nawet w buforze kwasowym, jednak dodanie ekspansyn do ścian komórkowych szybko przywraca ich zdolność do rozciągania.

Przedstawiamy zastosowanie ekstensometru o stałej sile do pomiaru długotrwałego wydłużenia (pełzania) próbek ścian komórkowych roślin wywołanego przez bufory kwasowe i białko ekspansynę.

Pomiar rozciągania ściany komórkowej roślin (pełzania) indukowanego niskim pH oraz alfa-ekspansyną

Wzrastające ściany komórkowe roślin charakteryzują się właściwością znaną jako „wzrost kwasowy”, co oznacza, że są one bardziej rozciągliwe przy niskim pH (< 5) 1. ...

W niniejszej pracy prezentujemy metody pomiaru rozciągliwości i aktywności poprzez geometrię rozciągania ściany komórkowej. Odpowiednie próbki ścian można przygotować z hipokotyli siewek ogórka poddanych etionowaniem, aby zmierzyć indukowane kwasem rozciąganie, które jest katalizowane przez endogenne ekspansyny związane z natywnymi ścianami komórkowymi. Mocujemy ściany w buforze obojętnym i ekstensometrze; po przełączeniu na kwaśne pH ekspansyny zostają aktywowane, a ściany komórkowe gwałtownie się rozciągają.Prezentujemy również test rekonstrukcji ekspansji. W tej części stosujemy krótką obróbkę termiczną w celu denaturacji endogennych ekspansyn. Termicznie inaktywowane ściany komórkowe nie rozciągają się nawet w buforze kwasowym, jednak dodanie ekspansyny szybko przywraca rozciągliwość ściany.Witam, nazywam się Dan De Roko i pracuję w laboratorium dr. Daniela Cosgrove'a na wydziale biologii Uniwersytetu Penn State. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę pomiaru nieodwracalnego wydłużenia, czyli pełzania, wyizolowanych ścian komórkowych roślin. Zatem zacznijmy.W naszym doświadczeniu młode hipokotyle siewek ogórka stanowią wygodne źródło materiału ściany komórkowej. Do tych doświadczeń nasiona ogórka sieje się na mokrym papierze w świetloodpornym pudełku, które przechowuje się w ciemnej szafce w pomieszczeniu o stałej temperaturze ustawionej na 26 °C. Temperatury między 22 a 30 °C również będą odpowiednie, jednak należy zauważyć, że temperatura determinuje tempo wzrostu.Im wyższa temperatura, tym szybciej będą rozwijać się siewki. Utrzymanie ciemnego środowiska wzrostu jest kluczowe, ponieważ nawet niewielkie ilości światła wpływają zarówno na tempo rozwoju siewek, jak i na właściwości ścian komórkowych, które mierzymy za pomocą tej techniki. Trzeciego dnia można zajrzeć do pudełka, używając słabego światła z zielonym filtrem, aby sprawdzić stopień rozwoju siewek.Zazwyczaj podczas zaglądania do pudełka w trzecim lub czwartym dniu można zauważyć siewki o długości około 5 cm, co zazwyczaj było wartością stosowaną w naszych eksperymentach. Siewki te można zamrozić w temperaturze -80 °C przed użyciem. Aby rozpocząć przygotowywanie próbek ścian komórkowych, małe grupy od 8 do 10 zamrożonych, przeciętych siewek przenosi się z zamrażarki do izolowanego pojemnika zawierającego wkład chłodzący o temperaturze -80 °C. Po pokryciu kciuka i palca wskazującego gęstą zawiesiną z proszku CarboRun, warstwę kutykuli pokrywającą podkiełkowiec usuwa się poprzez wielokrotne pocieranie podkiełkowca między kciukiem a palcem wskazującym.Podczas wykonywania tej techniki krytyczne jest zastosowanie odpowiedniej siły nacisku, która zapewni przenikanie przez kutykulę bez uszkodzenia warstwy epidermy. Należy również pracować szybko, ponieważ w miarę rozmrażania zamrożonego hypo coddle, staje się on wiotki i trudny w obsłudze podczas usuwania większości przylegającego carum. Przetarty hypo coddle jest zanurzany, a następnie przechowywany w wodzie z lodem, podczas gdy przygotowywane są pozostałe hypo coddle.Po usunięciu kutykuli ze