Name: Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 27 s
Description: Poznaj metodę mikrodisekcji i hodowli czuciowo-ruchowych neuronów z gangliów Aplysia. Technika ta umożliwia badanie tworzenia synaps i plastyczności synaptycznej w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca w laboratorium polegająca na hodowli neuronów Aplysia jest finansowana przez listę NIH R01 i NIH R21MH077921.

Przygotowanie (zobacz sekcję rozwiązań na końcu protokołu, aby zapoznać się z kompozycją roztworów)
<ol>
<li>Przygotuj potrawy kulturowe. Pokryj szklaną studzienkę naczynia hodowlanego ze szklanym dnem Mattek poli-l-lizyną (wykonaną z boranu sodu). Dodaj tyle, aby całkowicie dobrze przykryć szklankę i pozostaw na > 1 godzinę (można zostawić na noc). Dokładnie usuń poli-l-lizynę, spłukując ją w sztucznej wodzie morskiej (ASW) 4-5 razy. Po usunięciu ostatniego płukania dodaj 2 ml 50% L15 (uzupełnionego solami i zawierającego L-glutaminę w końcowym stężeniu 2mM)/50% hemolimfy. Pożywka hodowlana musi znajdować się w naczyniu przez co najmniej godzinę przed posianiem komórek, tak aby hemolimfa pokryła szalkę. </li>
<li>Umyj narzędzia i naczynia Sylgard etanolem, dokładnie wypłucz je ddH20, a następnie umieść na >1 godzinę pod lampą UV w okapie hodowlanym. </li>
<li>Przygotuj ostre elektrody do mikrodysekcji neuronów. Za pomocą ściągacza mikroelektrod (np. Sutter Flaming Brown P-97) wyciągnij szklane elektrody do pipet o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej od 0,86 do 1,12 mm i długości 100 mm (np. katalog systemu AM #628000; Światowe instrumenty precyzyjne TW150-4, 1.55/1.12). Użyj parametrów, które wytwarzają elektrodę z długą i delikatną cienką końcówką o tak wysokiej rezystancji, że nie ma kapilarnego pobierania płynu po umieszczeniu w roztworze. Obecność płynnej menisku oznacza, że końcówka elektrody uszkodzi neuron podczas izolacji. Książka kucharska elektrod Sutter zawiera doskonałe wskazówki dotyczące konfiguracji programów elektrod. Używamy filamentu pudełkowego i jednoetapowego pociągnięcia do generowania elektrod hodowlanych. </li>
<li>Przygotować roztwór znieczulający (0,35 M MgCl2), pożywkę hodowlaną (L15 uzupełnioną solami i hemolimfą) i roztwór proteazy (1% proteazy typu IX, Sigma, 1 jednostka/mg, do końcowego stężenia 10 jednostek/ml). </li>
<li>Zwierzęta: użyć dorosłej 80-100 g Aplysia do izolacji neuronów czuciowych i neuronów ruchowych LFS. Użyj młodzieńczej 1-4 g Aplysia do izolacji neuronów ruchowych L7. Delikatnie wyjmij zwierzęta ze zbiorników z wodą morską i trzymaj w wodzie morskiej (w zlewce, wiadrze lub plastikowej torbie) nie dłużej niż 30 minut przed rozpoczęciem procedury znieczulenia i hodowli.</li>
</ol>
Procedura hodowli
A. Hodowla opłucnowych neuronów czuciowych z 80-100 g Aplysia
<ol>
<li>Znieczulić zwierzęta w celu usunięcia zwojów: Wstrzyknąć 0,35 M MgCl2 do dorosłej Aplysia (80-100 g) za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml z igłą 1,5 cala o rozmiarze 18. Wejdź w stopę zwierzęcia pod kątem około 35 stopni i nie wchodź zbyt głęboko. Celem jest wstrzyknięcie do hemofelu zwierzęcia bez przenikania do narządów wewnętrznych. Zwierzę powinno stać się bardzo rozdęte i zrelaksowane.</li>
<li>Wypreparuj zwoje: Przypnij znieczulone zwierzę do naczynia preparacyjnego, za pomocą szpilki (igły o rozmiarze 18 dobrze sprawdzają się w przypadku zwierząt o wadze 80-100 g) na głowie i ogonie, a stopą skierowaną do góry. Przytrzymaj stopę kleszczami zębatymi i przetnij skórę i leżącą pod nią tkankę łączną na całej długości stopy (od głowy do ogona) nożyczkami chirurgicznymi. Przypnij obie strony do dołu. Za pomocą kleszczy i nożyczek przetnij przełyk i pociągnij na bok, aby odsłonić zwoje. Za pomocą cienkich kleszczy i cienkich nożyczek wytnij zwoje pedału opłucnej (neurony czuciowe znajdują się w zwojach opłucnej). Pozostaw sporo nerwu, ponieważ ułatwia to przygwożdżenie zwojów po leczeniu proteazą.</li>
