Name: Elektroporacja in utero i ex vivo do ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Poznaj elektroporację in utero i ex vivo do manipulacji ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy. Ta metoda pozwala badać rozwój i funkcje RGC w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr. Richardowi Vallee oraz Brikha Shrestha za pomoc odpowiednio w technikach elektroporacji siatkówki in utero oraz ex vivo, a także dr. T. Sakurai za uwagi do niniejszego protokołu. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health F31 NS051008 (T.J.P), Fondation pour la Recherche Medicale oraz Human Frontier Science Program (A.R.) i R01 EY12736 (C.M.).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

W niniejszym filmie zaprezentowano techniki elektroporacji, zarówno in utero, jak i ex vivo, służące do dostarczania genów do embrionalnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) myszy. Elektroporacja siatkówki in utero umożliwia manipulację ekspresją genów w RGC oraz wizualizację ich projekcji aksonalnych in vivo. Przeżycie embrionów w okresie ponatalnym pozwala na zbadanie projekcji tych RGC GFP+ do ich celu, czyli ciała kolankowatego bocznego (LGN). Elektroporacja siatkówki ex vivo zapewnia większą kontrolę nad celowaniem w konkretne obszary siatkówki do wykorzystania w testach in vitro. Połączenie analiz in vivo i in vitro uzyskanych dzięki tym technikom pozwala na szczegółową charakterystykę rozwoju RGC i projekcji aksonalnych w podgrupie RGC na normalnym tle genetycznym. Choć nasza demonstracja skupia się na prowadzeniu aksonów RGC w obrębie skrzyżowania wzrokowego, elektroporacja siatkówki zarówno in utero, jak i ex vivo może być przydatna w badaniu wpływu zaburzeń ekspresji genów na różnicowanie RGC, morfologię dendrytów, właściwości elektrofizjologiczne, tworzenie synaps oraz prawidłowe targetowanie w strefach zakończeń, takich jak LGN i wzgórze górne.

<table><tbody><tr><td>Elektroporator kwadratowy BTX Electro Square Porator ECM 830 (z pedałem nożnym)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe elektrody pęsetowe</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 lub CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Szwy jedwabne</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Szklane mikropipety z tłokami</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-antymykotyczny</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM/F12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Suplement ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Szalki z mikrowyciiskami o szklanym dnie</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Siatkówka oraz jej jedyny neuron wyjściowy, komórka zwojowa siatkówki (RGC), stanowią doskonały model do badania zagadnień biologicznych, takich jak różnicowanie komórek, prowadzenie aksonów, organizacja retinotopowa oraz tworzenie synaps[1]. Jedną z wad jest brak możliwości efektywnej i niezawodnej manipulacji ekspresją genów w komórkach RGC. in vivo, zwłaszcza w inaczej dostępnych szlakach wzrokowych myszy. Myszy transgeniczne mogą być wykorzystywane do manipulowania ekspresją genów, jednak podejście to jest często kosztowne, czasochłonne i może wywoływać niepożądane efekty uboczne. U kurcząt w celu manipulacji ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w badaniach nad rozwojem siatkówki i RGC stosuje się elektroporację in ovo. Chociaż podobne techniki elektroporacji opracowano dla noworodków myszy[2], dorosłych szczurów[3] oraz embrionalnych siatkówek myszy in vitro[4], żadna z tych strategii nie pozwala na pełną charakterystykę rozwoju RGC i projekcji aksonalnych in vivoW tym celu opracowaliśmy dwa zastosowania elektroporacji, z których jedno wewnątrzmacicznie a pozostały ex vivo, aby precyzyjnie ukierunkować działanie na embrionalne komórki zwoju siatkówki (RGC) myszy[5, 6]. 
Dzięki elektroporacji siatkówki in utero możemy wprowadzać nadekspresję lub obniżać poziom ekspresji konkretnych genów w RGC, a następnie śledzić projekcje ich aksonów w drogach wzrokowych in vivo, co umożliwia badanie decyzji dotyczących prowadzenia aksonów w punktach pośrednich, takich jak skrzyżowanie wzrokowe, lub w obszarach docelowych, takich jak boczne ciało kolankowate. Zaburzenie ekspresji genów w podzbiorze RGC na tle organizmu typu dzikiego ułatwia zrozumienie funkcji genów w całej drodze siatkówkowej. Ponadto opracowaliśmy towarzyszącą technikę analizy wzrostu aksonów RGC in vitro. Przeprowadzamy elektroporację głów embrionalnych ex vivo, pobieramy i inkubujemy całą siatkówkę, a następnie po kilku dniach przygotowujemy eksplantaty z tych siatkówek. Eksplantaty siatkówki mogą być wykorzystywane w różnych testach in vitro w celu zbadania reakcji elektroporowanych aksonów RGC na sygnały prowadzące lub inne czynniki. Podsumowując, ten zestaw technik zwiększa nasze możliwości wprowadzania nadekspresji lub obniżania poziomu ekspresji genów w RGC i powinien w znacznym stopniu pomóc w badaniach nad rozwojem RGC i projekcjami aksonów.

