Elektroporacja in utero i ex vivo do ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

W macicy elektroporacja siatkówki rozpoczyna się od nacięcia brzucha na znieczulonej matce w stadium E 13,5 do 14,5 w celu odsłonięcia łańcucha embrionalnego. DNA jest wstrzykiwane do jednej siatkówki na zarodek, a głowy są elektroporowane, co powoduje, że DNA jest pobierane przez komórki progenitorowe RGC. Przy E 18,5 zarodki są perfundowane i GFP dodatnie.

Siatkówka i projekcje wzrokowe są analizowane pod kątem elektroporacji siatkówki X vivo. Głowy E 13,5 do 14,5 są przypinane grzbietową stroną do góry w naczyniu, a DNA jest wstrzykiwane do obwodowego obszaru grzbietowego obu siatkówki, a następnie następuje elektroporacja. Cała siatkówka jest hodowana przez 40 godzin, a następnie posiewana eksplantatami siatkówki z dodatnim wynikiem GFP do testów hodowli in vitro.

Cześć, nazywam się Tim Petros i pracuję w laboratorium dr Carol Mason na Wydziale Patologii oraz Biologii Komórki i Neurologii na Uniwersytecie Columbia. Dzisiaj pokażemy Ci, jak wprowadzić geny do embrionalnej lustrzanej siatkówki za pomocą elektroporacji siatkówki in utero i ex vivo. Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób manipulowanie ekspresją genów i komórkami zwojowymi siatkówki zmienia ich szlak projekcyjny, szczególnie na skrzyżowaniu wzrokowym.

Dobra, zacznijmy. Przed przystąpieniem do elektroporacji siatkówki in utero niezbędne jest odpowiednie przygotowanie. Prosimy o zapoznanie się z naszym pisemnym protokołem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania anestezjologicznej sterylizacji narzędzi i oprzyrządowania, przygotowania roztworów DNA do wstrzykiwań i antybiotykowych roztworów przeciwgrzybiczych po operacji, przygotowania obszaru operacyjnego i ogrzania odpowiednich roztworów.

Mikropipety z cienką końcówką należy przygotować przed zabiegiem za pomocą ściągacza do mikroelektrod. Złamij końcówkę, aby utworzyć kątowy punkt do elektroporacji in utero Najpierw wstrzyknij 0,15 mililitra mieszanki znieczulającej międzyotrzewnowej do zapory stopnia E 13,5 do E 14,5. Powinno minąć od trzech do siedmiu minut, zanim zapora będzie w pełni znieczulona, aby sprawdzić, czy mysz jest znieczulona.

Uszczypnij tylną łapę i sprawdź, czy nie ma reakcji w czasie, gdy zwierzę ulega znieczuleniu. Wytnij mały kawałek i odpipetuj pięć mikrolitrów roztworu DNA na param. Zegnij tłok z metalowego drutu pod kątem 90 stopni i włóż go do wyciągniętej mikropipety za pomocą tłoka, zasysaj roztwór DNA do mikropipety.

Teraz chirurgicznie odsłonić zarodki myszy. Proszę zapoznać się z protokołem JoVE autorstwa Wal Inus i wsp., aby uzyskać informacje na temat prawidłowej techniki. Teraz jesteśmy gotowi do elektroporacji.

Pierwszym krokiem jest prawidłowe zorientowanie siatkówki. Następnie wstrzykniemy DNA do siatkówki, a następnie przeprowadzimy elektromasaż głowy. Dobra, zacznijmy.

Okej, pierwszym krokiem jest ustawienie siatkówki tak, aby była skierowana do góry, tak jak ta. Następnie za pomocą mikropipety przebijemy ścianę owodniową i najlepiej wstrzykniemy DNA bezpośrednio do siatkówki. Po przebiciu ściany macicy wciśnie się tłok, który wyrzuci DNA do siatkówki i pociągnie tłok z powrotem.

