Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM)

Fluorescencyjna mikroskopia plamkowa (fluorescent speckle microscopy) jest wykorzystywana do badania dynamiki różnych białek cytoszkieletu w żywych komórkach. Przy prawidłowym zastosowaniu możliwe jest przeprowadzenie ilościowych pomiarów prędkości oraz kinetyki wymiany białek cytoszkieletu. Procedurę tę rozpoczynamy od mikroiniekcji niewielkiej objętości znakowanej fluorescencyjnie aktyny do żywych komórek.

Następnie montujemy komorę obrazowania, aby zminimalizować efekty fotobleachingu. Najpierw dwa kawałki dwustronnej taśmy przyklejamy po obu stronach preparatu szkiełka w miejscu, w którym będzie spoczywać nakrywka z komórkami. Następnie do komory pipetujemy medium do obrazowania, dozując je w pobliżu jednej z otwartych szczelin.

Na koniec wszystkie cztery boki zostają uszczelnione za pomocą Parafilmu. Dzień dobry, nazywam się James Lim i reprezentuję laboratorium Galena Deucera w Departamencie Biologii Komórki w Scripps Research Institute. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę mikroskopii plamek fluorescencyjnych.

Niniejszą procedurę wykorzystujemy do badania dynamiki aktyny w migrujących komórkach nabłonkowych. Przejdźmy zatem do realizacji. Kluczowym elementem pozwalającym na uzyskanie wysokiej jakości filmów w mikroskopii plamkowej (fluorescent speckle microscopy) jest prawidłowe znakowanie aktyny wybranym fluorophorem; zalecamy stosowanie fluorophoreów z serii Alexa oraz rodamyny, pochodnych estrów NHS, które wiążą się z odsłoniętymi resztami lizyny na powierzchni aktyny.

Ważne jest, aby stopień znakowania był wysoki, w zakresie od 0,3 do 0,7 barwnika na monomer aktyny, aby zapewnić, że plamki będą jasne i wyraźne przed długoterminowym przechowywaniem. Roztwór znakowanej aktyny należy sklarować, wirując go przy 75 000 do 80 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Znakowaną aktynę należy przechowywać w roztworze buforu G w temperaturze -80°C.

Przygotowano alikwoty o objętości 2 µL, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, co może prowadzić do powstania nierozpuszczalnych agregatów. Aby zapobiec fotoblaknięciu fluoroforów, nie należy wystawiać znakowanego roztworu aktyny na bezpośrednie działanie światła przez dłuższy czas oraz należy używać nieprzezroczystych probówek do mikrocentryfugi do długoterminowego przechowywania. Komórki do mikroiniekcji umieszczono na kwadratowych szkiełkach podstawkowych przemytych kwasem.

Standardową powłokę podłoża można nanieść na szkiełko podstawowe, co nie wpłynie na proces mikroiniekcji. Przechowuj komórki w temperaturze 37 °C podczas przygotowywania aktyny, aby wybrać komórki podatne na mikroiniekcję. W przypadku FSM należy wziąć pod uwagę następujące kryteria.

Komórki powinny być duże, o średnicy przekraczającej 50 µm, spłaszczać się po wysianiu i naturalnie przylegać do podłoży. Korzystne jest również, jeśli cytoplazma komórki zajmuje powierzchnię większą niż jej jądro. Odpowiednie linie komórkowe obejmują m.in. PTK, komórki płuc traszki oraz neurony AIA.

W niniejszej demonstracji przeprowadzimy iniekcję PTK do komórek nabłonkowych. Prawidłowy dobór igieł do mikroiniekcji zależy od rozmiaru otworu końcówki. Typowo wielkość otworu może wynosić od 0.5 micrometers do nawet trzech micrometers.

Zalecamy optymalną wielkość otworu od 0,5 do 1 µm. Do iniekcji można zakupić gotowe igły do mikroiniekcji lub wykonać je samodzielnie. Jeśli dostępny jest komercyjny wyciągacz igieł, osobom początkującym zalecamy przygotowanie od 10 do 20 wyciągniętych igieł przed rozpoczęciem procedury iniekcji.

Kolejnym krokiem jest rozcieńczenie znakowanego actonu lodowatym buforem do iniekcji. Wszystkie roztwory robocze należy przechowywać w lodzie. Optymalne stężenie iniekcyjne, czyli końcowe stężenie actonu załadowanego do igły, wynosi od 0.5 do 1 µg/µL.

