Name: Preparat bloku komórkowego z próbki cytologicznej z przewagą komórek pojedynczo rozproszonych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę Shidhama przygotowania bloków komórkowych z próbek z pojedynczo rozproszonymi komórkami. Technika z wykorzystaniem markera AV poprawia dokładność immunoprofilowania i oceny specjalnych barwień cytologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Chrisowi Chartrandowi, HT(ASCP) za zaprezentowanie techniki wycinania sekcji bloku komórkowego z użyciem markera AV.

Wprowadzenie:
Niniejszy film opisuje metodę Shidhama dotyczącą przygotowania bloków komórkowych z próbek cytologii w płynnym medium (LBC) przy użyciu HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). W porównaniu z innymi przypadkowymi podejściami, dwie kluczowe cechy tego protokołu przygotowania bloków komórkowych z relatywnie hipokomórkowych próbek z pojedynczo rozproszonymi luźnymi komórkami (1-5) przedstawiają się następująco.
<ol>
<li>Niniejszy protokół obejmuje etapy koncentracji komórek w płaszczyźnie równoległej do powierzchni cięcia bloku komórkowego.</li>
<li>Zawiera on również przypominającą sygnał ciemny wtręt markera AV (Rysunek 1b), który służy dwóm z poniższych celów:<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>Wizualizacji poziomu, na którym skoncentrowane są komórki. Obszar bloku komórkowego z poszukiwanymi komórkami może być teraz widoczny dla histotechnika w momencie odsłonięcia ciemnego markera podczas cięcia. Ta możliwość monitorowania zapobiega przecięciu poziomu z największą liczbą komórek lub zbyt powierzchownemu cięciu przed dotarciem do poziomu o najwyższym stężeniu komórek próbki.</li>
<li>Służenia jako referencyjny punkt lokalizacji w seryjnych skrawkach bloku komórkowego na różnych slajdach. Punkt referencyjny ten działa jak znacznik pomagający zlokalizować konkretne komórki lub grupy komórek w celu oceny koordynacyjnego wzoru immunoreaktywności z zastosowaniem podejścia SCIP (6,7).</li>
</ol></li>
</ol>
PROTOKÓŁ (Rysunek 2)
Przygotowanie próbki.
<ol>
<li>Przenieść pozostałości preparatu cytologicznego szyjki macicy w technice LBC do szklanej probówki o płaskim dnie (średnica 15 mm x 45 mm) (Rysunek 2.1 do 2.4). Umieścić szklaną probówkę w większej plastikowej probówce transportowej (28 x 85 mm) i poddać wirowaniu. Wyjąć szklaną probówkę z probówki transportowej i odlać nadsącz.</li>
<li>Następnie szklaną probówkę należy zakapslować (aby zapobiec przedostaniu się gorącej wody w kolejnym kroku) i ponownie umieścić w większej plastikowej probówce transportowej o płaskim dnie.</li>
<li>Plastikową probówkę transportową zawierającą szklaną probówkę należy zakapslować, umieścić w wirówce (z ruchomymi uchwytami, a nie z uchwytami o stałym kącie, aby komórki opadały prostopadle na płaskie dno szklanej probówki) i wirować z siłą 1805 G (3000 obr./min, promień rotora 17 cm) przez pięć minut (Rysunek 2.5).</li>
<li>Następnie probówki należy wyjąć pionowo z wirówki, a mniejszą szklaną probówkę wyciągnąć pęsetą z większej plastikowej probówki transportowej, uważając, aby nie naruszyć osadu z komórkami.</li>
<li>Zdjąć kapsel z szklanej probówki z preparatem i odlać nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć płaskiej warstwy osadu komórkowego na dnie (Rysunek 2.6).</li>
</ol>
Umieszczenie referencyjnego markera współrzędnych AV i dodanie żelu
<ol>
<li>Ciemny marker AV-marker (o rozmiarze około 2 mm x 2 mm, płaskiej powierzchni, będący fragmentem ciemnego, możliwością cięcia materiału) (Rycina 3) zostaje dodany jako punkt orientacyjny do szklanej probówki (Rycina 2.7).</li>
