Name: Komórki nabłonka sutka myszy tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Poznaj metodę indukcji różnicowania laktogennego w komórkach nabłonka sutka myszy HC11 poprzez formowanie mammosfer. Protokół umożliwia badanie regulacji różnicowania gruczołu mlekowego in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pracę wsparto środkami z grantu Congressionally Directed Medical Research Fund (DAMD17-01-0264) dla M.L. Cutler oraz United States Military Cancer Institute dla M.L. Cutler.

<ol>
<li>Komórki HC11 hodowano do uzyskania konfluencji przez 6 dni w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej, 5 μg/ml insuliny, 10 mM HEPES oraz 10 ng/ml czynnika wzrostu naskórka (EGF), aby uzyskać odpowiednią kompetencję.</li>
<li>Komórki przemyto buforem PBS i utrzymywano w pożywce wzrostowej bez dodatku EGF przez 24 godziny.</li>
<li>Aby indukować różnicowanie laktogenne, komórki inkubowano w pożywce różnicującej, tj. RPMI z deksametazonem (10-6 M), insuliną (5 μg /ml) i prolaktyną (5 μg /ml), określanej jako DIP.</li>
<li>W wyznaczonych odstępach czasu po dodaniu DIP, mammosfery fotografowano i przeliczano za pomocą mikroskopii kontrastowej przy użyciu mikroskopu Olympus IX71 z kamerą cyfrową.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Na Rysunku 1 przedstawiono odpowiednio: małe powiększenie monowarstw normalnych komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego i licznych mammosfer, a także duże powiększenie pojedynczej mammosfery. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="Tworzenie mammosfer, obraz mikroskopowy; normalna monowarstwa kontra liczne sfery, duże powiększenie." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 1. Mammosfery. (a) Normalne monowarstwy komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego powinny być widoczne jako płaska warstwa konfluencyjnych komórek. (b) Po 3-5 dniach stymulacji DIP pojawiają się liczne mammosfery. Fotografia wykonana 5 dni po dodaniu DIP. (c) Większe powiększenie pojedynczego pola zawierającego mammosfery w 5. dniu po dodaniu DIP.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Aby technika ta była skuteczna i zapewniła najwyższą jakość, komórki nabłonkowe muszą osiągnąć pełną konfluencję przed indukcją hormonami laktogennymi. Mogą wystąpić sytuacje, w których powstaje bardzo wiele mammosfer, co utrudnia ich kwantyfikację. Dlatego w celach ilościowych najlepiej fotografować mammosfery w punkcie czasowym, w którym ich liczba umożliwia dokładne przeliczenie.
Choć do określania stopnia różnicowania laktogennego komórek nabłonka gruczołu mlekowego stosuje się różne mark...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Pł Tk. Bydło (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dekzametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Kamera cyfrowa</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Miara fenotypowa powszechnie stosowana do określenia stopnia różnicowania laktogennego w kulturach komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego myszy to tworzenie struktur komórkowych w kształcie kopuły, nazywanych mammosferami1Linia komórkowa HC11 była wykorzystywana jako modelowy system do badania regulacji różnicowania laktogennego gruczołu piersiowego zarównoin vitroiin vivo 2Komórki HC11 różnicują się i syntetyzują białka mleka w odpowiedzi na działanie hormonów laktogennych. Po osiągnięciu przez mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego HC11 stanu konfluencji, różnicowanie laktogenne indukowano poprzez dodanie kombinacji hormonów laktogennych, w tym deksametazonu, insuliny i prolaktyny, określanej jako DIP. Komórki HC11 poddane indukcji różnicowania były fotografowane w odstępach czasu do 120 godzin po indukcji różnicowania, a następnie policzono liczbę mammosfer, które pojawiły się w każdej hodowli. Wielkość poszczególnych mammosfer koreluje ze stopniem różnicowania, co zostało przedstawione na zdjęciach różnicujących się komórek.

Różnicowanie laktogenne komórek HC11 można scharakteryzować poprzez tworzenie się struktur kopułkowatych, określanych jako mammosfery. Struktury te można zliczyć za pomocą mikroskopii fazowej, co ułatwia ilościowe określenie stopnia różnicowania laktogennego.

Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Powszechnie stosowaną miarą fenotypową służącą do określenia stopnia różnicowania laktogennego w hodowlach komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego myszy jest tworzenie...

Witajcie, jestem Bethany Morrison z laboratorium dr Mary Lou Cutler w Katedrze Patologii na Uniform Services University of the Health Sciences. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę otrzymywania mammosfer z mysich komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego HC 11. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania różnicowania laktogennego.Przejdźmy zatem do rozpoczęcia protokołu. Komórki HC 11 hoduje się do osiągnięcia konfluencji przez sześć dni w pożywce RPMI 1640, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej, 5 µg/mL insuliny, 10 µM HEPES oraz 10 ng/mL epidermalnego czynnika wzrostu (EGF), aby uzyskać kompetencję.Komórki te były szeroko wykorzystywane w laboratoriach Nancy Hines i Bernarda Gronera do badania regulacji różnicowania genicznego w komorze do hodowli tkanek. Następnie komórki są płukane w PBS i utrzymywane w podłożu wzrostowym bez EGF przez 24 godziny. Po tej inkubacji komórki inkubuje się w podłożu do różnicowania składającym się z RPMI uzupełnionego o deksametazon, insulinę i prolaktynę, aby po inkubacji wywołać różnicowanie w kierunku komórek gruczołów mlekowych.W pożywce różnicującej do fotografowania i liczenia mamo sfer wykorzystuje się mikroskop Olympus IX 71 wyposażony w kamerę cyfrową. Za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej mamo sfery są fotografowane i liczone wielokrotnie w ciągu 120 godzin po indukcji. Ten obraz przedstawia małe powiększenie normalnej pamięci.Monowarstwy komórek nabłonkowych muszą być utrzymywane w stanie konfluencji przez około trzy dni przed stymulacją hormonami genicznymi. Oto widok nowo powstałych mammosfer trzy dni po indukcji przy małym powiększeniu. Zaczynają one pojawiać się jako małe, kopulaste struktury rozmieszczone losowo wśród komórek nabłonkowych.Ponownie przy małym powiększeniu. Oto widok na liczne mammosfery, które rozwinęły się pięć dni po indukcji. Mammosfery nadal rosły pod względem rozmiaru i liczby; tutaj, przy dużym powiększeniu, wyraźnie widoczna jest charakterystyczna pęcherzykowata lub kopulasta struktura mammosfery.Właśnie pokazaliśmy, jak indukować komórki nabłonka gruczołowego piersi, aby utworzyły mammosfery, które służą jako markery różnicowania w kierunku linii gruczołowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed indukcją utrzymać komórki w stanie konfluencji, ponieważ w tym czasie komórki produkują białka macierzy, z którymi muszą oddziaływać, aby w pełni reagować na hormony gruczołowe. Należy również pamiętać o usunięciu EGF z medium przed rozpoczęciem zabiegu, ponieważ EGF hamuje proces różnicowania.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

mouse-mammary-epithelial-cells-form-mammospheres-during-lactogenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komórki nabłonkowe sutka mysiego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Ten film opisuje izolowanie komórek macierzystych raka piersi od linii komórkowych raka piersi. Hodujemy te nowotworowe komórki macierzyste w celu wygenerowania pierwotnych mammosfer do oceny samoodnawiania się i obliczania wydajności formowania kul, co pozwala na porównanie różnych gęstości wysiewu.

Wytwarzanie mammosfer pierwotnych: technika określania siły działania komórek

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Opisujemy techniki indukcji różnicowania dwóch linii nabłonka piersi, HC11 i EpH4. Podczas gdy obie wymagają płodowej surowicy cielęcej, insuliny i prolaktyny do produkcji białek mleka, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w mammosfery w trójwymiarowej hodowli. Te uzupełniające się modele są przydatne do badań transdukcji sygnału różnicowania i nowotworu.

Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy

Tutaj opisujemy implementację i interpretację wyników ilościowego testu samoodnawiania mammosfery in vitro.

Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Poznaj metodę indukcji różnicowania laktogennego w komórkach nabłonka sutka myszy HC11 poprzez formowanie mammosfer. Protokół umożliwia badanie regulacji różnicowania gruczołu mlekowego in vitro.

Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Przeglądaj więcej filmów