Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Przedstawiamy system hodowli progenitorów neuronalnych OUN podczas ich rozwoju i różnicowania w dojrzałe neurony oraz glej. Procedura rozpoczyna się od izolacji czterech mózgów z płodów szczura w 16. dniu embrionalnym (E 16) i ich trawienia papainą. Tkanki są rozdrabniane do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, filtrowane, liczone i rozdzielane do sześciu.

Komórki w płytce wielodołkowej są delikatnie resuspensowane raz dziennie przez dwa do trzech dni, aby umożliwić tworzenie się agregatów. Następnie agregaty są zbierane i przesiewane przez sito o oczkach 200 µm, a niewielkie grudki i szczątki komórkowe są usuwane poprzez przemywanie. Na koniec agregaty są liczone i wysiewane na szkiełka nakrywkowe pokryte Matrigelem.

Witam, nazywam się Coto i pracuję w laboratorium dr. Johna L. w Katedrze Zintegrowanych Nauk Biomedycznych Weterynaryjnych na Texas A&M University. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę hodowli agregatów mózgowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania linii endocytów, rozwoju komórek oraz interakcji aksonalnych.

Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem pracy przygotuj na blacie wysterylizowane narzędzia, 70% etanol, podkład higieniczny do pracy oraz 10 centymetrowe szalki Petriego z podłożem do sekcji, schłodzone w lodzie.

W dygestorium przygotuj mikroskop stereoskopowy z platformą chłodzącą oraz kilka 10 centymetrowych szalek z podłożem do sekcji, również schłodzonych na lodzie. Na koniec przygotuj niezbędne roztwory i podgrzej podłoże do wysiewu do 37°C w łaźni wodnej. Protokół rozpoczyna się od pobrania embrionów szczura rasy Sprague-Dawley z 16. dnia embrionalnego (E 16).

W pierwszej kolejności przeprowadź eutanazję ciężarnej samicy zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez instytucjonalną komisję ds. etyki doświadczeń na zwierzętach. Połóż uśpionego szczura na podkładzie chłonnym i spryskaj jego brzuch alkoholem w celu oczyszczenia. Następnie za pomocą pęsety uchwyć skórę brzucha i drugą ręką, używając nożyczek, przetnij samą skórę; rozszerz brzegi nacięcia, a następnie za pomocą drugiej pary wysterylizowanej pęsety i nożyczek przetnij warstwę mięśniową.

Następnie należy usunąć macicę i przenieść ją do szalki o średnicy 10 centymetrów zawierającej lodowate podłoże do sekcji. Kolejny krok wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając mikrosekcyjnych nożyczek. Należy ostrożnie wyjąć każdy embrion z macicy.

Nadszedł czas na pobranie materiału i rozpoczęcie pracy z mózgami embrionalnymi. Pobierz mózg z każdego zarodka i umieść uwolnione organy w czystej szalce o średnicy 10 cm z medium do sekcji, ustawionej na platformie z lodem. Pod mikroskopem sekcyjnym dokończ preparację mózgów.

Usuń sekcje mózgu średniego i tylnego. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń oponę mózgową, a pozostałą część przedmózgowia przenieś do probówki Falcon o pojemności 50 ml zawierającej medium do sekcji. Tkanka jest teraz gotowa do następnego etapu.

Dysocjacja komórek poprzez trawienie enzymatyczne. Tuż przed rozpoczęciem procesu trawienia należy przygotować świeże roztwory propaganu oraz inhibitora trypsyny z filtra. Należy je wysterylizować i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej.

Usunąć nadmiar pożywki z wypreparowanych mózgów. Następnie dodać 4 mL przygotowanego roztworu do trawienia propanem do probówki o pojemności 50 mL. Inkubować probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez dokładnie 5 minut.

Po upływie wyznaczonego czasu należy odessać roztwór propanu za pomocą pipety. Następnie dodać 5 mL świeżo przygotowanego roztworu inhibitora trypsyny i ponownie umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na kolejne dwie do trzech minut. Po upływie tego czasu należy usunąć roztwór inhibitora trypsyny.

Powtórzyć inkubację z roztworem inhibitora trypsyny jeszcze trzy razy. Po ostatnim usunięciu roztworu inhibitora trypsyny, dodać do probówki 20 mililitrów podgrzanego medium pożywkowego pm.