<li>Upłynnia się alikwot HG, topiąc go w mikrofalówce przez 10 sekund przy średniej mocy.</li>
<li>Do probówki dodaje się 0,5 ml stopionego HG, szybko miesza z osadem i zakręca (Rycina 2.8) (Należy szybko przejść do następnego kroku, nie dopuszczając do rozpoczęcia krzepnięcia HG).</li>
<li>Do plastikowej probówki przenoszącej dodaje się około 2,5 ml ciepłej (45° C) wody (Rycina 2.9).</li>
<li>Mniejsza, zakręcona szklana probówka jest umieszczana wewnątrz plastikowej probówki z ciepłą wodą. (Krok ten jest niezbędny, aby zapobiec krzepnięciu HG podczas kolejnych etapów) (Rycina 2.9).</li>
<li>Plastikową probówkę przenoszącą umieszcza się w wirówce (z ruchomymi uchwytami, a nie o stałym kącie, aby komórki opadały prostopadle do płaskiego dna szklanej probówki) i wiruje przy 1805 G (3000 rpms, promień rotora 17 cm) przez pięć minut. Celem tego etapu wirowania jest przesunięcie markera AV oraz skoncentrowanie komórek w warstwie bliższej powierzchni cięcia końcowego bloku komórkowego zatopionego w parafinie (Rycina 1d).</li>
<li>Probówki są następnie ostrożnie i pionowo wyjmowane z wirówki, uważając, aby nie zakłócić osadzonej cienkiej warstwy z komórkami próbki na dnie.</li>
<li>Odkręca się większą plastikową probówkę i wyjmuje pionowo mniejszą szklaną probówkę za pomocą pęsety, nie naruszając warstwy osadu z komórkami preparatu.</li>
<li>Małą szklaną probówkę chłodzi się w pozycji pionowej przez 15 minut w lodówce, aby schłodzić i utwardzić HG (Rycina 2.11).</li>
</ol>
Usunięcie bloku komórkowego w postaci grudki żelu z preparatem do dalszej obróbki
<ol>
<li>Stężały dysk HG z warstwą skoncentrowanego/osadzonego materiału na dnie zostaje oddzielony od szklanej probówki z płaskim dnem poprzez wtryskiwanie 10% formaliny za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 23 G (Rycina 2.12).</li>
<li>Igłę wprowadza się wzdłuż ścianki probówki, na obrzeżach stężałego dysku HG z materiałem (Rycina 2.12).</li>
<li>Igłę obraca się wzdłuż ścianki probówki, powoli podając formalinę przez strzykawkę. Powoduje to oddzielenie od płaskiego dna szklanej probówki tzw. guzika HG wraz z ciemnym markerem AV oraz skoncentrowanym w nim materiałem (Rycina 2.12).</li>
<li>Blok komórkowy (żelowy guzik z komórkami materiału) zostaje następnie umieszczony w opisanej kasecie i przekazany do procesowania tkanek w celu przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie (Rycina 2.13).</li>
</ol>
Zalewanie i cięcie preparatu
<ol>
<li>Dysk zostaje zatopiony w parafinie z ciemnym znacznikiem orientacyjnym skierowanym w dół jako powierzchnia cięcia (Rysunek 1). </li>
<li>Blok jest skrawany do momentu, aż ciemny AV-marker pełniący rolę znacznika zostanie odsłonięty i stanie się wyraźnie widoczny.</li>
<li>Z tego poziomu, który powinien zawierać większość pojedynczo rozproszonych komórek z próbki, wycina się skrawki o grubości trzech do czterech mikronów.</li>
<li>Skrawki są zbierane na szkiełkach przedmiotowych do dalszego barwienia, barwienia immunohistochemicznego lub innych wskazanych testów. Protokoły tych testów, w tym rodzaj szkiełek stosowanych do montowania skrawków, mogą się różnić. Zazwyczaj do immunobarwienia stosuje się szkiełka powlekane, aby zapobiec pływaniu i utracie skrawków podczas etapów immunobarwienia.</li>
</ol>
Stosowane skróty (w kolejności alfabetycznej): CISH, testy chromogenicznej hybrydyzacji in situ; FISH, testy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ; FFPE, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie; FNA, cienkoigłowa aspiracja; HG, HistoGel™ (Thermo Scientific); LBC, cytologia w materiale w płynie; PCR, reakcja łańcuchowa polimerazy;
 