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Siatkówka oraz jej jedyny neuron wyjściowy, komórka zwojowa siatkówki (RGC), stanowią doskonały model do badania zagadnień biologicznych, takich jak komórkowe...

Elektroporacja siatkówki in utero rozpoczyna się od nacięcia brzusznego u zanarkizowanej samicy w stadium E 13,5 do 14,5 w celu odsłonięcia łańcucha embrionalnego. DNA jest wstrzykiwane do jednej siatkówki na embrion, a następnie przeprowadzana jest elektroporacja głowy, co powoduje pobranie DNA przez progenitory RGC. W stadium E 18,5 embriony są perfundowane i wykazują ekspresję GFP.Siatkówkę oraz projekcje wzrokowe analizuje się w celu przeprowadzenia elektroporacji siatkówki X vivo. Głowy embrionów z dni E 13.5 do 14.5 są przypinane stroną grzbietową do góry w naczyniu, a następnie do obwodowego regionu grzbietowego obu siatkówek wstrzykuje się DNA, po czym przeprowadza elektroporację. Całe siatkówki hoduje się przez 40 godzin, a następnie wysiewa GFP-dodatnie eksplanty siatkówki do analiz w hodowli in vitro.Cześć, jestem Tim Petros z laboratorium dr Carol Mason w Katedrze Patologii, Biologii Komórki i Neuronauki na Uniwersytecie Columbia. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wprowadzać geny do rozwijającej się siatkówki zarodkowej, wykorzystując elektroporację siatkówki in utero oraz ex vivo. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby badać, w jaki sposób manipulowanie ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki zmienia ich drogi projekcyjne, a konkretnie w obrębie skrzyżowania wzrokowego.Zacznijmy. Przed przystąpieniem do elektroporacji siatkówki in utero niezbędne jest odpowiednie przygotowanie. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania znieczulenia, sterylizacji narzędzi i instrumentarium, sporządzania roztworów DNA do iniekcji oraz roztworów antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych do podania po operacji, a także przygotowania pola operacyjnego i ogrzania odpowiednich roztworów, znajdują się w naszym protokole pisemnym.Przed operacją należy przygotować mikropipety z cienkimi końcówkami, używając wyciągacza mikroelektrod. Odłam końcówkę, aby uzyskać ścięty punkt do elektroporacji in utero. Najpierw wstrzyknij 0,15 milliliters mieszaniny anestetyka dojsłonowo samicy w stadium E 13.5 do E 14.5. Pełna anestezja samicy powinna nastąpić w ciągu od trzech do siedmiu minut; należy sprawdzić, czy mysz jest znieczulona.Uciśnij tylną łapę i sprawdź brak reakcji w odstępie czasu, w którym zwierzę zapada w narkozę. Odetnij mały fragment i nanieś pipetą 5 µL roztworu DNA na param. Zegnij metalowy tłok drutu pod kątem 90 stopni i włóż go do dociągniętej mikro pipety; za pomocą tłoka wciągnij roztwór DNA do mikro pipety.Następnie chirurgicznie odsłoń zarodki myszy. Właściwą technikę opisano w protokole JoVE opracowanym przez Wal Inusa i współpracowników. Teraz możemy przystąpić do elektroporacji.Pierwszym krokiem jest prawidłowe ustawienie siatkówki. Następnie wstrzykniemy DNA do siatkówki, a potem przeprowadzimy elektroporację głowy. Dobrze, zacznijmy.Pierwszym krokiem jest odpowiednie ułożenie siatkówki, tak aby była skierowana w górę, podobnie jak w tym przypadku. Następnie za pomocą mikropipety przebijamy błonę owodniową i w idealnym przypadku wstrzykujemy DNA bezpośrednio do siatkówki. Po przebiciu ściany macicy należy nacisnąć tłok, co spowoduje wprowadzenie DNA do siatkówki, a następnie cofnąć tłok.W związku z tym, po wstrzyknięciu DNA, powinno być widać, jak zielony barwnik wypełnia płyn owodniowy oraz siatkówkę. Dobrze, teraz gdy wykonaliśmy iniekcję, jesteśmy gotowi do elektroporacji. Aby przeprowadzić elektroporację, umieścimy