<li>Trawienie zwojów przez proteazę: Umieść zwoje w roztworze proteazy (10 mg/ml 1 jednostki/mg w L15) w inkubatorze ustawionym na 34,5°C (34-35°C jest w porządku) na 2 godziny i 15 minut. Używając kleszczyków z cienką końcówką, aby trzykrotnie przenieść i umyć zwoje w ASW. Utrzymuj zwoje w L15. Należy pamiętać, że czas inkubacji proteazy może się różnić. Celem jest umożliwienie łatwego usunięcia tkanki łącznej. Jeśli zbyt trudno jest usunąć zwoje nerwowe bez uszkodzenia neuronów, wydłuż czas inkubacji proteazy. Jeśli niezwykle łatwo jest usunąć osłonkę z zwojów, a neurony są "miękkie", skróć czas inkubacji proteazy.</li>
<li>Usuwanie osłony zwojów nerwowych: Przenieść zwoje trawione przez proteazę do naczynia o średnicy 60 mm lub 35 mm zawierającego sylgard i L15. Oglądając pod mikroskopem stereoskopowym (z zewnętrznym oświetleniem halogenowym), usuń zwoje pedału i przypnij zwoje opłucnej w szalce Sylgarda we właściwej orientacji za pomocą szpilek do owadów i cienkich kleszczy. Za pomocą cienkich kleszczyków i nożyczek chirurgicznych Vanna ostrożnie podnieś tkankę łączną i przetnij ją, aby odsłonić skupisko czuciowe. Uważaj, aby nigdy nie dotknąć ani nie uszkodzić somatów neuronalnych. Usuń nadmiar tkanki łącznej z naczynia i dodaj więcej pożywki, uważając, aby nigdy nie wystawiać zdewastowanego ganglionu na działanie powietrza.  Klaster czuciowy składa się z około 200 skupionych neuronów o średnicy 40-50 mikronów. Ustaw szpilkę, aby zrobić "słupek" w niewielkiej odległości od ganglionu (w polu widzenia).</li>
<li>Izolacja neuronów: Używając długiej, ostrej szklanej elektrody hodowlanej, wyciągnij zidentyfikowane neurony jeden po drugim, dotykając ciała komórki tuż poza środkiem (nie wbijaj na pal) i powoli i systematycznie odciągając somę komórkową wraz z aksonem od zwoju. Delikatnie dotknij szpilki, aby usunąć neurony z elektrody. </li>
<li>Posiewanie neuronów: Użyj pipetmana (P10), aby przenieść pojedyncze neurony z szalki Sylgarda do szalki hodowlanej. Przed przeniesieniem neuronów należy odpipetować pożywkę hodowlaną do końcówki, tak aby plastikowa końcówka była pokryta hemolimfą (zapobiega to przywieraniu neuronów do plastiku). Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie narażać neuronów na działanie pęcherzyków powietrza lub jakichkolwiek ekstremalnych sił (tj. należy bardzo delikatnie pobierać i usuwać neurony z pipetownika). Rozłóż neurony równomiernie w całym naczyniu. Użyj ostrej elektrody, aby delikatnie wyprostować procesy i stukać nimi do dołu. </li>
<li>Inkubacja: Pozostawić naczynia na stoliku mikroskopowym w temperaturze pokojowej na nie mniej niż 3 godziny. Rutynowo zostawiamy je na noc. Upewnij się, że stolik mikroskopu nie jest zakłócony w tym okresie. Przykryj scenę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Delikatnie przenieś je do inkubatora o temperaturze 18°C. </li>
<li>Kultury powinny przylegać do naczynia w ciągu około 3 godzin, a nowy wzrost neurytów powinien być widoczny w ciągu około 6-12 godzin. Wzrost izolowanych neuronów czuciowych osiąga plateau przez DIV 3 lub 4. Zauważ, że izolowane neurony czuciowe nie tworzą ze sobą autapsów ani synaps chemicznych, chociaż tworzą połączenia elektryczne.</li>
</ol>