W związku z tym, po wstrzyknięciu DNA, powinieneś zobaczyć zielony barwnik wypełniający płyn owodniowy, a także siatkówkę. Okej, teraz, gdy zrobiliśmy zastrzyk, jesteśmy gotowi do elektroporacji. Tak więc, aby pomodlić się elektro, umieścimy łopatki do elektroporacji wokół zarodka, tak aby dodatnia łopatka przylegała do siatkówki, która była paradowana elektrycznie.

A kiedy będziesz gotowy, depresyjna łopatka do stóp, która dostarczy prąd do zarodka. Widać bąbelki tworzące się na łopatce szalki z ujemnym ładunkiem, co pokazuje, że elektroporacja zakończyła się sukcesem. I powtórzysz ten krok dla wszystkich wstrzykniętych zarodków.

W ten sposób elektronicznie paraduje się DNA w jednej embrionalnej siatkówce. Możesz powtórzyć tę procedurę do dowolnej liczby zarodków. Pamiętając, że im więcej embrionów obejmiesz, tym większa szansa, że matka usunie zarodki.

Po elektromasażu zarodków, użyj palców, aby wmasować łańcuch embrionalny z powrotem do matki, gdy zarodki są z powrotem w środku. Wlej około dwóch mililitrów antybiotykowego roztworu przeciwgrzybiczego do jamy brzusznej. Użyj hemostatu i kleszczy, aby zszyć otrzewną, zaczynając od podwójnego węzła w przedniej części nacięcia i kontynuuj prostym ciągłym wzorem szwu do tylnej części nacięcia.

Użyj ostatniej pętli, aby związać szew i przyciąć nadmiar szwu. Na koniec zszyj nacięcie zszywką. Aby to zrobić, podnieś skórę w przedniej części nacięcia kleszczami.

Uważaj, aby oddzielić skórę od otrzewnej. Następnie umieść zęby zszywacza wokół skóry i aby wcisnąć zszywacz, kontynuuj zszywanie nacięcia zamkniętego do tylnego końca, co zwykle wymaga od pięciu do siedmiu zszywek. Po zakończeniu zszywania przetrzyj ranę wokół zszywek wacikiem nasączonym alkoholem.

Pozwól koferdamie zregenerować się na poduszce grzewczej, a następnie umieść ją w nowej klatce. Kiedy zaczyna drgać i przewracać się, zwykle potrzebuje od 15 do 90 minut, aby się obudzić, aby zminimalizować ból i dyskomfort. Matki otrzymują buprenorfinę po przebudzeniu i w późniejszych momentach leczenia.

Jeśli dyskomfort nadal zapobiega odwodnieniu, wstrzyknij koferdamie jeden mililitr soli fizjologicznej podskórnie około dwóch do czterech godzin po operacji. Po 24 godzinach od operacji zapora powinna odzyskać normalne zachowanie i regularnie pić i jeść. Do analizy pobierzemy elektroporowaną siatkówkę w temperaturze E 18,5.

Alternatywnie możesz pozwolić matce urodzić i pobrać siatkówkę w wieku postnatalnym w celu analizy w późniejszym wieku. Po znieczuleniu zwierzęcia użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i otrzewną pod zszywkami. Aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy, usuń elektroporowany zarodek i przypnij zarodek przez kończyny do naczynia preparacyjnego brzuszną stroną do góry, przetnij skórę brzucha i otrzewną oraz przetnij boczne części klatki piersiowej, aby odsłonić serce.

Następnie przekłuj lewą komorę igłą perfuzyjną i przetnij prawy przedsionek mikronożyczkami. Teraz rozpocznij perfuzję i pozwól PFA płynąć przez około 60 do 90 sekund. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, krew powinna wydostać się z prawego przedsionka, a zarodek powinien zblednąć.

Po zakończeniu perfuzji odetnij głowę zarodkowi i zbierz głowy w 4% PF w 15-mililitrowej stożkowej fiolce. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich elektroporowanych zarodków i wszystkich matek. Po zakończeniu zbierania wszystkich zarodków poświęć matkę poprzez zwichnięcie szyjki macicy.

Trzymaj głowy w 4% PFA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie myj w PBS przez kilka dni po umyciu PBS, jesteś teraz gotowy do zbadania siatkówki pod kątem pomyślnej ekspresji GFP. Najpierw umieść głowę w naczyniu separacyjnym z siatkówką skierowaną do góry i zanurz ją w PBS. Usuń skórę z okolic siatkówki, aby odsłonić nabłonek barwnikowy siatkówki lub RPE za pomocą igły o rozmiarze 26 i pół grubości.

Nakłuć siatkówkę brzuszną na złączu RPE soczewki. Następnie włóż jedną krawędź mikronożyczek do tego otworu i wykonaj pionowe nacięcie przez siatkówkę brzuszną do tarczy nerwu wzrokowego. Umożliwi to orientację siatkówki po jej wyjęciu.

Oddziel RPE od siatkówki, chwytając RPE w nacięciu brzusznym jedną parą kleszczy. I użyj kolejnej pary kleszczy, aby odkleić RPE od siatkówki, szczególnie w miejscu połączenia soczewki RPE, gdzie RPE jest mocno przymocowane. Po zdjęciu RPE chwyć obiektyw kleszczami, pociągnij do góry i odsuń.

Aby usunąć soczewkę, ostrożnie usuń siatkówkę, umieszczając kleszcze pod siatkówką i ściśnij głowę nerwu wzrokowego, aby uwolnić siatkówkę. Na koniec przenieś siatkówkę do wypełnionego PBS. Cóż, pamiętaj, aby śledzić, z której siatkówki pochodzi, które głowy powtórz te kroki dla siatkówki przeciwległej i dla wszystkich innych zarodków poddanych elektropostacji, użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby zeskanować całą siatkówkę w poszukiwaniu siatkówki GFP, co wskazywałoby, że elektroporacja powiodła się w tym zarodku, a te siatkówki i odpowiadający jej mózg można przetworzyć do dalszej analizy.

Procedura elektroporacji siatkówki ex vivo wymaga kilku dodatkowych etapów przygotowawczych, które różnią się od elektroporacji in utero. Szczegółowe informacje na temat przygotowania i natleniania pożywki wolnej od surowicy oraz przygotowania naczyń hodowlanych i testów granicznych można znaleźć w pisemnym protokole. Po znieczuleniu zwierzęcia otwiera się jamę brzuszną, jak wykazano wcześniej, a następnie usuwa się cały łańcuch embrionalny i umieszcza w D-M-E-M-F 12 na lodzie.

Zapora powinna zostać następnie poddana eutanazji za pomocą zwichnięcia szyjki macicy. Użyj nożyczek, aby przeciąć ścianę macicy, a następnie usuń zarodki z worka owodniowego i zbierz w D-M-E-M-F 12 i trzymaj na lodzie zdekapitalizowane zarodki i trzymaj w pożywce DMEA, na których ciała lodowe można wyrzucić. Następnie użyj pipety doustnej lub pipety z tłokiem i napełnij mikropipetę żądaną ilością roztworu DNA.

Następnie przenieś jeden. Udaj się do naczynia preparacyjnego z PBS i przypnij głowę grzbietową stroną do góry. Przejdź do zakresu sekcyjnego w celu wykonania zastrzyków.

Dobra, teraz jesteśmy gotowi do electro prate. Zamierzam wstrzyknąć DNA do obwodowej grzbietowej części obu siatkówki, a następnie elektro nakłuć głowę. Dobra, zaczynam.

Pierwszym krokiem jest usunięcie skóry znad siatkówki. Aby to zrobić, użyjemy pęsety tylko do odklejenia skóry. Teraz możemy zobaczyć grzbietową część obu siatkówki.

Następnie zamierzam wstrzyknąć DNA tuż pod warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki w obu siatkówkach. Aby to zrobić, zamierzam trzymać elektrodę w pozycji prawie poziomej i przebić RPE w najbardziej obwodowej grzbietowej części siatkówki. Powinieneś zobaczyć, jak zielony barwnik wypełnia przestrzeń siatkówki i wycieka do roztworu PBS.

Dobra, teraz czas na elektroporację. Najpierw odpinasz głowę. Teraz zamierzamy elektro żerować wiosła i chcemy, aby dodatnie wiosło znajdowało się po brzusznej stronie głowy.

Umieścimy więc głowę w wiosłach z dodatnim wiosłem na powierzchni brzusznej i zastosujemy nacisk, aby wiosło było stabilne w ten sposób. A teraz przejdziemy do electro parade. Możesz zobaczyć bąbelki tworzące się na wiosłu i na czubku głowy.

I to wszystko. Teraz przeniesiemy głowę do naczynia z medianą. To tyle, jeśli chodzi o elektroporację siatkówki ex vivo.

Powtórz tę procedurę dla tylu zarodków i chorób DNA, ile chcesz. Teraz zamierzamy przygotować się do posiewu siatkówki. Po zakończeniu wszystkich przygotowań elektrycznych dodaj około 1,5 mililitra natlenionego roztworu SFM do naczynia z czterema dołkami i trzymaj je na lodzie.

Mieć jedną studzienkę na każdy wstrzyknięty roztwór DNA. Następnie przenieś jeden elektroporowany. Udaj się do naczynia preparacyjnego z D-M-E-M-F 12 z jedną siatkówką skierowaną do góry na brzusznej siatkówce lub stroną przeciwną do obszaru docelowego.

Użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć i wyrwać dziurę w RPE. Użyj tego otworu jako punktu wyjścia do odklejenia RPE z okolic siatkówki. Nie przecinaj ani nie uszkadzaj oka, ponieważ spowoduje to zapadnięcie się siatkówki na siebie podczas inkubacji.

Po usunięciu RPE użyj kleszczyków, aby wysunąć siatkówkę, ściskając nerw wzrokowy u podstawy siatkówki, pozostaw soczewkę nienaruszoną. Przenieś siatkówkę do natlenionego SFM w czterodołkowej misce. Udaj się i powtórz usuwanie siatkówki dla oka przeciwległego.

Wykonaj ten krok dla wszystkich elektroporowanych głów i inkubuj siatkówkę w natlenionym SFM w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin. Po inkubacji całej siatkówki przenieś siatkówkę z jednego dołka natlenionego SFM do pokrywki szalki Petriego z D-M-E-M-F 12. Używając fluorescencyjnej lunety preparcyjnej, wybierz jedną siatkówkę i uwidocznij część siatkówki z dodatnią ekspresją GFP.

Następnie, za pomocą mikroskalpela i kleszczy, wypreparuj i wyrzuć część siatkówki niedodatnią GFP, tak aby pozostał tylko fragment siatkówki z dodatnim GFP. Pomocne jest ciągłe przełączanie się między światłem fluorescencyjnym a zwykłym podczas sekcji. Aby specjalnie wybrać siatkówkę z dodatnim GFP, przenieś fragment siatkówki z dodatnim GFP do studzienki z G-M-E-M-F 12.

Powtórz ten krok dla całej siatkówki z jednego Well, dla każdego warunku DNA, użyj nowej szalki Petriego i pożywki D-M-E-M-F 12, aby wypreparować te GFP dodatnie fragmenty siatkówki na mniejsze siatkówki do posiewu. Użyj lunety preparcyjnej, aby przeciąć duży fragment siatkówki GFP dodatni na mniejszy explan za pomocą mikroskalpela. Plan powinien mieć około 200 do 300 mikrometrów długości i szerokości.

Jeden fragment siatkówki z dodatnim GFP powinien wytworzyć około czterech do 10 GFP dodatniego eksplanu siatkówki Zbierz cały plan w studzience za pomocą D-M-E-M-F 12. Powtórz ten krok dla wszystkich obszarów siatkówki z dodatnim wynikiem GFP, które są zbierane. Po przygotowaniu wszystkich dodatnich warunków GFP do naczyń hodowlanych należy dodać 250 mikrolitrów zimnego SFM plus 0,4% metylocelulozy.

Następnie przenieś od czterech do ośmiu dodatnich eksplanów GFP do naczynia hodowlanego i użyj kleszczy, aby delikatnie ułożyć plan X w wielokąt z x eksplanem znajdującym się w połowie odległości między środkiem a krawędzią naczynia. Określ, która strona planu X jest warstwą RGC. Można to zrobić, szukając kryształów RPE, które czasami mogą pozostać przyczepione do zewnętrznej warstwy siatkówki, co wskazuje, że przeciwna strona to warstwa RGC.

Po stronie RGC zwykle znajdują się również pewne szczątki komórkowe, które mogą pomóc we prawidłowym wyjaśnieniu z warstwą RGC w dół. Za pomocą kleszczy mocno dociśnij środek eksplanu, tak aby przylegał do szklanego szkiełka nakrywkowego na dnie naczynia hodowlanego. Po posianiu wszystkich X explan na szalce hodowlanej przenieś do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Eksplantaty Retinal X wykazują obfity wzrost aksonów po 24 godzinach i mogą być stosowane do wielu testów in vitro, a następnie utrwalane za pomocą 4% PFA przez 30 minut. I barwienie immunologiczne do testu granicznego. Przenieś dodatni plan 4G FP do naczynia, które zostało przygotowane do testu granicznego.

Ułóż eksplantaty X w linii prostej, która jest zbliżona do fluorescencyjnej granicy z interesującym Cię podłożem. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczyków do pokrycia EXPLAN tak, aby znajdowały się około 50 do 150 mikrometrów od granicy fluorescencji. Naprzemiennie między dwoma kanałami fluorescencyjnymi w celu wizualizacji zielonego planu i czerwonej obwódki.

Następnie inkubuj szalki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, dając wystarczająco dużo czasu aksonom RGC na dotarcie do podłoża granicznego. X explan można następnie utrwalić w 4% PFA przez 30 minut, a następnie przeprowadzić barwienie immunologiczne. Po elektroporacji siatkówki in utero.

Mocowania otworów siatkówki można przygotować do wizualizacji GFP dodatnich GC R w siatkówce i częściowo nienaruszonych. Systemy wzrokowe mogą być przygotowane do wizualizacji aksonów GFP dodatnich w całym nerwie wzrokowym, skrzyżowaniu wzrokowym i przewodzie wzrokowym. Alternatywnie, kriogeniczne przekroje czołowe można wykonać przez szlak siatkówki i RGC w celu wizualizacji i analizy ciał komórek RGC GFP dodatnich w siatkówce i aksonach w skrzyżowaniu nerwu wzrokowego i przewodzie pokarmowym.

Wszystkie aksony siatkówki są wizualizowane za pomocą barwienia neurofilamentów. Ponadto in utero, elektroporacja może być stosowana do badania celowania aksonów RGC w bocznym jądrze genowym LGN poprzez zbieranie młodych w P 4 do P 10. W P osiem aksonów GFP dodatnich jest widocznych w LGN z czerwonym kanałem CTB LOR 5 94 wstrzykniętym do siatkówki ipsilateralnej i CT bor 6 47 Blue Channel do przeciwległej siatkówki w celu oznaczenia całej projekcji RGC po elektroporacji ex vivo i posiew implantów siatkówki.

Podzbiór aksonów RGC, RGFP, dodatni i może być wyraźnie wizualizowany zarówno przy niższej, jak i wyższej mocy, jak widać odpowiednio na górnych i dolnych obrazach. Odpowiedź aksonów dodatnich GFP można analizować poprzez posiewanie XS przylegające do granic różnych substratów pokazanych tutaj na niebiesko. Właśnie pokazaliśmy, jak wprowadzić geny do embrionalnej lustrzanej siatkówki za pomocą elektroporacji siatkówki in utero i ex vivo.

Chociaż skupiliśmy naszą analizę na kierowaniu aksonami skrzyżowania wzrokowego, technika ta może być korzystna dla osób badających różnicowanie RGC, morfologię dendrytyczną i właściwości elektrofizjologiczne komórek zwojowych siatkówki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zminimalizowaniu uszkodzenia siatkówki podczas wstrzykiwania DNA i zawsze utrzymywać zarodki nawodnione PBS przez cały czas trwania eksperymentu. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.