elektrody wokół embrionu, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się obok elektroporowanej siatkówki.Gdy będą gotowe, należy nacisnąć pedał spustowy, który dostarczy prąd do embrionu. Pojawienie się pęcherzyków powietrza na elektrodzie o ładunku ujemnym świadczy o powodzeniu procesu elektroporacji. Należy powtórzyć ten krok dla wszystkich wstrzykniętych embrionów.W ten sposób przeprowadza się elektroporację DNA do jednej siatkówki zarodkowej. Procedurę tę można powtórzyć dla dowolnej liczby zarodków. Należy jednak pamiętać, że im więcej zarodków zostanie poddanych elektroporacji, tym większa szansa na resorpcję zarodków przez matkę.Po przeprowadzeniu elektroforozy embrionów, gdy znajdą się one z powrotem wewnątrz, palcami wmasuj łańcuch embrionalny z powrotem do macicy samicy. Wlej około 2 mL roztworu antybiotyku i leku przeciwgrzybiczego do jamy brzusznej. Używając hemostatu i pęsety, zaszyj otrzewną, zaczynając od podwójnego węzła na przedniej części nacięcia, a następnie kontynuuj prostym szwem ciągłym aż do tylnej części nacięcia.Użyj ostatniej pętli, aby zawiązać szew i odetnij jego nadmiar. Na koniec zamknij nacięcie za pomocą zszywek. Aby to zrobić, unieś skórę w przedniej części nacięcia za pomocą kleszczyków tępych.Należy uważać, aby oddzielić skórę od otrzewnej. Następnie należy umieścić ząbki zszywacza wokół skóry i, naciskając zszywacz, kontynuować zamykanie nacięcia aż do końca tylnego, co zazwyczaj wymaga od pięciu do siedmiu zszywek. Po zakończeniu zszywania należy przetrzeć ranę wokół zszywek gazikiem nasączonym alkoholem.Pozwól samicy dojść do siebie na podkładce grzewczej, a następnie przenieś ją do nowej klatki. Gdy zacznie drgać i przetaczać się, zazwyczaj mija od 15 do 90 minut, zanim całkowicie się obudzi, co pozwala zminimalizować ból i dyskomfort. Matki otrzymują buprenorfinę po przebudzeniu oraz w późniejszych odstępach czasu.Jeśli dyskomfort nadal zapobiega nawodnieniu, wstrzyknij samicy jeden mililitr soli fizjologicznej podskórnie około dwóch do czterech godzin po operacji. Po 24 godzinach od zabiegu samica powinna odzyskać normalne zachowanie i regularnie pić oraz jeść. Siatkówkę poddaną elektroporacji pobierzemy w dniu E 18.5 w celu przeprowadzenia analizy.Alternatywnie można pozwolić matce na urodzenie młodych i pobrać siatkówkę w okresie postnatalnym do analizy w późniejszym czasie. Po znieczuleniu zwierzęcia, należy użyć nożyczek, aby rozciąć skórę i otrzewną pod zszywkami. Aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy, należy wyjąć electroporowany embrion i przypiąć go kończynami do tacki sekcyjnej stroną brzuszną do góry, a następnie rozciąć skórę brzucha oraz otrzewną i rozciąć boczne części klatki piersiowej, aby odsłonić serce.Następnie przebij lewą komorę igłą perfuzyjną i przetnij prawy przedsionek mikronożyczkami. Teraz rozpocznij perfuzję i pozwól na przepływ PFA przez około 60 do 90 sekund. Jeśli czynność została wykonana prawidłowo, krew powinna wypłynąć z prawego przedsionka, a embrion powinien stać się blady.Po zakończeniu perfuzji odetnij głowę zarodka i umieść ją w 4%PF w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Powtórz tę procedurę dla wszystkich elektroporowanych zarodków oraz wszystkich matek. Po zebraniu wszystkich zarodków uśmierć matkę poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.Głowy należy przechowywać w 4% PFA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie płukać w PBS przez kilka dni. Po przemyciu w PBS można przystąpić do badania siatkówki w celu sprawdzenia prawidłowej ekspresji GFP. Najpierw należy przypiąć głowę w naczyniu do sekcji tak, aby siatkówka była skierowana do góry i zanurzona