Nadszedł czas na rozbicie skupisk i przemycie komórek. Resuspenduj komórki za pomocą pipety 10 ml, przenosząc ciecz w górę i w dół około 20-30 razy, aż wszystkie skupiska znikną. Następnie wiruj próbkę przy 100 ×g przez siedem minut.

Na tym etapie komórki powinny być od siebie dobrze oddzielone. Po siedmiu minutach należy usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 ml medium do wysiewu w celu przemycia komórek.

Następnie ponownie je odwiruj. Usuń nadsącz i powtórz proces płukania oraz wirowania. Etap po drugim płukaniu.

Resuspenduj osad w 10 ml pożywki do hodowli agregatów, a następnie przefiltruj komórki przez sito komórkowe o oczkach 70 µm. Na koniec policz żywe komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru).

W tym momencie można przystąpić do formowania agregatów z dysocjowanych komórek mózgu. Po zliczeniu komórek, zawiesić je w pożywce do hodowli agregatów z zagęszczeniem 2 × 10⁶ komórek/ml. Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka niepowlekanej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami.

Przez trzy noce każdego dnia należy delikatnie resuspender komórki. Używając pipety P 1000, w dniu wysiewu agregatów komórki zaczną tworzyć skupiska. Po tym, jak komórki urosną przez trzy noce, ponownie delikatnie resuspender komórki i przelać zawiesinę przez sito o oczkach 200 µm do probówki typu Falcon o pojemności 50 mL.

Pozostaw agregaty do osadzenia się na dnie probówki przez około trzy do pięciu minut. Następnie ostrożnie usuń nadsącz, dodaj pożywkę, delikatnie resuspenduj agregaty i pozwól im ponownie osiąść. Powtórz tę procedurę kilka razy.

Aby usunąć martwe komórki, pojedyncze komórki i zanieczyszczenia, należy użyć mikroskopu w celu sprawdzenia, czy w nadsączach wciąż znajdują się niezagregowane komórki i zanieczyszczenia. Po dokładnym wypłukaniu agregatów należy je delikatnie resuspender w tym samym medium i policzyć agregaty, aby określić ich stężenie. Następnie należy dostosować gęstość agregatów do poziomu około 25 do 30 agregatów na 50 µL.

Nadszedł czas na wysianie agregatów na szkiełka podstawowe. Przenieś 1000 µL alikwotów zawiesiny agregatów do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml; ponieważ agregaty mają tendencję do osiadania na dnie probówek, kluczowe jest przygotowanie wielu probówek z zawiesiną agregatów do wysiewu. Szkiełka podstawowe użyte w tym kroku zostały pokryte podłożem do hodowli komórkowej Matrigel poprzez inkubację przez noc w temperaturze 37 °C.

Po przygotowaniu alikwotów zawiesiny agregatów wyjmij z inkubatora płytkę hodowlaną zawierającą szkiełka podstawowe pokryte Matrigel. Usuń roztwór z każdej dołki. Przemyj szkiełka podstawowe ciepłym PBS, a następnie DD H2O.

Są one teraz gotowe do wysiewu agregatów w celu obsiania szkiełka podstawowego. Odwróć probówkę z zawiesiną agregatów, aby wymieszać i równomiernie rozprowadzić agregaty. Następnie nanieś 50 µL zawiesiny agregatów na środek każdego szkiełka podstawowego.

Ostrożnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, unikając dalszych zakłóceń, aby agregaty mogły równomiernie przytwierdzić się do szkiełka podstawowego. Gęstość agregatów ma kluczowe znaczenie; jeśli agregaty znajdują się zbyt blisko siebie lub jeśli gęstość ich rozmieszczenia jest wysoka, mają one tendencję do łączenia się w miarę wzrostu od czterech do sześciu godzin po początkowym osadzeniu. Do każdej studni dodaj 500 µL pożywki hodowlanej.

Aby utrzymać kulturę agregatów, należy wymieniać połowę pożywki co trzy do czterech dni. Podczas wymiany pożywki należy dodawać ją wzdłuż ścianki dołka, aby uniknąć rozbicia agregatów. Kilka godzin po przytwierdzeniu się agregatów do szkiełka nakrywkowego można zaobserwować ich rozrost.

Aksony szybko rosną w ciągu pierwszych dwóch tygodni i tworzą liczne połączenia między agregatami. Progenitory Ggl migrują promieniście z agregatów i z czasem różnicują się w astrocyty oraz dojrzałe oligodendrocyty. Właśnie pokazaliśmy, jak hodować agregaty CS.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym dozowaniu objętości i równomiernym wymieszaniu agregatu. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.