Name: Izolacja ludzkich wysp trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania i hodowli ludzkich wysp trzustkowych z wykorzystaniem gradientu Ficolla. Technika ta zapewnia wysoką czystość i jakość wysp niezbędnych do skutecznej transplantacji klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez fundusze z University of Illinois at Chicago, a także grant NIH dla Islet Cell Resource Center (RFA-RR 05-003), Christopher Foundation, Efroymson Foundation oraz Tellabs Foundation.

1. Oczyszczanie wysepek
<ol>
<li>Aby rozpocząć procedurę oczyszczania wysepek, napełnij worek COBE, zaklempsuj wszystkie przewody z wyjątkiem zielonego i ustaw prędkość na 1 500 oraz super out na 0.</li>
<li>W komorze z laminarem przygotuj pompę oraz zlewki z gradientami i podłącz przewód do zbierania do zielonego przewodu.</li>
<li>Można teraz rozpocząć ładowanie Ficoll 1.100: naciśnij „spin”, dodaj 110 ml Ficoll 1.100 do przedniej zlewki i uruchom pompę, aby napełnić worek COBE. W miarę ładowania Ficollu naciśnij super out, zatrzymaj pompę, odepnij zacisk z głowicy pompy i ustaw prędkość super out na 100.</li>
<li>Gdy Ficoll dotrze do zlewki i całe powietrze zostanie usunięte z przewodów, ponownie zaklempsuj głowicę pompy. Ustaw prędkość wirowania (spin speed) na 3 000, a prędkość super out na 0.</li>
<li>Przygotuj się teraz do ładowania gradientów, wlewając gradient ciężki do przedniej zlewki. Lekko poluź zacisk między dwiema zlewkami, aby usunąć powietrze. Następnie wlej gradient lekki do tylnej zlewki.</li>
<li>Włącz mieszadło magnetyczne, naciśnij „spin” w urządzeniu COBE, zdejmij zacisk z przewodu łączącego obie zlewki i wizualnie sprawdź, czy gradienty ciężki i lekki mieszają się.</li>
<li>Gdy gradienty zaczną się mieszać, włącz wirówkę. Odczekaj jedną minutę, a następnie uruchom pompę, aby załadować mieszające się gradienty.</li>
<li>Aby załadować tkankę, pozwól, aby poziom gradientu w przedniej zlewce opadł, ale nie na tyle nisko, by powietrze mogło dostać się do przewodu doprowadzającego, następnie ponownie zaklempsuj przewód łączący zlewki i załaduj tkankę.</li>
<li>Kontynuuj dodawanie pozostałej tkanki. Następnie przemyj probówkę, w której znajdowała się tkanka, 50 ml roztworu piorącego i użyj go do wypłukania przedniej zlewki.</li>
<li>W momencie, gdy ostatnia część tkanki trafi do worka, jednocześnie zatrzymaj pompę, odepnij zacisk z głowicy pompy i zaklempsuj przewód powyżej worka. Kontynuuj wirowanie przez 5 minut.</li>
<li>Podczas wirowania przenieś 12 probówek do zbierania do komory z laminarem i poluź ich nakrętki. Podłącz przewód do zbierania do żółtego przewodu i umieść sterylną końcówkę do zbierania w probówce stożkowej nr 1. Następnie odepnij zacisk z żółtego przewodu i zaklempsuj zielony przewód.</li>
<li>Po zakończeniu wirowania powoli zwiększ Superout do 100. Zbierz 150 ml do probówki 1. Następnie zbierz po 30 ml do probówek 2-12 (od 200 do 230 ml).</li>
<li>Po zakończeniu zbierania naciśnij „STOP” w urządzeniu COBE. Po zakończeniu oczyszczania wysepki mogą zostać poddane ocenie i hodowli.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek i hodowla
<ol>
<li>Po zebraniu frakcji oczyszczonych wysepek, pobierz próbkę z każdej z 12 probówek do zbierania i zabarw ditiizonem. Barwienie pozwoli określić, które warstwy zawierają wysepki o wysokiej czystości, a które o niskiej czystości.</li>
<li>Zbierz tkanki o wysokiej i niskiej czystości i połącz je odpowiednio w osobne grupy.</li>
<li>Wwiruj i przemyj dwukrotnie. Po drugim przemyciu uzupełnij objętość każdej z grup do 250 ml za pomocą medium do końcowego przemywania (Final Wash media).</li>
<li>Aby ocenić połączone frakcje, pobierz dwie próbki po 1 ml z frakcji o wysokiej czystości oraz jedną próbkę 1 ml z frakcji o niskiej czystości. Przenieś każdą próbkę 1 ml do probówki stożkowej zawierającej 9 ml roztworu do przemywania.</li>
<li>Następnie przenieś 1 ml z każdej probówki 15 ml do komory licznikowej. Obejrzyj i policz komórki pod mikroskopem.</li>
<li>Po policzeniu komórek oblicz liczbę kolb potrzebnych do hodowli wysepek, korzystając z następującego wzoru: (całkowita liczba EIN / czystość wysepek zapisana ułamkowo) / (30 000 EIN na kolbę). Na przykład 100 000 wysepek o czystości 90% hoduje się w 4 kolbach.</li>
<li>Przenieś wysepki do kolb T175 i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37˚C i przy 5% CO2.</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

Pomimo znaczących postępów w technikach izolacji wysepek trzustkowych u ludzi, wydajność uzyskiwania wysepek pozostaje wysoce zmienna i nieprzewidywalna. Oczyszczanie strawionej tkanki trzustki jest kluczowe dla odzyskania wystarczającej masy wysepek po udanym trawieniu enzymatycznym w celu przeprowadzenia transplantacji. Zaleca się metodę oczyszczania UIC, ponieważ za pomocą tej metody wykazano lepszą odzyskiwalność wysepek ludzkich o wysokim stopniu czystości. Ponadto, w jednym cyklu oczyszczania w systemie Cobe można ...