w PBS. Następnie, używając igły o średnicy 26,5 G, należy usunąć skórę z okolic siatkówki, aby odsłonić nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE).Przepuń brzuszna część siatkówki w miejscu styku soczewki z RPE. Następnie włóż jedno ostrze mikronożyczek w ten otwór i wykonaj pionowe nacięcie przez brzuszna część siatkówki aż do tarczy nerwu wzrokowego. Pozwoli to na właściwą orientację siatkówki podczas jej wyjmowania.Oddziel nabłonek barwnika siatkówki (RPE) od siatkówki, chwytając RPE w miejscu nacięcia brzusznego jedną parą pęsety. Użyj drugiej pęsety, aby odwarstwić RPE od siatkówki, szczególnie w miejscu styku RPE z soczewką, gdzie RPE jest mocno przytwierdzony. Po usunięciu RPE chwyć soczewkę pęsetą i wyciągnij ją do góry i na zewnątrz.Aby usunąć soczewkę, ostrożnie wyjmij siatkówkę, umieszczając pęsetę pod nią i ściskając główkę nerwu wzrokowego, aby uwolnić siatkówkę. Następnie przenieś siatkówkę do dołka wypełnionego PBS. Pamiętaj o dokładnym zaznaczeniu, z której główki pochodziła dana siatkówka. Powtórz te kroki dla siatkówki przeciwległej oraz dla wszystkich pozostałych elektroporowanych embrionów. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przeskanować wszystkie siatkówki pod kątem obecności sygnału GFP, co będzie wskazywać na sukces elektroporacji w danym embrionie; takie siatkówki oraz odpowiadające im mózgi mogą zostać poddane dalszej analizie.Procedura elektroporacji siatkówki ex vivo wymaga kilku dodatkowych kroków przygotowawczych, które różnią się od elektroporacji in utero. Szczegółowe informacje na temat przygotowania i natleniania medium beztłuszczowego oraz przygotowania naczyń hodowlanych i analiz brzegowych znajdują się w protokole pisemnym. Po znieczuleniu zwierzęcia otwiera się jamę brzuszną zgodnie z wcześniej zaprezentowaną metodą, a następnie wyjmuje cały łańcuch embrionalny i umieszcza go w D-M-E-M-F 12 na lodzie.Następnie samicę należy poddać eutanazji poprzez zwichnięcie stawów szyjnych. Za pomocą nożyczek należy przeciąć ścianę macicy, a następnie wyjąć embriony z pęcherzyka płodowego, zebrać je do pożywki D-M-E-M-F 12 i przechowywać w lodzie; należy oddzielić głowy embrionów i przechowywać je w pożywce DMEA w lodzie, natomiast ciała można zutylizować. Następnie, używając pipety ustnej lub pipety z tłokiem, należy napełnić mikropipetę odpowiednią ilością roztworu DNA.Następnie przenieś jedną głowę do naczynia sekcyjnego z PBS i przymocuj ją szpilkami stroną grzbietową do góry. Przenieś preparat pod mikroskop sekcyjny w celu wykonania wstrzyknięć.Dobrze, teraz jesteśmy gotowi do elektroporacji. Wstrzyknę DNA do obwodowej części grzbietowej obu siatkówek, a następnie przeprowadzę elektroporację głowy. Dobrze, zaczynam.Pierwszym krokiem jest usunięcie skóry znajdującej się nad siatkówką. W tym celu użyjemy pęsety, aby po prostu odwarstwić skórę. Teraz widzimy grzbietową część obu siatkówek.Następnie wstrzyknę DNA bezpośrednio pod warstwę nabłonka pigmentowego siatkówki w obu siatkówkach. W tym celu będę trzymać elektrodę niemal poziomo i przebiję nabłonek pigmentowy w najbardziej obwodowej, grzbietowej części siatkówki. Powinni Państwo zauważyć, że zielony barwnik wypełnia przestrzeń siatkówki i wycieka do roztworu PBS.Dobrze, teraz czas na elektroporację. Najpierw odpinamy głowę. Teraz będziemy przykładać elektrody, pamiętając, aby elektroda dodatnia znajdowała się po stronie brzusznej głowy.Umieścimy głowę pomiędzy elektrodami, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się na powierzchni brzusznej, i przyłożymy nacisk, aby utrzymać elektrodę stabilnie w ten sposób. Teraz wykonamy elektroporację. Można zauważyć pęcherzyki gazu tworzące się na