B. Przygotowanie kokultur neuronów czuciowo-ruchowych
Neurony czuciowe tworzą synapsę z docelowymi neuronami ruchowymi w kulturze. Najczęściej stosowanymi neuronami ruchowymi są neurony ruchowe LFS i neuron ruchowy L7 ze zwoju brzusznego. Neurony ruchowe LFS są izolowane od dorosłej (80-100 g) Aplyzji, a na zwój brzuszny przypada około 20 neuronów ruchowych LFS. Neuron ruchowy L7 jest izolowany od młodych (1-4 g) zwierząt, a na zwoje brzuszne przypada tylko jeden L7. Neurony ruchowe LFS mają średnicę 40-50 mikronów, są przeplatane neuronami czuciowymi LE w pobliżu korzenia nerwu syfonowego na brzusznej powierzchni zwojów brzusznych i charakteryzują się subtelną ciemną plamką pigmentową w każdej somie. Neuron ruchowy L7 ma średnicę 100-150 mikronów i jest obecny na grzbietowej powierzchni zwoju, na środkowej krawędzi lewej strony zwoju. Chociaż bardziej ekonomiczne jest użycie neuronów ruchowych LFS, duży rozmiar neuronu ruchowego L7 jest korzystny dla niektórych eksperymentów. Neuron ruchowy L11, również na grzbietowej lewej powierzchni zwoju brzusznego, ogonowy do L7, jest neuronem ruchowym niedocelowym i może być skutecznie stosowany jako kontrola, za pomocą której neuron czuciowy faskuluje się, ale nie tworzy synaps chemicznych.
<ol>
<li>Znieczulić zwierzęta w celu usunięcia zwojów. W przypadku neuronów ruchowych LFS należy postępować zgodnie z opisem dla neuronów czuciowych opłucnej. W przypadku neuronów ruchowych L7 wstrzyknąć 0,35 M MgCl2 do młodocianej Aplysia (1-4 g) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 21.</li>
<li>Wypreparuj zwoje brzuszne: Przypnij znieczulone zwierzę do naczynia preparacyjnego, jak opisano powyżej (przy użyciu igieł o rozmiarze 21 dla młodych zwierząt). Za pomocą cienkich kleszczy i cienkich nożyczek wytnij zwoje brzucha. </li>
<li>Trawienie proteazy zwojów: Odbywa się to zgodnie z opisem dla neuronów czuciowych opłucnej, z wyjątkiem tego, że czas trawienia jest skrócony do 1 godziny 45 minut w przypadku zwojów u młodych (1-4 g) zwierząt. </li>
<li>Usuwanie osłony zwojów nerwowych: Przenieść zwoje trawione przez proteazę do naczynia o średnicy 35 lub 60 mm zawierającego sylgard i L15. Oglądanie pod mikroskopem stereoskopowym (z zewnętrznym oświetleniem halogenowym), w zwojach mózgowych w szalce Sylgarda we właściwej orientacji za pomocą szpilek na owady i cienkich kleszczyków. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek chirurgicznych Vanna ostrożnie podnieś tkankę łączną i przetnij ją, aby odsłonić ciała komórek nerwowych. Aby wyizolować neurony ruchowe LFS, przypnij zwój tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry, a następnie za pomocą kleszczy pociągnij osłonkę tkanki łącznej do tyłu, aby odsłonić całą połowę zwoju zawierającego neurony ruchowe LFS (po prawej stronie), usuń pozostałe części zwoju, usuń tkankę łączną z naczynia i dodaj więcej L15. Aby wyizolować neuron ruchowy L7 lub L11, przypnij zwój tak, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana do góry, i za pomocą kleszczy pociągnij osłonkę tkanki łącznej do tyłu, aby odsłonić połowę zwoju zawierającego zarówno L7, jak i L11 (po lewej stronie). Uważaj, aby nigdy nie dotknąć ani nie uszkodzić somatów neuronalnych. Umieść szpilkę, aby zrobić "słupek" w niewielkiej odległości od ganglionu (w polu view).</li>
<li>Izolacja neuronów: Usuń neurony za pomocą ostrej elektrody, jak opisano dla neuronów czuciowych. Neurony LFS różnią się od sąsiednich neuronów czuciowych LE na podstawie małej ciemnej plamki pigmentowej w ich somaty. Neuron L7 można odróżnić od neuronu L11 po pierwsze, ponieważ L11 jest ogonowy do L7, ponieważ ciało komórki L11 ma bardziej podłużny kształt, podczas gdy ciało komórki L7 jest bardziej okrągłe i ponieważ akson L11 ma tendencję do rozgałęziania się na dwie części blisko ciała komórki. </li>