wszystkich siewek, są one przycinane do pożądanej długości, zazwyczaj 1,2 centymetrów, za pomocą nowej jednokrawędziowej żyletki, a następnie ustawione na szkiełku przedmiotowym. Drugie szkiełko przedmiotowe kładzie się na grupie od 8 do 10 próbek, a na wierzchu szkiełka umieszcza się obciążenie o masie od 400 do 500 gramów na pięć minut. Zazwyczaj używamy w tym celu zlewki wypełnionej odpowiednią ilością wody.Ciężar zlewki spłaszczy ściany komórek, aby usunąć sok komórkowy i ułatwić zaciskanie. W zależności od eksperymentu, w tym momencie można dezaktywować hypo coddles za pomocą krótkiej obróbki termicznej. Aby to zrobić, wiążemy szkiełka przedmiotowe razem parą gumek recepturek, umieszczamy tak przygotowany zestaw w naczyniu ze 100 mL wody dejonizowanej w temperaturze pokojowej i wkładamy do kuchenki mikrofalowej, ustawiając pełną moc urządzenia.Woda zaczyna wrzeć około 50 sekundy i wyłączamy mikrofalówkę 15 sekund po rozpoczęciu wrzenia, po czym gorącą wodę szybko odlewamy i zastępujemy zimną wodą, aby zatrzymać denaturację. Optymalne ogrzewanie powinno sprawić, że próbki nie będą reagować na niskie pH, a jednocześnie nie staną się zbyt słabe i nie będą łatwo pękać. Próbki ścianek są teraz zaciskane w ekstensometrze o stałej sile X.Jest to urządzenie wykonane na zamówienie, które składa się z pleksiglasowego sześcianu służącego do utrzymania podstawnej części próbki ściany oraz ruchomego zacisku przymocowanego do końca dystalnego (apikalnego) próbki. Ruchomy zacisk jest zamontowany na końcu pręta, który przechodzi przez otwarte cewki czujnika położenia LVDT (liniowego transformatora różnicowego). Czujnik ten elektronicznie wykrywa położenie niewielkiego metalowego cylindra lub rdzenia przymocowanego do pręta.Górny koniec pręta jest połączony z dźwignią z regulowanym przeciwwagą. Dźwignia ta wywiera regulowaną siłę skierowaną w górę na próbkę ściany. Siłę tę reguluje się poprzez dodawanie lub usuwanie skalibrowanych ciężarków metalowych z dalekiego końca dźwigni, aby przygotować próbki do pomiaru ekspansji ściany komórkowej.Podstawę próbki podkotylowej chwyta się cienkimi pęsetą w odległości około dwóch do trzech milimetrów, a koniec szczytowy umieszcza się pomiędzy otwartymi szczękami ruchomego zacisku. Zacisk ten jest sprężynowym zaciskiem typu krokodylk. Metalowe szczęki są pokryte plastikiem, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi powierzchni metalowej z roztworem buforowym lub próbką ściany.Z naszego doświadczenia wynika, że jony metali mogą wymywać się z zacisku i hamować zdolność ściany do rozciągania, dlatego metal pozostaje zakryty. Trzymając zespół zacisku ruchomego w jednej ręce, koniec podstawowy próbki ściany wprowadza się pomiędzy dwa elementy zawiasowe z pleksiglasu, a następnie elementy te zbliża się do siebie i mocno przykręca, blokując w ten sposób dolny koniec próbki ściany w uchwycie. Następnie delikatnie zwalnia się zespół zacisku ruchomego, co pozwala na przekazanie pełnej siły przeciwwag na próbkę ściany. W przypadku próbek ściany przygotowanych z ogórka oraz hypo coddles rutynowo stosujemy całkowitą masę przeciwwagi wynoszącą 20 g.Inne materiały ścianek lub eksperymenty mogą wymagać zastosowania innych obciążeń. QVE wypełnia się buforem, a pozycję QVE przesuwa się w górę lub w dół za pomocą śruby regulacyjnej, tak aby ruchomy zacisk znalazł się na dolnym końcu zakresu pomiarowego LVDT. Nasz LVDT jest podłączony do jednostki akwizycji danych komputera.Użyliśmy ośmiu zestawów LVDT połączonych równolegle z jednym komputerem, co pozwala na jednoczesne badanie ośmiu próbek ściany. Komputer rejestruje pozycję każdego z zestawów LVDT co 30 s w