elektrodzie oraz na górnej części głowy.To wszystko. Teraz przeniesiemy głowę do naczynia z medium. To wszystko w kwestii elektroporacji siatkówki ex vivo.Powtórz tę procedurę dla dowolnej liczby embrionów i wariantów DNA. Teraz przygotujemy się do hodowli siatkówki. Po zakończeniu wszystkich przygotowań elektrod, dodaj około 1,5 milliliters upowietrzonego roztworu SFM do płytki czterodołkowej i trzymaj ją w lodzie.Przeznacz jedną studzienkę dla każdego wstrzykniętego roztworu DNA. Następnie przenieś jeden elektroporowany embrion do naczynia sekcyjnego z medium D-M-E-M-F 12, kładąc siatkówkę stroną skierowaną ku górze na brzusznej stronie siatkówki lub po stronie przeciwnej do obszaru docelowego.Za pomocą precyzyjnej pęsety uchwyć i przerwij ciągłość RPE, tworząc otwór. Wykorzystaj ten otwór jako punkt wyjścia do oddzielenia warstwy RPE od powierzchni siatkówki. Nie należy przeciąć ani uszkodzić gałki ocznej, ponieważ spowoduje to zapadnięcie się siatkówki podczas inkubacji.Po usunięciu RPE użyć pęsety, aby wysunąć siatkówkę, ściskając nerw wzrokowy u podstawy siatkówki; soczewkę pozostawić nienaruszoną. Przenieść siatkówkę do natlenionego SFM w płytce czterodołkowej. Odwrócić głowę i powtórzyć procedurę usuwania siatkówki dla oka przeciwległego.Powtórz ten krok dla wszystkich poddanych elektroporacji głów i inkubuj siatkówkę w natlenionym SFM w temperaturze 37 °C przez 40 do 48 godzin. Po inkubacji całej siatkówki przenieś ją z dołka z natlenionym SFM na pokrywkę szalki Petriego z D-M-E-M-F 12. Używając fluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego, wybierz jedną siatkówkę i zwizualizuj część siatkówki wykazującą pozytywną ekspresję GFP.Następnie, używając mikroskalpela i pęsety, wypreparuj i usuń część siatkówki niewykazującą ekspresji GFP, tak aby pozostał jedynie fragment siatkówki GFP-dodatni. Pomocne jest ciągłe przełączanie między światłem fluorescencyjnym a zwykłym podczas preparowania. Aby precyzyjnie wyselekcjonować GFP-dodatnią siatkówkę, przenieś GFP-dodatni fragment siatkówki do studzienki z G-M-E-M-F 12.Powtórz ten krok dla wszystkich siatkówek z jednej studzienki; dla każdego stanu DNA użyj nowej płytki Petriego i pożywki D-M-E-M-F 12, aby podzielić te GFP-dodatnie fragmenty siatkówki na mniejsze eksplanty siatkówki do wysiewu. Używając stereomikroskopu, potnij duży fragment GFP-dodatniej siatkówki na mniejsze eksplanty za pomocą mikroskalpela. Eksplanty powinny mieć około 200 do 300 micrometers długości i szerokości.Jeden fragment siatkówki wykazujący ekspresję GFP powinien dać od czterech do 10 eksplantów siatkówki GFP-dodatnich. Zbierz wszystkie eksplanty do studzienki z DMEM/F12. Powtórz ten krok dla wszystkich pobranych regionów siatkówki wykazujących ekspresję GFP. Po przygotowaniu wszystkich GFP-dodatnich eksplantów siatkówki, dodaj 250 µL zimnego SFM z dodatkiem 0,4% metylocelulozy do naczyniaków hodowlanych powlekanych lamininą.Następnie przenieś od czterech do ośmiu dodatnich pod względem GFP eksplantów na płytkę hodowlaną i za pomocą pęsety delikatnie ułóż eksplanty X w kształt wieloboku, tak aby eksplanty x znajdowały się w połowie odległości między środkiem a krawędzią płytki. Ustal, która strona eksplantu X stanowi warstwę RGC. Można to zrobić, szukając kryształków RPE, które czasami pozostają przyczepione do zewnętrznej warstwy siatkówki, co wskazuje, że strona przeciwna jest warstwą RGC.Strona RGC zazwyczaj zawiera również szczątki komórkowe, które mogą wspomóc właściwe ułożenie eksplantu warstwą RGC do dołu. Za pomocą pęsety mocno dociśnij środek eksplantu, aby przylgał do szklanego zakrywek na dnie naczynia hodowlanego. Po wyłożeniu wszystkich X eksplantów na naczyniu hodowlanym, przenieś je do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Eksplanty siatkówki X wykazują obfity wzrost aksonów po 24 godzinach i mogą być wykorzystywane w licznych testach in vitro, a następnie są utrwalane w 4% PFA przez 30 minut. Następnie wykonuje się immunobarwienie dla testu granicznego. Przenieś eksplanty dodatnie dla 4G FP do naczynia przygotowanego do testu granicznego.Ułóż X eksplantów w linii prostej, która odpowiada fluorescencyjnej granicy Twojego badanego podłoża. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, używając pęsety, nanieś EKSPLANTY w taki sposób, aby znajdowały się około 50 do 150 µm od fluorescencyjnej granicy. Przełączaj się pomiędzy dwoma kanałami fluorescencji, aby wizualizować zielony eksplant oraz czerwoną granicę.Następnie inkubuj szalki w temperaturze 37°C przez 24 godziny, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na dotarcie aksonów RGC do podłoża granicznego. Następnie X explan można utrwalić w 4% PFA przez 30 minut, a następnie poddać barwieniu immunologicznemu. Po przeprowadzeniu elektroporacji siatkówki in utero.Preparaty siatkówki w formie wycinków z otworem można przygotować w celu wizualizacji komórek zwojowych siatkówki (RGC) wykazujących ekspresję GFP w obrębie siatkówki oraz w stanie częściowo zachowanym. Układy wzrokowe można przygotować tak, aby uwidocznić aksony GFP-dodatnie wzdłuż nerwu wzrokowego, skrzyżowania wzrokowego i drogi wzrokowej. Alternatywnie można wykonać czołowe skrawki krioistyczne przez siatkówkę i drogę RGC, aby zwizualizować i przeanalizować ciała komórek RGC GFP-dodatnich w siatkówce oraz aksony w nerwie, skrzyżowaniu i drodze wzrokowej.Wszystkie aksony siatkówkowe są wizualizowane za pomocą barwienia neurofilamentów. Ponadto można zastosować elektroporację in utero do badania kierowania aksonów RGC do bocznego kolanka ciała czymkowego (LGN) poprzez pobieranie szczeniąt w dniach od P4 do P10. W dniu P8 aksony dodatnie pod kątem GFP są widoczne w LGN, przy zastosowaniu CTB LOR 5 94 (kanał czerwony) wstrzykniętego do siatkówki ipsilateralnej oraz CTB bor 6 47 (kanał niebieski) do siatkówki kontralateralnej w celu oznakowania całej projekcji RGC po elektroporacji ex vivo i wysianiu implantów siatkówkowych.Podzbiór aksonów RGC wykazuje dodatni wynik w kierunku RGFP i może być wyraźnie zwizualizowany zarówno przy mniejszym, jak i większym powiększeniu, co przedstawiono odpowiednio na górnym i dolnym obrazie. Odpowiedź aksonów z dodatnim wynikiem GFP można analizować poprzez wysiew XS sąsiadujących z krawędziami różnych podłoży, zaznaczonych tutaj na niebiesko. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wprowadzania genów do embrionalnej lustrzanej siatkówki z wykorzystaniem elektroporacji siatkówki in utero oraz ex vivo.Chociaż w naszej analizie skupiliśmy się na prowadzeniu aksonów w skrzyżowaniu wzrokowym, technika ta może być przydatna dla osób badających różnicowanie RGC, morfologię dendrytów oraz właściwości elektrofizjologiczne komórek zwojowych siatkówki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować uszkodzenia siatkówki podczas wstrzykiwania DNA oraz zawsze dbać o nawodnienie embrionów za pomocą PBS przez cały czas trwania eksperymentu. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w eksperymentach.

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In utero i ex vivo elektroporacja dla ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Poznaj elektroporację in utero i ex vivo do manipulacji ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy. Ta metoda pozwala badać rozwój i funkcje RGC w modelu zwierzęcym.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów