Name: Przygotowanie kultur agregatów mózgów szczurów do badań nad rozwojem neuronów i gleju (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kultur agregatów mózgów szczurów do badań nad rozwojem neuronów i gleju. Protokół obejmuje izolację tkanek E16, trawienie enzymatyczne oraz hodowlę progenitorów CNS różnicujących się w neurony i komórki glejowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było częściowo finansowane z funduszy startowych Texas A&amp;M University

Przygotowanie przed sekcją
Narzędzia chirurgiczne: wszystkie nożyczki do sekcji i pincety należy wysterylizować w autoklawie
Czyszczenie szkiełek nakrywkowych:
<ol>
 <li>Namoczyć wszystkie szkiełka nakrywki (o średnicy 15 mm dla płytki 24-dołkowej) w zlewce szklanej o pojemności 1 L w 33% HCl przez co najmniej 24 h</li>
 <li>Przemywać pod bieżącą wodą przez 10 min, okazjonalnie potrząsając, aby usunąć wszelkie pozostałości HCl</li>
 <li>Opłukać wodą z systemu Millipore</li>
 <li>Odlać wodę</li>
 <li>Namoczyć szkiełka nakrywki w etanolu 95-98%</li>
 <li>Przenieść szkiełka nakrywki na czystą chusteczkę na płaskiej powierzchni i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu</li>
 <li>Przenieść szkiełka nakrywki do zlewki szklanej, przykryć folią aluminiową i poddać autoklawowaniu 
 Uwaga: Szkiełka nakrywki można na tym etapie przechowywać</li>
 <li>Umieścić pojedyncze szkiełka nakrywki w płytkach hodowlanych. Są one gotowe do powlekania</li>
 </ol>
Powlekanie szkiełka nakrywki:
 <ol>
 <li>Rozcieńczyć 100-krotny roztwórstok poly-D-lizyny (PDL, 10 mg/ml w 0,5% albuminie surowicy bydlęcej w PBS, przechowywany w aliquotach w -20°C) za pomocą PBS i wysterylizować przez filtr (0,22 μm)</li>
 <li>Pokryć szkiełka podstawowe 1-krotnym roztworem PDL (~ 0,15 ml/cm2) przez 2 h w temperaturze 37°C w inkubatorze</li>
 <li>Usunąć roztwór PDL, wypłukać 3 razy sterylną wodą ddH2O i całkowicie wysuszyć szkiełka podstawkowe</li>
 </ol>
Uwaga: Należy pokryć odpowiednią liczbę szkiełek nakrywkowych/płytek dla każdej sekcji. Szkiełka nakrywkowe pokryte PDL można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4°C.
Pożywki i roztwory
Pożywka do sekcji (DM): użyć sterylnego, schłodzonego do temperatury lodu zrównoważonego roztworu soli Hanksa (bez Ca2+, Mg2+) (HBSS, Invitrogen 14175) uzupełnionego o 10 mM HEPES (Invitrogen 15630).
Pożywka do hodowli agregatów: Pożywka DMEM/NBB27 zawiera DMEM/Neurobasal (1:1 obj:obj), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM pirogronianu sodu, 0,75mM GlutaMAX, 60μg/ml N-acetylocysteiny, 5 μg/ml insuliny, 10nM d-biotyny oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Aby przygotować 100 ml pożywki do hodowli agregatów, zmieszać 50 ml DMEM (bez pirogronianu/glutaminy, Invitrogen 11960), 50 ml pożywki Neurobasal (Invitrogen 211034), 375 μl GlutaMax (100 x, Invitrogen 35050), 5,5 mg pirogronianu sodu (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17504), 6,3 mg N-acetylocysteiny (Sigma A8199), 1 ml roztworu Sato (stok 100 x, patrz poniżej), 25 μl roztworu d-biotyny (stok 4000 x, 40 μM w PBS, przechowywany w alikwotach w -20°C, Sigma B4639), 100 μl insuliny (stok 1000 x, 5 mg/ml w 0,01N HCl, przechowywany w alikwotach w -20°C, Sigma 16634) oraz 1 ml penicyliny/streptomycyny (stok 100 x, Invitrogen 15140), wysterylizować przez filtr i przechowywać w 4°C.
Roztwór stokowy Sato 100x: Aby przygotować 40 ml roztworu stokowego: zmieszać 40 ml Neurobasal z 400 mg apo-transferyny (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 μl progesteronu (25 mg/ml w etanolu, przechowywanego w alikwotach w temperaturze -20°C, Sigma P8783), 64 mg putrescyny (Sigma P7505) oraz 40 μl selenicyanu sodu (30 μM w PBS, przechowywanego w alikwotach w temperaturze -20°C, Sigma S5261). Roztwór stokowy Sato należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C.
Pożywka do wysiewu neuronów (PM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2mM glutaminy (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C, Invitrogen 25030), 25μM kwasu glutaminowego (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. 
Pożywka do hodowli neuronów (CM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2mM glutaminy (stok 100x, alikwoty przechowywane w -20°C) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. 
Zapas 5-FdU: stężenie 100x, 1mM 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (Sigma F0503) i 1mM urydyny (Sigma U3003) w podłożu Neurobasal. Sterylizowane przez filtrowanie i przechowywane w alikwotach w temperaturze -20°C.
Roztwór do trawienia papainą (przygotować świeżo przed sekcją): 
<ol>
 <li>Rozpuścić 3.2 mg L-Cysteine (Sigma C-7352) w 4ml DM</li>