celu pomiaru wydłużenia indukowanego kwasem. Rozpoczynamy od natywnych próbek ściany, które nie zostały inaktywowane termicznie, a do naczynia dodawany jest bufor obojętny.Próbki ściany rozciągają się przez kilka minut w odpowiedzi na przyłożone naprężenie, jednak szybkość rozciągania stopniowo maleje. Po kilku minutach komputer umożliwia nam monitorowanie albo zmiany długości próbki, czyli zmiany położenia ruchomego zacisku po rozpoczęciu eksperymentu, albo pochodnej położenia po czasie. Innymi słowy, szybkości rozciągania.Szybkość rozciągania z czasem stabilizuje się na niskim poziomie. Po około 20 minutach bufor neutralny jest usuwany za pomocą cienkiej metalowej rurki wykonanej z igły hipodermycznej o dużym rozmiarze, która jest podłączona do pompy próżniowej, aby szybko usunąć bufor.Układ ten umożliwia usunięcie buforu przy minimalnym zakłóceniu ściany lub zestawu mechanicznego. Następnie dodaje się bufor zakwaszony, czasami wykonując jeden lub dwa szybkie cykle wymiany, aby zapewnić całkowitą zamianę na bufor zakwaszony. Następnie obserwuje się reakcję ściany.Zazwyczaj szybsze tempo rozciągania można wykryć w ciągu kilku minut. Po 60 minutach dysponujemy zazwyczaj wystarczającymi informacjami, aby ocenić odpowiedź rozciągania, choć w niektórych przypadkach pomiary mogą obejmować dłuższe okresy. W celu pomiaru rozciągania ściany komórkowej indukowanego ekspansyną, rozpoczynamy od próbek ścian inaktywowanych termicznie, a do qve dodajemy bufor kwaśny.Podobnie jak w pierwszym doświadczeniu, tempo rozciągania ściany komórkowej stopniowo stabilizuje się na niskim poziomie z powodu braku funkcjonalnej ekspansyny. Po około 20 minutach rozciągania do próbki w Q vet dodaje się białko, wprowadzając do buforu w Q vet od 10 do 20 µL roztworu ekspansyny. Ponieważ kutykula została usunięta, ekspansyna szybko przenika do próbki ściany komórkowej i w ciągu kilku minut obserwujemy wzrost tempa rozciągania.Reakcję tę można monitorować przez godzinę lub dłużej. Przedstawiliśmy właśnie sposób pomiaru rozciągania ściany komórkowej wywołanego przez endogenne ekspansyny oraz przez dodatek ekspansyn. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować wibracje mechaniczne i wahania temperatury, ponieważ powodują one szumy w krzywych rozciągania.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu testów elongacji.

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rozszerzenie ściany komórkowej roślin (pełzanie) indukowane przez kwaśne pH i przez alfa-ekspansynę

Opisujemy metodę mapowania właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Skupiamy się na tym, jak rejestrować zmiany mechaniczne, które zachodzą w ścianach komórkowych podczas rozwoju roślin w mezoskali szerokopolowej, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i morfogenezą.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego ().  Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Ten raport opisuje podstawowe metody używane do hodowli i eksperymentalnego manipulowania jednokomórkową streptophyte alg, Penium margaritaceum. Zapewnia również podstawowe protokoły obrazowania opartego na mikroskopii, w tym znakowanie żywych komórek za pomocą przeciwciał monoklonalnych i innych sond fluorescencyjnych oraz skaningową mikroskopię elektronową.

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

Poznaj metodę pomiaru pełzania ścian komórkowych roślin przy użyciu ekstensometru o stałej sile. Technika ta pozwala badać wpływ kwaśnego pH i ekspansyn na rozciągliwość ścian komórkowych ogórka.

Pomiar rozciągania ściany komórkowej roślin (pełzania) indukowanego niskim pH oraz alfa-ekspansyną

Przeglądaj więcej filmów