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>wyposażenie</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Procesor komórek Cobe 2991</td><td>sprzęt</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>oczyszczanie wysepek trzustkowych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony MZ6 TLBD4.1</td><td>wyposażenie</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli komórkowej z siatką 2 mm</td><td>wyposażenie</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>liczenie wysepek</td></tr><tr><td>Cyfrowy celownik DS L1</td><td>wyposażenie</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>workek COBE</td><td>sprzęt jednorazowy</td><td>Roztwór O.R.</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>kolba do hodowli T175</td><td>sprzęt jednorazowy</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>roztwór University of Wisconsin (UW)</td><td>odczynnik</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>odczynnik</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>podłoże M199 (roztwór do płukania)</td><td>odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ostatnie przemycie/pożywka hodowlana</td><td>odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dytyzon</td><td>odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: część ii: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Leczenie cukrzycy typu 1 jest obciążeniem zarówno dla jednostki, jak i społeczeństwa, generując roczne koszty przekraczające 100 miliardów dolarów. Pomimo powszechnego stosowania monitorowania glikemii i nowych preparatów insuliny, u wielu osób nadal rozwijają się wyniszczające powikłania wtórne. Transplantacja wysepek trzustkowych może przywrócić niemal prawidłową kontrolę poziomu glukozy u pacjentów z cukrzycą1bez ryzyka wystąpienia ciężkich epizodów hipoglikemii związanych z intensywną insulinoterapią. Zapewnienie odpowiedniej masy wysepek jest kluczowe dla sukcesu transplantacji wysepek. Jednakże charakterystyka dawców, sposób pozyskania oraz konserwacja narządów wpływają na końcowy wynik izolacji2Na Uniwersytecie Illinois w Chicago (UIC) opracowaliśmy skuteczny protokół izolacji z ulepszonym gradientem oczyszczania3Program rozpoczął się w styczniu 2004 roku i do listopada 2008 roku wykonano ponad 300 izolacji. Trzustki przesyłano w chłodnych roztworach do konserwacji (UW, University of Wisconsin lub HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate)4-7do Laboratorium Izolacji Komórek w UIC w celu izolacji wysepek. Wysepki trzustkowe zostały wyizolowane metodą UIC, która jest zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Ricordiegoi in. 8Zgodnie z opisem w Części I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki, ludzka trzustka została przycięta, kaniulowana, przepłukana i poddana trawieniu. Po pobraniu i inkubacji w roztworze UW przez co najmniej 30 minut, tkankę umieszczono w separatorze komórek (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) w celu puryfikacji.3Po oczyszczaniu określono wydajność wysepek (wyrażoną jako ekwiwalenty wysepek, IEQ), objętość tkanki oraz stopień czystości zgodnie ze standardowymi metodami9Wyizolowane wyspy hodowano w pożywce CMRL-1066 (Mediatech, Herndon, VA), uzupełnionej o 1,5% albuminy ludzkiej, 0,1% insulinowo-transferryno-selenowej (ITS), 1 ml cyprofloksacyny, 5 ml 1M HEPES oraz 14,5 ml 7,5% wodorowęglanu sodu, w kolbach T175 w temperaturze 37°C w hodowli nocnej przed transplantacją wysp lub ich wykorzystaniem w badaniach.

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Leczenie cukrzycy typu 1 stanowi obciążenie zarówno dla jednostki, jak i społeczeństwa, generując roczne koszty przekraczające 100 miliardów dolarów. Pomimo powszechnego stosowania ...

W tym filmie tkanka trzustki, która została wcześniej wyizolowana i poddana trawieniu, zostaje poddana oczyszczaniu w gradiencie w probówce, co pozwoli na uzyskanie oczyszczonej frakcji wysepek trzustkowych, które ostatecznie mogą być hodowane w kolbach do hodowli tkankowej aż do momentu transplantacji. Cześć, jestem American Chief z Programu Wysepek Ludzkich w Departamencie Chirurgii na Uniwersytecie Illinois w Chicago. Cześć, nazywam się Barbara Barbero i również pracuję w Programie Wysepek Ludzkich.Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji ludzkich wysepek trzustkowych. Stosujemy tę procedurę w naszej placówce w celu pozyskania wysokiej jakości ludzkich wysepek do zastosowań klinicznych. Zacznijmy.Aby rozpocząć procedurę oczyszczania oczek, załaduj worek COBE, zaklemuj wszystkie dreny z wyjątkiem zielonego, a następnie w dygestorium ustaw prędkość na 1500 i wartość super out na zero. Przygotuj pompkę i zlewki do gradientu, a następnie podłącz dreny do zbierania próbek do zielonego drenu. Teraz można rozpocząć ładowanie FI, naciskając przycisk spin.Następnie dodaj 110 milliliters fi. Call do przedniego zlewka i uruchom pompę, aby napełnić worek COBE. Gdy fi call zostanie zaciągnięt

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie wysp trzustkowych u ludzi: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysp trzustkowych

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę oczyszczania i hodowli ludzkich wysp trzustkowych z wykorzystaniem gradientu Ficolla. Technika ta zapewnia wysoką czystość i jakość wysp niezbędnych do skutecznej transplantacji klinicznej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Przeglądaj więcej filmów