Przyjmując 40% stosunek znakowania D do ilości monomeru aktyny, nanieś od 0,5 do 1 µL rozcieńczonego roztworu aktyny. Używając igły mikros注射rówki, ostrożnie dozuj roztwór aktyny. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza.

W przypadku pojawienia się pęcherzyków powietrza można je łatwo usunąć, pobierając nadmiar cieczy otaczającej pęcherzyk. Należy upewnić się, że roztwór Acton spoczywa całkowicie na końcówce igły. Wzdłuż kapilary igły nie powinno znajdować się żadne nadmiarowe rozwiązanie, ponieważ może ono zaburzyć przepływ podczas iniekcji.

Załadowana igła jest teraz gotowa do zamocowania w uchwycie wtryskowym do mikroiniekcji. Wyjmij komórki z inkubatora i umieść szkiełko podstawkowe na stoliku mikroskopu. Aby rozpocząć procedurę mikroiniekcji, przenieś załadowaną igłę do mikroskopu.

Ostrożnie przymocuj igłę do uchwytu injektora, unikając kontaktu z jej końcówką. Ustaw uchwyt tak, aby igła tworzyła kąt od 35 do 50 stopni względem podstawy stolika mikroskopu. Obniż końcówkę igły, aż ledwo przebije powierzchnię medium kąpielowego.

Komórki pozycjonują teraz końcówkę igły tak, aby znajdowała się ona bezpośrednio nad centrum obiektywu. Jeśli końcówka igły jest wyrównana z obiektywem, przez okular powinna być widoczna jasna aureola. Jest to krawędź końcówki igły.

Powolne przesuwanie igły z boku na bok może pomóc w dokładniejszym zlokalizowaniu halo. Podczas nawigacji należy upewnić się, że końcówka igły znajduje się znacznie powyżej komórek. Aby zapobiec złamaniu końcówki igły, należy regulować pokrętło Z.Focus mikroskopu, aż komórki staną się wyraźnie widoczne.

Następnie powoli opuszczaj końcówkę igły, kontrolując ostrość, aż halo stopniowo się zwęzi i ostatecznie zbiegnie się w końcówce igły. Można również szukać trzonu igły, który będzie rzucał liniowe cienie. Opuszczanie igły pozwoli stopniowo zdefiniować trzon igły.

Może być konieczna niewielka regulacja pierścienia fazowego w celu poprawy kontrastu, tak aby zarówno koniec igły, jak i komórki były teraz wyraźnie widoczne. Podczas wyboru komórek do iniekcji, komórki z wolnymi krawędziami powinny być skierowane w stronę końcówki igły. Zapewni to, że opadający stok komórki – od najgrubszego punktu, w którym znajduje się jądro, do najcieńszego punktu krawędzi prowadzącej – spotka się z końcówką igły, zamiast przebiegać równolegle do niej.

Ustaw ciśnienie igły w zakresie od 0.3 do 0.8 PSI. Stałe przyłożone ciśnienie zapewni jednostajny przepływ roztworu acton. Po wybraniu komórki do iniekcji, powoli ustaw igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się obok jądra komórkowego, a następnie obniż ją i skoryguj pozycję igły, aż do momentu wciśnięcia końcówki.

Stopniowo obniżaj igłę, aż jej końcówka przebije błonę. Jeśli igła całkowicie przebije błonę, komórka stanie się jaśniejsza. Gdy tylko zauważysz tę zmianę, podnieś igłę, aż przestanie ona dotykać komórki.

Sam proces przebijania i wstrzykiwania trwa od 0,5 do dwóch sekund. Przy prawidłowym wykonaniu kształt komórki pozostanie niezmieniony. Aby zminimalizować stres komórek, każda sesja mikroiniekcji nie powinna trwać dłużej niż od 20 do 45 minut.

Czasami podczas wstrzykiwania może nie być widocznych zmian w komórce, a komórka nie zwiększy swojej jasności. Świadczy to o tym, że końcówka igły może być zapchana. Można to sprawdzić, naciskając przycisk czyszczenia, jeśli jest on dostępny w Twoim mikroinjektorze.