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="Schemat bloku komórkowego zatopionego w parafinie: struktura z oznaczeniami parafiny, markera AV, żelu i szczegółów warstwy komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Struktura bloku komórkowego przygotowanego zgodnie z protokołem Shidhama.
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="Schemat procesu wirowania komórek z etapami użycia Histogelu i znacznika AV w celu przygotowania osadu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Podsumowanie poszczególnych etapów przygotowania bloku komórkowego z materiału LBC zgodnie z protokołem Shidhama.
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="Schemat procesu przygotowania markerów AV ze skórek bananów z wykorzystaniem metody z użyciem tuszu i formaliny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 3"> Rycina 3. Przygotowanie markerów AV ze skórek bananów.
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="Porównanie powierzchni bloków komórkowych; widoczność markerów w cięciu przekroju histologicznego; analiza schematu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 4"> Rycina 4. Porównanie bloków komórkowych i przekrojów z markerem AV oraz bez niego.
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="Porównanie barwień histologicznych, barwienie HE, małe/duże powiększenie, z markerem AV/bez markera AV, obrazy mikroskopowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 5"> Rycina 5. Porównanie komórkowości przekrojów bloku komórkowego z markerem AV i bez markera AV.

<ol><li>Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.</li>
<li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).</li>
<li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li>
<li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22CytoJournal%22%5BJournal%5D)">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li>
<li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li>
<li>Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtkinson%2C+BF+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
<li>Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
</ol>

Bloki komórkowe stanowią cenne narzędzie do oceny różnych preparatów cytologicznych (1). Co najważniejsze, oprócz szczegółów architektonicznych preparatu, bloki komórkowe umożliwiają przeprowadzenie badań dodatkowych, takich jak immunocytochemia, testy fluorescencyjnej/chromogennej hybrydyzacji in situ (FISH/CISH) oraz PCR in situ. Opisano wiele metod przygotowywania bloków komórkowych. Większość z nich jest jednak odpowiednia dla nieginekologicznych preparatów cytologicznych, które zawierają stosunkowo dużo komórek oraz mikrofragmenty tkanek, na przykład w aspiratach FNA oraz w niektórych płynach surowiczych, takich jak wysięki (1,3,4,5).
Ponieważ bloki komórkowe zapewniają przede wszystkim możliwość oceny immunocytochemicznej, ich opracowanie powinno być możliwie najbliższe procedurom stosowanym dla tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Ostatecznie wyniki uzyskane po ocenie immunocytochemicznej przekrojów bloków komórkowych są porównywane z wynikami z literatury przedmiotu, opracowanymi głównie na podstawie przekrojów tkanek FFPE. Wszelkie zmiany w protokole mogą potencjalnie zaburzyć i unieważnić wiarygodność wyników uzyskanych z bloków komórkowych opracowanych przy użyciu innych utrwalaczy i sekwencji odczynników niż te stosowane w rutynowym badaniu FFPE. Niektóre techniki komercyjne mogą mieć wadę polegającą na opracowaniu zgodnie z protokołem zakładającym ekspozycję na inne utrwalacze i odczynniki.
Dla próbek zawierających znaczną ilość osadu i fragmentów tkanki dostępne są różne metody przygotowania bloków komórkowych. Co do zasady, skoncentrowane osady są stabilizowane za pomocą odpowiedniego żelu lub czynnika koagulującego. Następnie tak przygotowany materiał, po opracowaniu analogicznie do próbek patomorfologicznych lub biopsji, zostaje zatopiony w parafinie.
Stosowane żele obejmują żelatynę, agar, fibrynogen/osocze-trombinę oraz inne żele komercyjne, takie jak HG. Metody zagęszczania różnią się – od prostego wytrącania osadu przez wirowanie, po koncentrację komórek wzdłuż różnych rodzajów membran. Przykłady obejmują: filtry Milipore, worki kollodynowe (Celloidin) lub zeskrobywanie komórek z rozmazów cytologicznych na szkiełkach (1). Oceniliśmy również różnorodne żele, testując różne kombinacje agaru i żelatyny. Żadna z kombinacji nie pozwoliła na uzyskanie konsystencji wystarczająco stabilnej, aby otrzymać w jednym kawałku łatwo manipulowany krążek zestalonego żelu z zatopionymi komórkami z próbki. Żel HG wykazał odpowiednią konsystencję i w naszym doświadczeniu wyniki barwienia immunohistochemicznego na przekrojach bloków komórkowych HG były doskonałe.
Próbki do cytologii w płynie (LBC) pobierane do cytologii szyjkowo-pochwowej są zazwyczaj mniej komórkowe niż próbki nieginekologiczne, o czym wspomniano powyżej. Ponadto ginekologiczne próbki LBC zawierają przede wszystkim pojedyncze, rozproszone złuszczone komórki powierzchniowe błony śluzowej szyjkowo-pochwowej. Z tego powodu w przekrojach bloków komórkowych może nie zostać osiągnięta odpowiednia komórkowość bez zastosowania specjalnej metody. Ponieważ te pojedynczo rozproszone elementy komórkowe w bloku nie są widoczne dla histotechnika podczas skrawania, poziom, na którym komórki zaczynają pojawiać się w przekrojach, nie może być dostrzeżony i może zostać pominięty — albo poprzez wycięcie poziomu z największą liczbą komórek, albo poprzez niewystarczająco głębokie cięcie do poziomu o najwyższym stężeniu komórek próbki (Rysunek 4). Protokół Shidhama rozwiązuje oba te problemy, wykorzystując HG jako medium do zatopienia oraz konwencjonalny sprzęt laboratoryjny (2) (Rysunek 2).
Protokół ten obejmuje dwie główne cechy (Rysunek 1):
<ol>
<li>Koncentracja i wyrównanie pojedynczo rozproszonych komórek w wąskiej płaszczyźnie sąsiadującej i równoległej do powierzchni cięcia bloku komórkowego (Rysunek 5).</li>
<li>Włączenie ciemnego markera AV pełniącego funkcję znacznika (beacona). Jest to kluczowe dla osiągnięcia następujących funkcji:<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>Identyfikacja i monitorowanie poziomu, na którym komórki są skoncentrowane w bloku komórkowym. Odsłonięcie ciemnego znacznika wskazuje poziom, na którym spodziewana jest lokalizacja większości pojedynczo rozproszonych komórek w bloku komórkowym (Rysunek 4). Zapobiega to przecięciu (cięciu poza poziom z największą liczbą komórek) lub niedocięciu (niewystarczająco głębokiemu cięciu do poziomu o najwyższym stężeniu komórek próbki) bloku komórkowego i umożliwia wybór przekrojów z poziomu bloku komórkowego odpowiadającego najwyższej koncentracji komórek.</li>
<li>Ciemny znacznik w przekrojach służy również jako punkt odniesienia do przeglądu i dokładnej identyfikacji tych samych komórek w różnych sekcjach seryjnych bloku komórkowego na różnych szkiełkach (Rysunek 4). Jest to kluczowe podczas interpretacji i oceny właściwości koordynacyjnych, takich jak immunoprofil konkretnych komórek, przy zastosowaniu podejścia SCIP w celu śledzenia tych samych komórek w różnych przekrojach (6,7).</li>
</ol></li>
</ol>
Chociaż nasz protokół jest zestandaryzowany i opisany dla próbek cytologicznych szyjki macicy w metodzie płynnej, może on być również stosowany w celu zwiększenia wydajności diagnostycznej wielu innych próbek nieginekologicznych, takich jak płyny z wysięków, biopsje aspiracyjne cienkoigłowe (FNA), wymazy szczoteczkowe, treści torbieli itp. Dodatkowo marker AV ułatwiłby lepsze zastosowanie podejścia SCIP podczas oceny immunohistochemicznej preparatów z bloków komórkowych tych próbek. Medium do zatapiania można zastąpić innymi odczynnikami, wprowadzając odpowiednie modyfikacje w istotnych etapach. HG można zastąpić osoczem (Fibrinogen), które zostanie żelowane przez Thrombin w temperaturze pokojowej (1).