<li>Powlekanie neuronów: Użyj pipetmana (P10), aby przenieść pojedyncze neurony z szalki Sylgarda do naczynia hodowlanego, jak opisano dla neuronów czuciowych.</li>
<li>Parowanie z neuronami czuciowymi: Pozwól neuronom ruchowym przylegać do naczynia hodowlanego przez co najmniej 1 godzinę. Następnie dodaj izolowane neurony czuciowe za pomocą pipetmana, dostarczając każdy neuron czuciowy sąsiadujący z platerowanym neuronem ruchowym. Za pomocą ostrej szklanej elektrody ostrożnie wyprostuj akson neuronu czuciowego i ustaw ciało komórki czuciowej w pozycji obok neuronu ruchowego, w odległości równej lub nieco mniejszej niż długość aksonu komórki czuciowej. Za pomocą szklanej elektrody nakłoń akson czuciowy do kontaktu z neuronem ruchowym, bardzo delikatnie używając boku stożkowej elektrody, aby w końcu akson czuciowy fizycznie zetknął się z aksonem neuronu ruchowego. Nie podnoś naczynia hodowlanego, ale raczej delikatnie przesuwaj naczynie po stoliku mikroskopu.</li>
<li>Pozostaw naczynia na stoliku mikroskopowym w temperaturze pokojowej na nie mniej niż 3 godziny i przenieś do inkubatora o temperaturze 18°C, jak opisano dla neuronów czuciowych.</li>
<li>Kultury powinny przylegać do naczynia w ciągu około 3 godzin, a nowy wzrost neurytów powinien być widoczny w ciągu około 6-12 godzin. Neurony czuciowe bardzo szybko tworzą synapsy glutaminergiczne z neuronami ruchowymi - gdy tylko komórka jest wystarczająco przylegająca, aby wykonać ostry zapis elektrody (3-5 godzin), można zarejestrować pobudzający potencjał postsynaptyczny. Łączność synaptyczna wzrasta do DIV 3, a następnie jest stabilna do DIV7. Neurony powinny wykazywać skomplikowany rozrost neurytów w ciągu pierwszych jednego do trzech dni w hodowli.</li>
</ol>
C. Przygotowanie Hemolimfy
Hemolimfa jest używana jako czynnik wzrostu w hodowli Aplysia (analogicznie do użycia surowicy płodowej cielęcej w hodowli komórek ssaków). Zbiera się go z dużych (500 g-1 kg) zwierząt, a najlepszą porą na zbieranie hemolimfy (anegdotycznie) jest wiosna (od połowy marca do czerwca). Owiń zwierzę w jednorazową podkładkę, tak aby odsłonięta była tylko niewielka część zwierzęcia, oczyść tę część skóry etanolem, a następnie trzymaj ją, podczas gdy inna osoba używa sterylnej żyletki, aby wykonać nacięcie w odsłoniętym obszarze. Ściśnij zwierzę tak, aby hemolimfa wstrzyknęła do czystej zlewki, upewniając się, że nie dotyka brudnej skóry zwierzęcia. Hemolimfa wypełnia hemocoel zwierzęcia (tj. zwierzę jest w zasadzie woreczkiem hemolimfy). Owiń zwierzę raz lub dwa razy, wykonaj nowe nacięcie i mocno ściśnij, aby zebrać jak najwięcej hemolimfy (zbierz w nowej zlewce, aby w przypadku zanieczyszczenia pierwsza kolekcja nadal nadawała się do użytku). Hemolimfa od każdego zwierzęcia powinna być przechowywana oddzielnie (tj. nie należy łączyć hemolimfy z różnych zwierząt). Wiruj hemolimfę o masie 2000 x g przez 10 minut, aby usunąć krwinki. Porcję supernatantu rozdzielić na 10 ml podwielokrotności, oznaczyć według zwierzęcia i przechowywać w temperaturze -80°C. Należy zauważyć, że hemolimfa przechowywana w temperaturze -20°C tworzy osad w pożywce. Za każdym razem, gdy przygotowywana jest pożywka, należy użyć nowej podwielokrotności hemolimfy, a podwielokrotność należy rozmrozić tuż przed przygotowaniem pożywki. Nie zamrażać ponownie po rozmrożeniu.

