Umieszczanie kuleczek pokrytych czynnikami wzrostu w eksplantach grzbietowej części przedmózgowia

Oto pierwszy rodzaj kulek, których użyję. Są to niebieskie kuleczki żelowe. Są one miękkie.

Zatem na końcu pipety ustnej muszę użyć szklanej pipety zbiorczej, aby umieścić te kuleczki na Xs. Drugim rodzajem kuleczek, który zaprezentuję, są akrylowe kuleczki z heparyną. Są to kuleczki o sztywnej strukturze, które umieszczę na eksplantach X za pomocą igły wolframowej. Oto szklane rurki kapilarne, które najpierw stopię przy użyciu palnika Bunsena.

Następnie wyciągnę je, aby utworzyć cieńszą końcówkę. Trzymam rurkę kapilarną w środku płomienia i obracam ją w miarę topnienia rurki. Czuję, jak staje się miękka.

Wyjmę rurkę z płomienia, a następnie ją wyciągnę. Za pomocą tego rysika z diamentową końcówką nacinam linię w poprzek kapilary, aby uzyskać ładne, proste cięcie. Następnie wypoleruję końce w płomieniu w celu ich oczyszczenia.

Przesunę kapilarę przez płomień, aby wypolerować jej koniec i zwęzić otwór, co pozwoli na uchwycenie koralika i zapobiegnie jego przejściem przez kapilarę. Ważne jest, aby nie trzymać rurki kapilarnej w płomieniu zbyt długo. Powinien to być bardzo szybki ruch, w przeciwnym razie otwór zostanie zamknięty.

Zazwyczaj przygotowuję kilka takich elementów, ponieważ w wielu z nich końcówka zostaje zapieczona przez płomień. Jest to trudne do kontrolowania, dlatego należy przygotować ich więcej. Jest to przykład elementu, w którym końcówka została zapieczona.

Oto przykład prawidłowo użytej pipety. Odpipetowałem 250 µL kulek alginianowych do tej probówki typu Eppendorf i zamierzam przemyć je pięciokrotnie 1 mL PBS, aby usunąć roztwór azydkowy, w którym były namoczone. Odczekam około trzech minut, aby kulki osiadły, a następnie odessam nadmiar PBS i powtórzę tę czynność jeszcze cztery razy.

Kuleczki nie osiadły jeszcze całkowicie, zatem po ich osiadaniu odessam nadmiar PBS i powtórzę tę czynność czterokrotnie. Na koniec dodam 300 µL PBS i rozpocznę pracę z kuleczkami. Jest to standardowa pipeta ustna; wezmę przygotowaną kapilarę i wsunę ją mniej więcej do jednej trzeciej wysokości pipety.

Najpierw napełnij pipety roztworem PBS. Zazwyczaj napełniają się one samoistnie dzięki działaniu kapilarnemu. Tutaj znajduje się pokrywka od szalki hodowlanej o średnicy 30 mm, na której umieściłem kroplę niebieskich kuleczek.

A obok znajduje się mała kropla PBS. W tym naczyniu znajdują się krople 5 µL roztworu białka. W tym przypadku jest to B and P four, ale za pomocą pipety można użyć dowolnie wybranego białka.

Przeniosę koralik z tego niebieskiego okręgu, a następnie wypłuczę go raz w kropli PBS. Potem pobiorę koralik pipetą ustną, umieszczę go w kropli roztworu białka i inkubuję go w temperaturze pokojowej przez około godzinę lub w temperaturze 4°C przez kilka godzin. Tutaj widać grupę koralików w PBS i muszę wybrać te o odpowiedniej wielkości.

Jeśli będą zbyt małe, po prostu prześlizgną się przez pipetę ustną. Muszą pozostać na jej końcu. W tej chwili widzą Państwo, że wybrałem kilka kulek: trzy większe i trzy mniejsze.

W eksperymencie wykorzystam większe kuleczki. Przeniosę teraz dużą kuleczkę z kropli PBS do kropli roztworu białka. Aby to zrobić, delikatnie cofnę język z pipety ustnej.

Nie chodzi o ruch ssący, lecz jedynie o przyłożenie podciśnienia. Następnie przeniosę to i w zasadzie ponownie przyłożę język do otworu. Głowica pipety, nie dmuchając, a jedynie wywierając nadciśnienie, aby wypchnąć koralik z końcówki.

W kropli roztworu białka znajduje się teraz pięć kuleczek; będę je inkubować w temperaturze 4°C przez kilka godzin lub alternatywnie w temperaturze pokojowej od pół godziny do godziny. Jest to szalka hodowlana zawierająca membranę pływającą w medium wraz z preparatami, które już wypreparowałem. Za pomocą końcówki pipety pobiorę teraz nieco medium.

Kuleczki wypłuczę w kropli medium tylko jeden raz bezpośrednio przed umieszczeniem ich na powierzchni X. To są igły wolframowe, których będę używać do pobierania i umieszczania akrylowych kuleczek. To jest igła wolframowa, obecnie znajduje się w uchwycie.

A oto wysokiej jakości pęseta, wygięta pod kątem 45 stopni. Użyję pęsety z igłą wolframową, aby podnieść kuleczkę z tej objętości PBS i przenieść ją do kropli roztworu białka.

Tak jak w przypadku kulek żelowych, wypłukałem te kuleczki akrylowe pięciokrotnie w PBS i przeniosłem kroplę na tę płytkę. Następnie za pomocą igły wolframowej w pincecie przeniosę kuleczkę do kropli białka i przeprowadzę inkubację w taki sam sposób, jak w przypadku kulek żelowych.

Procedura polega na podniesieniu kuleczki. Opieram prawą dłoń stabilnie o stół i używam lewego palca wskazującego do ustabilizowania igły podczas zanurzania jej w cieczy. Delikatnie dotykam kuleczki igłą i powoli wyjmuję ją z cieczy. Czasami kuleczka spada z igły, w takim przypadku należy po prostu spróbować ponownie z inną.

Teraz w lewej ręce trzymam pęsetę pod kątem 45 stopni. Kierując końcówkami w dół, dotykam koralika i igły cieczy, a następnie używam końcówki pęsety, aby delikatnie go odepchnąć.

W tej chwili mam pięć kulek w białku. Dobrze, prawą ręką trzymam igłę wolframową w kulce, a lewą ponownie pincetę z końcem skierowanym w dół, w ten sam sposób, w jaki odpychałem cztery poprzednie; zrobię to ponownie tutaj na x explan. Inkubować w 37 °C, a czas zależy od konkretnego testu.