przygotowanie bloku komórkowego z materiału cytologicznego z przewagą pojedynczo rozproszonych komórek

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę Shidhama służącą do przygotowania bloków komórkowych z płynnych preparatów cytologicznych szyjki macicy i pochwy, zawierających pojedynczo rozproszone komórki oraz małe grupy komórek. Technika ta wykorzystuje HistoGel (Thermo Scientific) przy użyciu konwencjonalnego sprzętu laboratoryjnego.
Stosowanie bloków komórkowych jest cennym narzędziem pomocniczym w ocenie cytologii nieginekologicznej. Pozwalają one cytopatologowi na badanie dodatkowych szczegółów morfologicznych preparatu, w tym architektury zmiany. Co najważniejsze, umożliwiają one przeprowadzenie badań pomocniczych, takich jak immunocytochemia, testy hybrydyzacji in situ (FISH/CISH) oraz reakcja łańcuchowa polimerazy in situ (PCR). Tradycyjne techniki przygotowania bloków komórkowych były stosowane głównie w przypadku próbek cytologii nieginekologicznej, zazwyczaj w odniesieniu do wysięków z jam ciała oraz biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej.
Próbki szyjkowo-pochwowe w preparatach płynnych charakteryzują się względnie niższą komórkowością niż ich odpowiedniki nieginekologiczne, z wieloma pojedynczymi, rozproszonymi komórkami. Z tego powodu trudne jest uzyskanie odpowiedniej komórkowości w przekrojach bloku komórkowego. Ponadto histotechnik wykonujący skrawanie bloku nie jest w stanie zwizualizować poziomu, na którym komórki występują w najwyższym stężeniu. W konsekwencji utrudniony jest monitoring właściwego poziomu, z którego można wybrać skrawki do przeniesienia na szkiełka przedmiotowe w celu przeprowadzenia badań. W efekcie obszar bloku komórkowego zawierający komórki o znaczeniu diagnostycznym może zostać pominięty, albo poprzez zbyt głębokie cięcie, albo poprzez niewystarczające pogłębienie skrawania. Obecny protokół metody Shidhama rozwiązuje te problemy. Choć protokół ten jest zestandaryzowany i opisany dla ginekologicznych próbek cytologicznych w preparatach płynnych, może on zostać zastosowany również do próbek nieginekologicznych, takich jak płyny z wysięków, materiał z biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (FNA), wymazy szczoteczkowe, zawartość cyst itp., w celu poprawy jakości materiału diagnostycznego w przekrojach bloku komórkowego.

Metoda Shidhama przygotowania bloków komórkowych z markerem AV z preparatów cytologicznych zawierających pojedynczo rozproszone komórki i małe grupy komórek.

Przygotowanie bloku komórkowego z materiału cytologicznego z przewagą pojedynczo rozproszonych komórek

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę Shidhama dotyczącą przygotowania bloków komórkowych z płynnych preparatów cytologii szyjki macicy i pochwy zawierających pojedyncze...

Przygotowanie bloku komórkowego rozpoczyna się od przeniesienia skoncentrowanych komórek z próbki do szklanej probówki o płaskim dnie, umieszczonej w większej probówce. Następnie komórki są osadzane na dnie poprzez wirowanie, po czym dodaje się marker AV oraz roztopiony HistoGel. Dodanie ciepłej wody do szklanej probówki nośnej zapewnia, że HistoGel pozostaje w stanie ciekłym.Kolejne wirowanie przesuwa marker AV przez żel i koncentruje komórki w warstwie blisko powierzchni cięcia bloku komórkowego. Po stwardnieniu guzik żelowy można usunąć i poddać obróbce w celu zatopienia w parafinie. Dzień dobry, jestem dr George Varszegi z sekcji cytologii Katedry Patologii w Medical College of Wisconsin w Milwaukee w stanie Wisconsin.Jestem dr Vsam, również z sekcji Cytopatologii Katedry Patologii w Medical College of Wisconsin w Milwaukee. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować procedurę przygotowywania bloków komórkowych z preparatów cytologicznych z przewagą pojedynczo rozproszonych komórek. Stosujemy tę procedurę w celu zbadania profilu immunologicznego tych pojedynczo rozproszonych komórek w przekrojach bloków komórkowych, a także do oceny barwień specjalnych na tych przekrojach.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś około 0,5 milliliters preferencyjnie skoncentrowanej próbki do szklanej probówki o płaskim dnie o długości 45 millimeters i średnicy 15 millimeter. Następnie umieść szklaną probówkę w dużej plastikowej probówce nośnej o płaskim dnie i wiruj przy 1800 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu należy wyjąć szklaną probówkę z płaskim dnem z plastikowej probówki nośnej i odlać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć płaskiej warstwy osadu komórkowego na dnie. Do komórek dodaje się ciemny znacznik Johnny Vena lub marker AV w celu ich oznakowania.Po zatopieniu komórek marker AV służy do zidentyfikowania poziomu, na którym komórki są skoncentrowane w bloku parafinowym. Za pomocą specjalnej pipety dodaj wcześniej przygotowaną kostkę o płaskiej powierzchni markera AV do komórek w probówce. Następnie rozpocznij proces dodawania żelu; upłynnij alikwot histo gel lub HG, topiąc go w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund przy średniej mocy lub postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.Do probówki zawierającej osadzone komórki dodać 0,5 milliliters stopionego HG. Szybko wymieszać i ponownie zakręcić probówkę. Bezzwłocznie dodać około dwóch i pół milliliters ciepłej wody o temperaturze 45 degrees Celsius do plastikowej probówki przenoszącej.Następnie wprowadź probówkę CAPAs zawierającą komórki, marker AV oraz HistoGel. Szybkie działanie i użycie ciepłej wody zapobiegają krzepnięciu żelu podczas kolejnych etapów. Następnie odwiruj próbkę, aby przepchnąć marker AV przez żel i skoncentrować komórki w warstwie, która będzie znajdować się bliżej powierzchni cięcia końcowego bloku komórek zatopionych w parafinie.Należy użyć uchwytów z ruchomym kątem, a nie stałym, aby komórki osadzały się prostopadle do płaskiego dna probówki szklanej, a następnie wirować z prędkością 1800 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania ostrożnie i pionowo wyjąć probówki z wirówki, dbając o to, aby nie naruszyć cienkiej warstwy osadu komórek na dnie. Za pomocą pęsety pionowo wyjąć mniejszą probówkę szklaną, nie naruszając warstwy osadu komórek preparatu.Na koniec schłodź małą probówkę szklaną w pozycji pionowej przez 15 minut, aby żel ostygł i stężał. Po upływie 15 minut wyjmij żel zawierający komórki z probówki szklanej, aby odseparować stężały dysk HG, który zawiera warstwę skoncentrowanego preparatu na dnie wraz z ciemno zabarwionym markerem AV. Użyj igły o rozmiarze 23 G przymocowanej do strzykawki wypełnionej 10% formin.Zacznij od wprowadzenia igły wzdłuż ścianki probówki na obrzeżach stwardniałego dysku HG. Następnie obracaj igłę wzdłuż ścianki probówki, jednocześnie powoli wprowadzając roztwór Forminy za pomocą strzykawki. Obserwuj oddzielenie przycisku HG od płaskiego dna szklanej probówki.Oddzielony guzik żelu zawierający ciemny marker beacon AV oraz skoncentrowaną próbkę określa się mianem bloku komórkowego; proces kończy się umieszczeniem bloku komórkowego w oznakowanej kasecie i przekazaniem go do obróbki tkankowej w celu przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie. Po zatopieniu bloku komórkowego należy przystąpić do krojenia próbki, rozpoczynając od wycinania krążka bloku komórkowego zatopionego w parafinie; blok komórkowy zatopiony w parafinie należy zamocować w mikrotomie, a następnie wykonać cięcia wstępne w celu wyrównania powierzchni bloku parafiny i odsłonięcia krążka bloku komórkowego, aż do momentu, gdy ciemny marker AV zostanie odsłonięty i stanie się wyraźnie widoczny. Po odsłonięciu ciemnego markera AV należy wykonać skrawki o grubości od trzech do czterech mikronów.Przekroje te zawierają skoncentrowane komórki z oryginalnego preparatu. Każdy przekrój należy zebrać na szkiełko przedmiotowe w celu dalszego barwienia, a następnie analizy mikroskopowej. Tutaj, przy małym powiększeniu, widzimy wpływ zastosowania markera z kredką AV na skórce banana w preparacie na gęstość komórkową w tych przekrojach barwionych H&amp;E.Na obrazie po lewej stronie widać, że znacznik ten umożliwia monitorowanie głębokości cięcia sekcji w celu uzyskania poziomu o dobrej komórkowości. Znacznik AV pozwala również na orientację różnych komórek, a w szczególności sekcji, które mają być śledzone w kolejnych seriach cięć na innych szkiełkach z tym samym znacznikiem. Bez niego monitorowanie głębokości cięcia nie byłoby możliwe.Próbki tkanki pobrano w płaszczyźnie cięcia o niskiej komórkowości. Stopień komórkowości w próbkach jest jeszcze bardziej widoczny przy dużym powiększeniu; dzięki zastosowaniu markera AV można łatwo monitorować głębokość cięcia i unikać pobierania próbek o niskiej komórkowości. Przedstawiliśmy metodę przygotowania bloku komórkowego z materiału zawierającego luźno rozproszone fragmenty i komórki.Ciemny marker AV, który dodaliśmy podczas przygotowywania bloku komórkowego, pomaga nam w wyborze tych przekrojów, które charakteryzują się najwyższym stężeniem komórek. Pozwala on również na prawidłową orientację tych przekrojów na szkiełkach przedmiotowych. Ważne jest, aby HistoGel znajdował się w stanie stopionym w momencie, gdy komórki ustawiają się wzdłuż szklanej rurki dna flood pla, która stanowi powierzchnię cięcia.Procedurę tę można jednak zmodyfikować dla innych metod, w tym metod na zimno, takich jak zastosowanie trombiny i fibrynogenu, poprzez wprowadzenie odpowiednich modyfikacji. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu procedur.Dziękujemy.

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie Bloku Komórkowego z Próbki Cytologicznej z Przewagą Komórek Rozproszonych Pojedynczo

Ten protokół opisuje przygotowanie próbek guzów z parafiną utrwalonymi w formalinie, które są używane do zachowania tkanek i próbek cytologicznych z niedrobnokomórkowego raka płuc...

Przygotowanie próbek guzów zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie: protokół ochrony próbek tkanek i cytologii przed niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC)

Ten film opisuje przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych, co jest metodą generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych. Frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne można wykorzystać do dalszej analizy.

Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych: metoda generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek o niskiej liczbie komórek do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Obecnie, barwienie immunofluorescencyjne na stałych komórkach jest metodą wyboru do określania poziomów ekspresji białek, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przewiduje alternatywną metodę immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Poznaj metodę Shidhama przygotowania bloków komórkowych z próbek z pojedynczo rozproszonymi komórkami. Technika z wykorzystaniem markera AV poprawia dokładność immunoprofilowania i oceny specjalnych barwień cytologicznych.

Przygotowanie bloku komórkowego z materiału cytologicznego z przewagą pojedynczo rozproszonych komórek

Przeglądaj więcej filmów