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialogue+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+vitro%3A+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldberg%2C+DJ+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , 2nd ed, The MIT press. Cambridge. 213-236 (1998).</li>
<li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li>
<li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific%2C+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses%3A+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li>
<li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li>
</ol>

Pomyślne przygotowanie kultur czuciowo-motorycznych Aplysia ma nieco powolną krzywą uczenia się, ponieważ obejmuje rozwój umiejętności motorycznych związanych z mikrodysekcją i manipulacją pojedynczymi neuronami oglądanymi przez stereomikroskop. Z naszego doświadczenia wynika, że potrzeba około 1-3 tygodni praktyki, aby uzyskać zdrowe, izolowane neurony czuciowe w hodowli i dodatkowe 1-3 tygodnie, aby nauczyć się łączyć neurony czuciowe z neuronami ruchowymi. Rutynowo przygotowujemy kultury w Labconco Clean Benc...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Roztwory potrzebne do hodowli <ol> <li>0.35 M MgCl2, przechowywane w temperaturze pokojowej, używane do znieczulenia.</li> <li>Roztwór poli-L-lizyny, Sigma: P-1524, MW > 300 000, wykonane w 0,1 M roztworze boranu sodu o pH 8,2 do 0,5 mg / ml. Dobrze zawirować i przefiltrować sterylizować przez 0,22 &#x03BC; m filtr, przechowuj go w temperaturze 4C&#x00B0;. Nie zamrażać-rozmrażać.</li> <li>L-15 Średni proszek (Leibovitz) (Sigma: L4386) uzupełniony solami jak poniżej, aby uzyskać 1 litr <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"> <tbody><tr> <td>L-15 proszek</td> <td>13.8g</td> </tr> <tr> <td>NaCl</ td> <td>15,4 g </td> </tr> <tr> <td>D-Glukoza </td> <td>6,24 g </td> </tr> <tr> <td>MgSO4&#8226; 7H20 </td> <td>6.45g </td> </tr> <tr> <td>KCl </td> <td>350 mg </td> </tr> <tr> <td>NaHCO3</td> <td>170 mg </td> </tr> <tr> < td>MgCl2&#8226; 6H2O </td> <td>5.49 g </td> </tr> <tr> <td>CaCl2&#8226; 2H2O </td> <td>1.43g </td> </tr> <tr> <td>HEPES</td> <td>3.53g</td> </tr></tbody></table> Dodaj ddH20 do 1 litra. pH powinno wynosić około 7,4-7,5, dodać 10 ml 100X roztworu Pen/Strep i wysterylizować przez 0,22 &#x03BC; m filtr. Przechowywać w temperaturze 4C0 nie dłużej niż 1 miesiąc.</li><li>Roztwór do trawienia proteazy: 1% Proteaza IX (1 jednostka/mg) jest wytwarzana w L15 (uzupełniona solami jak wyżej) lub w ASW bezpośrednio przed użyciem, sterylizowana przez filtr 0,22 &#x03BC; m Milipore. 5 ml powinno wystarczyć na zwoje od dwóch zwierząt (upewnij się, że zwoje są całkowicie zanurzone w roztworze proteazy). Sigma poinformowała, że zaprzestanie sprzedaży Protease IX. Proteazą zastępczą jest: Dispase II (katalog Roche Applied Science # 04942078001).</li><li>Pożywka hodowlana. Bezpośrednio przed przygotowaniem kultur rozmrozić 10 ml podwielokrotności hemolimfy i wymieszać ją z 10 ml L15 (uzupełnionymi solami jak powyżej), aby uzyskać 20 ml pożywki hodowlanej. Dodaj 200 #x03BC; l 200mM L-Glutamina, dobrze wymieszaj i użyj do przygotowania kultur. Pożywka ta powinna być przygotowywana na świeżo za każdym razem, gdy wytwarzane są kultury.</li><li>Sztuczna woda morska może być wytwarzana z Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) lub w następujący sposób: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, o pH dostosowanym do 7,4.</li></ol></td></tr></tbody></table>

przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych aplysia

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Układ nerwowy morskiego Aplysia californica jest stosunkowo prosty, składa się z około 20 000 neuronów. Neurony są duże (do 1 mm średnicy) i możliwe do zidentyfikowania, o różnych rozmiarach, kształtach, pozycjach i pigmentacjach, a ciała komórek są zewnętrznie odsłonięte w pięciu sparowanych zwojach rozmieszczonych w całym ciele zwierzęcia. Właściwości te pozwoliły badaczom nakreślić obwody leżące u podstaw określonych zachowań u zwierzęcia1. Monosynaptyczne połączenie między neuronami czuciowymi i ruchowymi jest centralnym elementem odruchu wycofania skrzeli u zwierzęcia, prostego odruchu obronnego, w którym zwierzę wycofuje skrzela w odpowiedzi na stymulację dotykową syfonu. Odruch ten podlega formom uczenia się nieasocjacyjnego i asocjacyjnego, w tym uwrażliwianiu, habituacji i warunkowaniu klasycznemu. Szczególnie korzystne dla badań plastyczności synaptycznej jest to, że synapsa czuciowo-ruchowa może zostać odtworzona w hodowli, gdzie dobrze scharakteryzowane bodźce wywołują formy plastyczności, które mają bezpośrednie korelaty w zachowaniu zwierzęcia2,3. W szczególności stosowanie serotoniny powoduje wzmocnienie synaptyczne, które, w zależności od protokołu aplikacji, trwa przez minuty (ułatwienie krótkoterminowe), godziny (ułatwienie średnioterminowe) lub dni (ułatwienie długoterminowe). Natomiast zastosowanie przekaźnika peptydowego FMRFamidu powoduje osłabienie synaptyczne lub depresję, które, w zależności od protokołu aplikacji, może trwać od kilku minut do kilku dni (depresja długotrwała). Duży rozmiar neuronów pozwala na wielokrotne rejestrowanie siły synaptycznej za pomocą elektrod w ciągu kilku dni wraz z mikrowstrzykiwaniem wektorów ekspresyjnych, siRNA i innych związków w celu ukierunkowania na określone kaskady sygnałowe i cząsteczki, a tym samym zidentyfikowanie etapów molekularnych i biologicznych komórek, które leżą u podstaw zmian w skuteczności synaptycznej.
Dodatkową zaletą systemu hodowli Aplysia jest fakt, że neurony wykazują specyficzność synapsową w hodowli4,5. W związku z tym neurony czuciowe nie tworzą synaps ze sobą (autapses) ani z innymi neuronami czuciowymi, ani nie tworzą synaps z neuronami ruchowymi niezidentyfikowanymi w hodowli. Żylaki, miejsca kontaktu synaptycznego między neuronami czuciowymi i ruchowymi, są wystarczająco duże (2-7 mikronów średnicy), aby umożliwić tworzenie synaps (a także zmiany w morfologii synaptycznej) z docelowymi neuronami ruchowymi na poziomie mikroskopu świetlnego.
W tym filmie pokazujemy każdy etap przygotowania kultur neuronów czuciowo-ruchowych, w tym znieczulenie dorosłych i młodocianych Aplyzji, preparowanie ich zwojów, trawienie proteazy zwojów, usuwanie tkanki łącznej przez mikrodysekcję, identyfikację zarówno neuronów czuciowych, jak i ruchowych oraz usuwanie każdego typu komórek za pomocą mikrodysekcji, powlekanie neuronu ruchowego, dodawanie neuronu czuciowego i manipulowanie neurytem czuciowym w celu nawiązania kontaktu z hodowanym neuronem ruchowym.