Jeśli końcówka igły jest otwarta, spowoduje to znaczne zwiększenie stałego przepływu pod ciśnieniem, co objawia się w postaci zmarszczek oraz rozproszenia znajdujących się w pobliżu zanieczyszczeń. Jeśli końcówka igły jest zamknięta, można wprowadzić nową igłę do mikroiniekcji lub spróbować odłamać końcówkę igły, delikatnie ją opuszczając, aż naprze się ona o szklane szkiełko podstawowe. Spowoduje to odłamanie samego końca końcówki.

Powierzchnia przełomu nie powinna przekraczać jednej piątej powierzchni czubka igły, czyli tej części igły, która zaczyna zwężać się ku końcowi po zakończeniu mikroiniekcji. Wymień pożywkę komórkową w naczyniu na świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę, aby usunąć wszelkie pozostałości fluorescencyjne. Po wymianie pożywki pozostaw komórki na 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu regeneracji przed wykonaniem obrazowania.

Pozwoli to również na wbudowanie aktyny w istniejącą sieć cytoszkieletu podczas regeneracji komórek w inkubatorze; w tym czasie należy rozpocząć montaż komory obrazowania. Najpierw podgrzać pożywkę do obrazowania w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie rozmrozić w temperaturze pokojowej aliquot 15 µL oxa erase.

Dodanie RA do pożywki w późniejszym etapie znacznie ograniczy efekty fotowybielania. Owinięcie gumy do uszczelniania (oxa erase) folią aluminiową zapewni ochronę związku światłoczułego przed światłem. Podgrzej uszczelniacz VAP na płycie grzejnej ustawionej na niską temperaturę; nie przegrzej i nie przypal uszczelniacza VAP, ponieważ straci on swoją skuteczność jako materiał uszczelniający.

Przetrzyj szkiełko mikroskopowe chusteczką Kim nasączoną czystym etanolem, aby je oczyścić i usunąć drobne zanieczyszczenia. Ułóż dwa równe odcinki obustronnej taśmy klejącej o długości 2,5 cm jeden na drugim, korzystając z czystej, płaskiej powierzchni, takiej jak inne szkiełko mikroskopowe. Dociskając taśmy, usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza, aby stworzyć całkowicie płaską powierzchnię.

Następnie za pomocą żyletki wytnij dwa proste paski wzdłuż długiej osi taśmy, tak aby każdy pasek miał 0,5 centymetra szerokości. Używając pęsety, umieść każdy pasek wzdłuż długich krawędzi szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby dwa paski taśmy tworzyły przerwę w centrum szkiełka. Delikatnie dociśnij taśmę, aby zapewnić szczelne przyleganie do szkła.

Te paski taśmy będą pełnić funkcję dystansów między szkiełkiem przedmiotowym a szkiełkiem nakrywką. Sprawdź zawór, aby upewnić się, że substancja całkowicie się upłynniła. Przed rozpoczęciem następnego kroku pobierz podgrzane wcześniej medium obrazujące.

Do każdych 500 µL pożywki dodać 15 µL oxy rays. Złożyć chusteczkę do wycierania chem wipe w trójkąt, aby utworzyć trzy sztywne krawędzie. Posłuży ona później do przecierania szkiełka nakrywnego.

Wyjmij komórki z inkubatora za pomocą pęsety. Szybko podnieś róg szkiełka nakrywki. Połóż szkiełko nakrywki na chusteczce Kimwipe stroną z komórkami do góry, tak aby nie dotykała ona tkanki, a następnie użyj złożonej chusteczki Kimwipe do wytarcia dwóch przeciwległych boków szkiełka, aby uzyskać powierzchnię półsuchą.

Następnie chwyć pęsetą róg szkiełka nakrywki i umieść je na szkiełku przedmiotowym w taki sposób, aby suche powierzchnie były wyrównane z dwoma paskami taśmy. Zauważ, że powstały dwie zamknięte krawędzie i dwie otwarte szczeliny. Powoli pipetuj 200 µL roztworu RA medium obrazującego w pobliżu jednego z otworów.

Ważne jest, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Roztwór powinien zostać zassany do nowo złożonej komory siłami kapilarnymi, co zapewni pełne zanurzenie komórek w roztworze. Za pomocą patyczka higienicznego nanieś roztopiony vap na cztery narożniki szkiełka nakrywkowego, aby szybko przymocować i ustabilizować szkiełko.

Zauważą Państwo, że VAP wysycha w ciągu kilku sekund w temperaturze pokojowej. Następnie, zaczynając od zamkniętych boków, należy nałożyć cienki pasek VAP za pomocą patyczka watowego, wykonując ruch przypominający malowanie pędzlem. Powtórzyć tę czynność dla boków otwartych.

Powoli nakładaj warstwę VAP, wzmacniając uszczelnienie poprzez powtórzenie etapów powlekania. VAP należy ograniczyć do krawędzi, pozostawiając środek szkiełka nakrywki wolnym. Po uszczelnieniu krawędzi szkiełka nakrywki, delikatnie oczyść jego środkową część za pomocą patyczka kosmetycznego zwilżonego wodą DD H2O, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki.

Należy uważać, aby nie zmiażdżyć komórek. Powtórz ten etap czyszczenia, używając czystego etanolu. Otrzymano w ten sposób w pełni zamkniętą komorę obrazującą, zoptymalizowaną do obrazowania fluorescencyjnych plamek.

Zastosowanie całkowicie szczelnej obudowy zapobiegnie szybkiemu fotobieleniu próbek roślinnych. Komórki w całkowicie zamkniętej komorze są teraz gotowe do obrazowania. Używamy odwróconego mikroskopu szerokopolowego z lampą rtęciową, iluminatorem epi, odpowiednimi filtrami i obiektywem plan z imersją olejową.

Obrazy z obiektywów apochromatycznych są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD z pikselami o rozmiarze 6,7 mikrona oraz oprogramowania do akwizycji obrazu. Należy wstępnie podgrzać stołu mikroskopu do 37°C. Umieść komorę obrazującą i odczekaj od 10 do 15 minut, aż temperatura się ustabilizuje przed przystąpieniem do obrazowania.

Po ustabilizowaniu temperatury ustaw ostrość obrazu komórek w polu jasnym, a następnie odszukaj komórki po injekcji, przełączając odpowiednie ustawienia fluorescencyjne. Staraj się zminimalizować czas ekspozycji na światło fluorescencyjne, aby ograniczyć fotobleaching. Szukaj zainfekowanych komórek, które posiadają zdrowe, zakrzywione krawędzie prowadzące.

Komórki z nadmierną ilością wstrzykniętego materiału będą charakteryzować się wciągniętymi i poszarpanymi krawędziami przypominającymi liczne filopodia. Nie należy obrazować takich komórek. Ustawienia akwizycji będą zależały od typu komórek, jakości znakowanej aktyny oraz komponentów mikroskopu.

Należy jednak pamiętać, aby czas naświetlania nie przekraczał dwóch sekund, a odstęp czasowy między klatkami ustawić w przedziale od 5 do 10 sekund. Można zwiększyć wzmocnienie (gain) w kamerze w celu poprawy stosunku sygnału do szumu. Idealna charakterystyka plamek powinna zapewniać odstęp między każdą plamką a sąsiednią wynoszący około dwóch średnic plamki.

W przypadku komórek nabłonkowych sieć aktyny w formie plamek będzie wyglądać homogenicznie, z równomiernie rozmieszczonymi plamkami. Należy dostosować ustawienia ekspozycji, aby uzyskać optymalne obrazy plamek.

Kluczem do uzyskania wysokiej jakości filmów z plamkami (speckle movies) jest utrzymanie ostrości. Jest to szczególnie istotne w przypadku analizy następczej obejmującej pomiary przepływu i wymiany plamek. Zatem jakość analizy ilościowej będzie zależeć od zablokowania ostrości na cały czas trwania serii zdjęć (time lapse).

W tekście szczegółowo opisano różne strategie utrzymywania ostrości; w tym pokazie zostanie wykorzystany system Nikon Perfect Focus. Poniżej przedstawiono różne przykłady komórek poddanych mikroiniekcji. Panel lewy przedstawia komórkę po mikroinjekcji z obrazem plamkowym o niskim stężeniu.

Środkowy panel przedstawia obraz plamkowy komórki z zastosowaniem zbyt wysokiego stężenia podczas mikroiniekcji, a prawy panel pokazuje komórkę po optymalnej iniekcji. W przypadku FSM wymagany jest obraz plamkowy wysokiej jakości. Przedstawiliśmy sposób mikroiniekcji znakowanej fluorescencyjnie aktyny do komórek nabłonkowych na potrzeby fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej.

Podczas wykonywania tej procedury niezwykle ważne jest pamiętanie, że jakość oznakowanej aktyny, jak i technika mikroiniekcji, będą decydować o ogólnej jakości obrazów speckle. To wszystko i powodzenia w eksperymentach.