 <li>Doprowadzić pH do poziomu około 7.4 za pomocą 1N NaOH (sprawdzić za pomocą pasków pomiarowych pH) i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C 
Uwaga: Kolejny krok należy wykonać bezpośrednio przed trawieniem tkanki (patrz poniżej).</li>
 <li>Dodać papainę do stężenia końcowego 20 unit/ml</li>
 <li>Przeprowadzić sterylizację przez filtrowanie (0.22mm) i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C </li>
</ol>
Roztwór inhibitora trypsyny (przygotować świeży przed sekcją):
<ol>
 <li>Rozpuścić 0,2 g inhibitora trypsyny (Sigma T7295) w 20 ml DM </li>
 <li>Sprawdzić pH i skorygować pH do ~7,4 za pomocą 1 N NaOH</li>
 <li>Przefiltrować w celu sterylizacji i umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 37°C </li>
</ol>
Disekcja mózgu
Przygotowanie:
<ul>
 <li>Sterylne pincety i nożyczki</li>
 <li>70% etanol</li>
 <li>Czysty papier tkankowy i podkład chłonny na blacie</li>
 <li>Szalki Petriego o średnicy 10 cm z lodowatym DM dla macicy i płodu na blacie</li>
 <li>Platforma chłodząca przy mikroskopie sekcyjnym</li>
 <li>2-3 szalki o średnicy 6 cm z DM na lodzie</li>
 <li>Ciepłe PM w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C</li>
</ul>
<ol>
 <li>Uśmierć ciężarną szczurkę linii Sprague-Dawley (E16) zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez lokalną Komisję ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach (IACUC)</li>
 <li>Połóż szczurkę na podkładzie chłonnym i spryskaj alkoholem okolicę brzuszną</li>
 <li>Za pomocą pęsety uchwyć skórę brzucha i nożyczkami wykonaj nacięcie w kształcie litery V, przecinając tylko skórę</li>
 <li>Rozchyl skórę i używając drugiej pary sterylnych pęset i nożyczek, przetnij warstwę mięśniową</li>
 <li>Wyjmij łańcuch pęcherzy płodowych i przenieś je do naczynia o średnicy 10 cm zawierającego lodowate DM</li>
 <li>Używając nożyczek do mikrodysekcji, ostrożnie wyjmij każdy embrion z pęcherzyka, a następnie wyjmij mózg z każdego embrionu i umieść uwolnione mózgi w czystym naczyniu o średnicy 10 cm z DM na platformie z lodem</li>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza, pod mikroskopem dissectingowym, odetnij sekcje śródmózwia i rzbmozgowia, a za pomocą precyzyjnej pęsety usuń oponi mózgowe i przenieś oczyszczone kory/hipokampy do nowego naczynia o średnicy 6 cm z DM na wkładzie chłodzącym 
 Uwaga: na tym etapie tkanka jest gotowa do trawienia enzymatycznego.</li>
 <li>Przygotuj roztwór papainy i inhibitora trypsyny, a następnie poddaj go sterylizacji przez filtrowanie</li>
 <li>Usuń nadmiar DM z kory/hipokampów</li>
 <li>Dodaj 4 ml przygotowanego roztworu trawiennego z papainą</li>
 <li>Przenieś całą zawartość do probówki 50 ml i umieść probówkę Falcon w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C dokładnie na 5 min</li>
 <li>Usuń roztwór papainy za pomocą pipety</li>
 <li>Dodaj 5 ml roztworu inhibitora trypsyny, zamieszaj probówkę i pozostaw w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 2-3 min</li>
 <li>Usuń roztwór inhibitora trypsyny</li>
 <li>Powtórz kroki 13 i 14 trzykrotnie</li>
 <li>Dodaj 20 ml ciepłego PM</li>
 <li>Trituruj do momentu całkowitego rozbicia grudek (~20-30 razy)</li>
 <li>Odwiruj przy 100xg przez 7 min</li>
 <li>Resuspenduj osad w 10 ml PM i przemyj dwukrotnie poprzez wirowanie</li>
 <li>Resuspenduj osad w 10 ml PM dla standardowych kultur neuronów lub w NBB27/DMEM dla kultur agregatów</li>
 <li>Przepuść komórki przez sita komórkowe 70μm</li>
 <li>Policz żywe komórki</li>
 <li>Przejdź do hodowli agregatów zgodnie z poniższym opisem lub wysiej komórki do standardowych kultur neuronów 
Uwaga: Na tym etapie można uzyskać silnie wzbogacone kultury neuronów, wysiewając dysocjowane komórki na płytki pokryte PDL w gęstości 200-640 komórka/mm2, w zależności od celu eksperymentów. Po przytwierdzeniu się komórek (~ 2-4 h), wymień medium na ciepły PM. W przypadku długotrwałej hodowli, w 4. dniu wymień połowę medium na ciepły CM. Dla wysoce oczyszczonych kultur neuronalnych w DIV2 można dodać inhibitor mitotyczny 5-FdU (stężenie końcowe 10 μM), aby zahamować proliferację komórek nieneuronalnych (tj. w DIV2-3). Po regeneracji w CM przez 2 dni, komórki poddaje się ponownej impulsowej obróbce 5-FdU przez kolejne 2 dni (DIV 6-7), a następnie całkowitej wymianie medium. Następnie, co 3-4 dni, wymieniaj połowę medium na świeży, ciepły CM. Neurony pozostają żywotne do 4 tygodni.</li></ol>
Przygotowanie i wysiew agregatów
<ol>
 <li>Resuspenduj zdysocjowane komórki w medium NBB27/DMEM zawierającym 1x Sato, 10ng/ml CNTF oraz 10μM forskoliny, osiągając gęstość 2x106 komórek/ml</li>
 <li>Przenieś 2ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka niepowleczonej płytki 6-dołkowej</li>
 <li>Kultywuj przez 3 noce. Każdego dnia delikatnie resuspenduj komórki raz, używając Pipetmana P1000 Uwaga: Komórki zaczynają tworzyć agregaty (Rysunek 1).</li>
 <li>W dniu poprzedzającym wysiew agregatów powlekaj płytkę/szkiełka nakrywkowe Matrigelem:
 <ul>
 <li>Rozcieńcz roztwór zapasowy Matrigelu (growth factor reduced, BD Biosciences 354230) w stosunku 1:20 zimnym DMEM na lodzie 
 Uwaga: Alikwoty Matrigelu należy przygotować zgodnie z protokołem producenta. Wszystkie końcówki, probówki Eppendorf oraz roztwory służące do przygotowania alikwotów z roztworu zapasowego powinny być zimne, aby zapobiec polimeryzacji Matrigelu. Alikwoty Matrigelu przechowuje się w temperaturze -80°C i rozmraża w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Powlek wcześniej pokryte PDL szkiełka nakrywkowe 300μl/dołek rozcieńczonego roztworu Matrigelu przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C</li>
 <li>Przemyj ciepłym PBS, następnie przemyj płytkę ciepłą sterylną wodą ddH2O i pozostaw płytki w inkubatorze.</li>
 </ul></li>
 <li>3 dni po utworzeniu agregatów delikatnie resuspenduj ponownie komórki i przefiltruj zawiesinę przez sito o oczkach 200μm do probówki Falcon 50ml. Pozostaw agregaty, aby opadły na dno probówki pod wpływem grawitacji (~3-5min)</li>
 <li>Ostrożnie usuń nadsącz</li>
 <li>Dodaj medium, delikatnie resuspenduj agregaty i pozwól im ponownie opaść. Powtórz tę procedurę kilka razy, aby usunąć martwe komórki, pojedyncze komórki i debris. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy w nadsączu wciąż znajdują się niezagregowane komórki i debris</li>
 <li>Delikatnie resuspenduj agregaty w tym samym medium NBB27/DMEM (Rysunek 1) i policz agregaty</li>
 <li>Dostosuj gęstość agregatów do poziomu około 25-30 agregatów/50ul</li>
 <li>Przenieś alikwoty (500-1000μl) zawiesiny agregatów do probótek Eppendorf 2ml w celu wysiewu 
Uwaga: Ponieważ agregaty mają tendencję do opadania na dno probówek, kluczowe jest przygotowanie wielu probówek z zawiesiną agregatów do wysiewu. Delikatnie i często resuspenduj agregaty przed ich wysiewem na powlekane szkiełka nakrywkowe lub płytki hodowlane, aby zapewnić podobną liczbę agregatów na każdym szkiełku.</li>
 <li>Wyjmij z inkubatora płytkę hodowlaną zawierającą powlekane Matrigelem szkiełka nakrywkowe. Usuń roztwór z każdego dołka, przemyj szkiełka nakrywkowe ciepłym PBS i wodą ddH2O, a następnie krótko osusz. Są one teraz gotowe do wysiewu agregatów</li>
 <li>Odwróć probówkę z zawiesiną agregatów, aby umożliwić ich równomierny rozkład przed wysiewem. Nanieś 50μl zawiesiny agregatów na środek każdego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, unikając dalszych zakłóceń, aby umożliwić równomierne przytwierdzenie się agregatów do szkiełka 
Uwaga: Gęstość agregatów jest kluczowa. Jeśli agregaty zostaną wysiane zbyt blisko siebie lub jeśli gęstość wysiewu będzie zbyt wysoka, mają one tendencję do zrastania się w miarę wzrostu.</li>
 <li>Dodaj dodatkowe medium DMEM/NBB27 (500 μl) do każdego dołka 4-6 h później lub wcześnie następnego ranka</li>
 <li>Aby utrzymać kulturę agregatów, wymieniaj połowę medium co 3-4 dni. Podczas wymiany medium uważaj, aby nie uszkodzić agregatów; należy to robić poprzez delikatne dodawanie medium wzdłuż bocznej ścianki dołka. 
Uwaga: Kilka godzin po przytwierdzeniu się agregatów do płytki można zaobserwować wzrost neurytów z agregatów. Aksony rosną szybko w ciągu pierwszych dwóch tygodni i tworzą liczne połączenia między agregatami (Rysunek 2). Progenitory glejowe migrują radialnie z agregatów i z czasem różnicują się w astrocyty i dojrzałe oligodendrocyty.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="Wzrost hodowli komórkowej w ciągu trzech dni; obrazy mikroskopowe pokazujące agregację i wyniki po przemyciu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym komórek tworzących agregaty w różnych dniach oraz agregaty po przemyciu.
<img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="Porównanie wzrostu neuronów, mikroskopia kontrastowa, DIV 2 vs DIV 12, analiza sieci komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Obrazy w kontraście fazowym hodowli agregatowej 2 i 12 dni po wysianiu na szkiełkach podstawkowych pokrytych Matrigel.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Wczesne badania donosiły o tworzeniu się synaps i dojrzałej mieliny w kulturach wolno pływających agregatów indukowanych rotacją1. Opisany tutaj system kultur agregatów OUN łączy bezserumowy wzrost wielopotencjalnych komórek progenitorowych w agregatach trójwymiarowych z wygodą tradycyjnych kultur 2D, co ułatwia analizy rozwoju, migracji i różnicowania komórek in vitro. System ten można modyfikować i wykorzystywać do badań nad komórkami prekursorowymi neuronów oraz do badania interakcji neuron-glia. N...

przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

System in vitro, który odtwarza proces rozwoju i różnicowania się progenitorów w dojrzałe neurony i glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), stanowiłby potężną platformę dla neuronaukowców do badania interakcji aksonalno-glejowych, właściwości i różnicowania multipotencjalnych progenitorów oraz progresji komórek linii oligodendroglialnej na poziomie komórkowym i molekularnym. Opisujemy tutaj system hodowli agregatów OUN z przedmózgowia embrionalnego szczura, który może być utrzymywany w medium bezsurowiczym do 3–4 tygodni i jest wykorzystywany w naszym laboratorium jako model do badania interakcji neuron-glej oraz mielinizacji w OUN. Ten materiał wideo zademonstruje, jak izolować i hodować te kultury agregatów OUN z mózgu szczura w 16. dniu embrionalnym (E16). Ponadto, z tej samej dyssekcji mózgu można łatwo uzyskać wysoce wzbogacone, klasyczne dysocjowane kultury neuronalne, które mogą być wykorzystywane w różnorodnych badaniach nad neuronami OUN lub w kokulturach z innymi komórkami.

Opisano protokół systemu hodowli agregatów embrionalnego mózgu szczura. Wielopotencjalne komórki progenitorowe w agregatach mogą rozwijać się i różnicować w neurony, astrocyty oraz oligodendrocyty.

Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Układ in vitro, który odtwarza rozwój i różnicowanie progenitorów w dojrzałe neurony i glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) ...

Przedstawiamy system hodowli progenitorów neuronalnych OUN podczas ich rozwoju i różnicowania w dojrzałe neurony oraz glej. Procedura rozpoczyna się od izolacji czterech mózgów z płodów szczura w 16. dniu embrionalnym (E 16) i ich trawienia papainą. Tkanki są rozdrabniane do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, filtrowane, liczone i rozdzielane do sześciu.Komórki w płytce wielodołkowej są delikatnie resuspensowane raz dziennie przez dwa do trzech dni, aby umożliwić tworzenie się agregatów. Następnie agregaty są zbierane i przesiewane przez sito o oczkach 200 µm, a niewielkie grudki i szczątki komórkowe są usuwane poprzez przemywanie. Na koniec agregaty są liczone i wysiewane na szkiełka nakrywkowe pokryte Matrigelem.Witam, nazywam się Coto i pracuję w laboratorium dr. Johna L. w Katedrze Zintegrowanych Nauk Biomedycznych Weterynaryjnych na Texas A&amp;M University. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę hodowli agregatów mózgowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania linii endocytów, rozwoju komórek oraz interakcji aksonalnych.Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem pracy przygotuj na blacie wysterylizowane narzędzia, 70% etanol, podkład higieniczny do pracy oraz 10 centymetrowe szalki Petriego z podłożem do sekcji, schłodzone w lodzie.W dygestorium przygotuj mikroskop stereoskopowy z platformą chłodzącą oraz kilka 10 centymetrowych szalek z podłożem do sekcji, również schłodzonych na lodzie. Na koniec przygotuj niezbędne roztwory i podgrzej podłoże do wysiewu do 37°C w łaźni wodnej. Protokół rozpoczyna się od pobrania embrionów szczura rasy Sprague-Dawley z 16. dnia embrionalnego (E 16).W pierwszej kolejności przeprowadź eutanazję ciężarnej samicy zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez instytucjonalną komisję ds. etyki doświadczeń na zwierzętach. Połóż uśpionego szczura na podkładzie chłonnym i spryskaj jego brzuch alkoholem w celu oczyszczenia. Następnie za pomocą pęsety uchwyć skórę brzucha i drugą ręką, używając nożyczek, przetnij samą skórę; rozszerz brzegi nacięcia, a następnie za pomocą drugiej pary wysterylizowanej pęsety i nożyczek przetnij warstwę mięśniową.Następnie należy usunąć macicę i przenieść ją do szalki o średnicy 10 centymetrów zawierającej lodowate podłoże do sekcji. Kolejny krok wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając mikrosekcyjnych nożyczek. Należy ostrożnie wyjąć każdy embrion z macicy.Nadszedł czas na pobranie materiału i rozpoczęcie pracy z mózgami embrionalnymi. Pobierz mózg z każdego zarodka i umieść uwolnione organy w czystej szalce o średnicy 10 cm z medium do sekcji, ustawionej na platformie z lodem. Pod mikroskopem sekcyjnym dokończ preparację mózgów.Usuń sekcje mózgu średniego i tylnego. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń oponę mózgową, a pozostałą część przedmózgowia przenieś do probówki Falcon o pojemności 50 ml zawierającej medium do sekcji. Tkanka jest teraz gotowa do następnego etapu.Dysocjacja komórek poprzez trawienie enzymatyczne. Tuż przed rozpoczęciem procesu trawienia należy przygotować świeże roztwory propaganu oraz inhibitora trypsyny z filtra. Należy je wysterylizować i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej.Usunąć nadmiar pożywki z wypreparowanych mózgów. Następnie dodać 4 mL przygotowanego roztworu do trawienia propanem do probówki o pojemności 50 mL. Inkubować probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez dokładnie 5 minut.Po upływie wyznaczonego czasu należy odessać roztwór propanu za pomocą pipety. Następnie dodać 5 mL świeżo przygotowanego roztworu inhibitora trypsyny i ponownie umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na kolejne dwie do trzech minut. Po upływie tego czasu należy usunąć roztwór inhibitora trypsyny.Powtórzyć inkubację z roztworem inhibitora trypsyny jeszcze trzy razy. Po ostatnim usunięciu roztworu inhibitora trypsyny, dodać do probówki 20 mililitrów podgrzanego medium pożywkowego pm.Nadszedł czas na rozbicie skupisk i przemycie komórek. Resuspenduj komórki za pomocą pipety 10 ml, przenosząc ciecz w górę i w dół około 20-30 razy, aż wszystkie skupiska znikną. Następnie wiruj próbkę przy 100 ×g przez siedem minut.Na tym etapie komórki powinny być od siebie dobrze oddzielone. Po siedmiu minutach należy usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 ml medium do wysiewu w celu przemycia komórek.Następnie ponownie je odwiruj. Usuń nadsącz i powtórz proces płukania oraz wirowania. Etap po drugim płukaniu.Resuspenduj osad w 10 ml pożywki do hodowli agregatów, a następnie przefiltruj komórki przez sito komórkowe o oczkach 70 µm. Na koniec policz żywe komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru).W tym momencie można przystąpić do formowania agregatów z dysocjowanych komórek mózgu. Po zliczeniu komórek, zawiesić je w pożywce do hodowli agregatów z zagęszczeniem 2 × 10⁶ komórek/ml. Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka niepowlekanej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami.Przez trzy noce każdego dnia należy delikatnie resuspender komórki. Używając pipety P 1000, w dniu wysiewu agregatów komórki zaczną tworzyć skupiska. Po tym, jak komórki urosną przez trzy noce, ponownie delikatnie resuspender komórki i przelać zawiesinę przez sito o oczkach 200 µm do probówki typu Falcon o pojemności 50 mL.Pozostaw agregaty do osadzenia się na dnie probówki przez około trzy do pięciu minut. Następnie ostrożnie usuń nadsącz, dodaj pożywkę, delikatnie resuspenduj agregaty i pozwól im ponownie osiąść. Powtórz tę procedurę kilka razy.Aby usunąć martwe komórki, pojedyncze komórki i zanieczyszczenia, należy użyć mikroskopu w celu sprawdzenia, czy w nadsączach wciąż znajdują się niezagregowane komórki i zanieczyszczenia. Po dokładnym wypłukaniu agregatów należy je delikatnie resuspender w tym samym medium i policzyć agregaty, aby określić ich stężenie. Następnie należy dostosować gęstość agregatów do poziomu około 25 do 30 agregatów na 50 µL.Nadszedł czas na wysianie agregatów na szkiełka podstawowe. Przenieś 1000 µL alikwotów zawiesiny agregatów do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml; ponieważ agregaty mają tendencję do osiadania na dnie probówek, kluczowe jest przygotowanie wielu probówek z zawiesiną agregatów do wysiewu. Szkiełka podstawowe użyte w tym kroku zostały pokryte podłożem do hodowli komórkowej Matrigel poprzez inkubację przez noc w temperaturze 37 °C.Po przygotowaniu alikwotów zawiesiny agregatów wyjmij z inkubatora płytkę hodowlaną zawierającą szkiełka podstawowe pokryte Matrigel. Usuń roztwór z każdej dołki. Przemyj szkiełka podstawowe ciepłym PBS, a następnie DD H2O.Są one teraz gotowe do wysiewu agregatów w celu obsiania szkiełka podstawowego. Odwróć probówkę z zawiesiną agregatów, aby wymieszać i równomiernie rozprowadzić agregaty. Następnie nanieś 50 µL zawiesiny agregatów na środek każdego szkiełka podstawowego.Ostrożnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, unikając dalszych zakłóceń, aby agregaty mogły równomiernie przytwierdzić się do szkiełka podstawowego. Gęstość agregatów ma kluczowe znaczenie; jeśli agregaty znajdują się zbyt blisko siebie lub jeśli gęstość ich rozmieszczenia jest wysoka, mają one tendencję do łączenia się w miarę wzrostu od czterech do sześciu godzin po początkowym osadzeniu. Do każdej studni dodaj 500 µL pożywki hodowlanej.Aby utrzymać kulturę agregatów, należy wymieniać połowę pożywki co trzy do czterech dni. Podczas wymiany pożywki należy dodawać ją wzdłuż ścianki dołka, aby uniknąć rozbicia agregatów. Kilka godzin po przytwierdzeniu się agregatów do szkiełka nakrywkowego można zaobserwować ich rozrost.Aksony szybko rosną w ciągu pierwszych dwóch tygodni i tworzą liczne połączenia między agregatami. Progenitory Ggl migrują promieniście z agregatów i z czasem różnicują się w astrocyty oraz dojrzałe oligodendrocyty. Właśnie pokazaliśmy, jak hodować agregaty CS.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym dozowaniu objętości i równomiernym wymieszaniu agregatu. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

preparation-rat-brain-aggregate-cultures-for-neuron-glia-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie kultur agregatów mózgów szczurów do badań rozwoju neuronów i glia

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hodowli neuronów korowych szczura w obecności warstwy zasilającej z gleju. Hodowane neurony wykazują polaryzację i tworzą synapsy; mogą zostać one oddzielone od gleju w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach, takich jak elektrofizjologia, obrazowanie wapnia, testy przeżywalności komórek, immunocytochemia oraz izolacja RNA/DNA/białek.

Bilaminarna kokultura pierwotnych neuronów korowych i gleby szczura

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

Ten film demonstruje technikę tworzenia trójwymiarowej hodowli komórek glejowych. Komórki glejowe pochodzące z mózgu szczura są zamknięte w fotosieciowalnej matrycy polimerowej zawierającej składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Po inkubacji w pożywce wzrostowej komórki glejowe namnażają się w macierzy nośnej, tworząc trójwymiarową kulturę.

Stworzenie trójwymiarowej hodowli komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Ten artykuł opisuje izolację i hodowlę embrionalnych neuronów współczulnych szczurów z górnych zwojów szyjnych. Zawiera również szczegółowe protokoły barwienia immunocytochemicznego i przygotowywania ekstraktów neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Poznaj metodę przygotowania kultur agregatów mózgów szczurów do badań nad rozwojem neuronów i gleju. Protokół obejmuje izolację tkanek E16, trawienie enzymatyczne oraz hodowlę progenitorów CNS różnicujących się w neurony i komórki glejowe.

Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Przeglądaj więcej filmów