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro. Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Pierwotne kultury czuciowych neuronów ruchowych AIA stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaptycznej in vitro. Film ten demonstruje identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych ze zwojów OIA, a także metody tworzenia i utrzymywania czuciowych neuronów ruchowych w hodowli. Cześć, jestem Aliza i pracuję w Laboratorium Kelsey Martin na Wydziale Psychiatrii i Wydziale Chemii Biologicznej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.Cześć, jestem Wan również z laboratorium marketingowego. Dzisiaj pokażę Wam procedurę kartingu i czuciowych neuronów ruchowych od Clac Apia Konica. W naszym laboratorium wykorzystujemy tę procedurę do badania komórki i biologii molekularnej powstawania synaps i plastyczności synaptycznej.Więc zacznijmy. Aby rozpocząć hodowlę neuronów pleio, najpierw przygotuj naczynia hodowlane, pokrywając szklaną studzienkę naczynia hodowlanego z matowego szkła technologicznego poli L lizyną wykonaną w otworze sodowym. Dodaj tyle, aby całkowicie przykryć szklankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.Po inkubacji dokładnie usuń poli L-lizynę, spłukując ją w sztucznej wodzie morskiej cztery do pięciu razy.

preparation-of-aplysia-sensory-motor-neuronal-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie kultur komórek czuciowo-ruchowców Aplysia

Neurony *Aplysia californica* w hodowli tworzą duże stożki wzrostu, które doskonale nadają się do obrazowania wysokiej rozdzielczości w badaniu motywności i prowadzenia stożków wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół sekcji i wysiewu neuronów komórek torby *Aplysia* oraz przygotowania komory do obrazowania żywych komórek.

Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

W tym filmie demonstrujemy wizualizację translokacji PKC w żywych komórkach z wykorzystaniem PKC znakowanych fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Opisujemy technikę pozwalającą na rejestrację i stymulację pozakomórkową nerwów, mięśni oraz pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów in vitro przy jednoczesnym wywoływaniu i obserwowaniu różnych rodzajów zachowań żerowania w aparacie gębowym Aplysia.

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Ten film demonstruje procedury używane do hodowli pierwotnych kultur embrionalnych komórek nerwowych i mięśniowych Xenopus oraz przydatność tego preparatu do jednoczesnego wykonywania nagrań pre- i post-synaptycznych klamerów.

Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metodę mikrodisekcji i hodowli czuciowo-ruchowych neuronów z gangliów Aplysia. Technika ta umożliwia badanie tworzenia synaps i plastyczności synaptycznej w kontrolowanych warunkach in vitro.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

Przeglądaj więcej filmów