Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster
September 15th, 2009
Ten protokół opisuje użycie mikroiniekcji i obrazowania w wysokiej rozdzielczości w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster do badania mitozy.
Procedura ta rozpoczyna się od pobrania zarodków na talerzach ze świeżym sokiem winogronowym od 30 do 60 minut. Po wyjęciu płytki z klatki nad jeziorem należy zebrać zarodki zwilżoną szczoteczką i umieścić je na podwójnej taśmie klejącej. Delikatnie przetocz jeden zarodek po taśmie za pomocą połowy pęsety, aż korion pęknie.
Podnieś zarodek i delikatnie umieść go na pokrywie. Nałóż warstwę kleju het. Powtarzaj to, aż będziesz mieć wystarczającą liczbę zarodków.
Po odwodnieniu zarodki są gotowe do wstrzyknięcia. Cześć, nazywam się Ingrid Bruce Musher i pracuję w laboratorium dr Jonathana Sculleya na Wydziale Biologii Molekularnej i Komórkowej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę mikroiniekcji zarodków syncytialnych Drosophilas.
Używamy tej procedury do badania roli mikro ttes i silników mitralnych w mitozie. Na przykład mikroiniekujemy przeciwciała lub inne inhibitory określonych białek mitotycznych. Analizując wpływ inhibitora na mitozę, jesteśmy w stanie określić funkcję białek docelowych.
Więc zacznijmy. Aby rozpocząć przygotowania na dwa do trzech dni przed eksperymentem, ustaw klatkę dla niosek, wycinając dwa małe otwory o powierzchni około jednego centymetra kwadratowego po przeciwnych stronach plastikowej butelki. Wypełnij otwory bawełnianym kawałkiem, umożliwiając przepływ powietrza.
Wbij muchy do butelki, a następnie przykryj ją talerzem z sokiem winogronowym. W przypadku drożdży należy trzymać klatkę na nogi w temperaturze pokojowej, muchy będą składać jaja przez okres do 10 dni co najmniej jeden dzień przed eksperymentem. Wyciągnąć igły do wstrzykiwań i utrzymywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
W dniu eksperymentu przygotuj i załaduj igły. Najpierw wyjmij oznakowaną tubulinę z zamrażarki i połóż ją na lodzie na pięć do 15 minut. Następnie rozcieńczyć go buforem GPEM, a następnie odwirować przez 10 do 15 minut przy 13 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza.
Na koniec załaduj jeden do dwóch mikrolitrów do igły i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zapobiec polimeryzacji igły wywołanej temperaturą. Przed założeniem szkiełka nakrywkowego wykonaj klej heptanowy, zapisując podwójną taśmę klejącą i umieszczając ją w butelce o pojemności 100 mililitrów.
Dodaj około 50 mililitrów heptanu, zamknij butelkę i kołysz nią przez kilka dni. Przed przygotowaniem zarodków należy wykonać komorę odwadniającą, w której zarodki zostaną umieszczone przed wstrzyknięciem. Aby to zrobić, umieść jedną część 35-milimetrowej płytki Petriego w 100-milimetrowej szalce Petriego, aby stół dodał suszarkę, po prawej, która jest bezwodnym siarczanem wapnia wokół niej, tak aby wysokość suszarki po prawej stronie nie była wyższa niż stół i przykrycie.
Aby rozpocząć przygotowanie zarodków, najpierw zbierz je z klatki nad jeziorem, zmieniając talerz z sokiem winogronowym z drożdżami co godzinę, zarodki należy zobrazować około dwie godziny po rozpoczęciu pobierania. Aby przygotować szkiełko nakrywkowe, umieść je po jednej stronie mikroskopu, przesuń i przyklej taśmą cztery rogi w dół, aby się nie poruszało. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż jedną warstwę kleju heptanowego w linii na szkiełko nakrywkowe.
Klej nie powinien być lepki i powinien wyschnąć w ciągu kilku sekund. Jeśli jest zbyt gęsty, dodaj więcej heptanu. Na koniec połóż kawałek podwójnej taśmy klejącej na szkiełku obok okładki.
Poślizgnij się zwilżoną szczotką. Ostrożnie podnieś zarodki z talerza z sokiem winogronowym i umieść je na podwójnej taśmie klejącej na szkiełku. Następnie użyj połowy pęsety, aby przetoczyć zarodki po podwójnej taśmie klejącej, aż korion się otworzy.
Podnieś zarodek, delikatnie przetaczając go po Corianie, tak aby przykleił się do pęsety i umieść go na kleju heptanowym na okładce. Szkiełko wykonać w taki sposób, aby dłuższy bok zarodka był równoległy do dłuższego boku szkiełka nakrywkowego. Umieść od 10 do 20 zarodków w jednym rzędzie.
Usuń szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze suszenia na trzy do ośmiu minut. Czas zależy od lokalnej wilgotności i ilości do wstrzyknięcia. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na metalowej komorze ze smarem próżniowym.
Na koniec przykryj zarodki olejem węglowym halo, aby uniknąć dalszego odwodnienia. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia. Najpierw znajdź zarodki pod obiektywem 16x.
Odsuń zarodki i znajdź igłę bez przesuwania płaszczyzny ogniskowej. Wyśrodkuj igłę i przesuń ją w górę, nie przesuwając jej w kierunku X lub Y. Aby otworzyć igłę, należy umieścić krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view, ale nie w miejscu, w którym będzie znajdować się igła.
I opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż dotknie igły i delikatnie ją rozerwie. Przesunąć igłę w górę.
Teraz spójrz na zarodki. Opuść igłę do oleju i upewnij się, że z igły wypływają ładne krople płynu. Równomiernie przesuwaj zarodek do igły, wstrzyknij kroplę do zarodka, a następnie odsuń zarodek.
Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym z obiektywem 60 lub 100 x. Zarodek kontrolny powinien wyglądać jak ten z tego filmu. Jest to zarodek wykazujący ekspresję tubuliny GFP i histonu RFP zobrazowany za pomocą obiektywu 100 x na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem.
Całkowity pokazany czas to osiem minut. Wykresy odległości od bieguna do bieguna są bardzo powtarzalne i są wiarygodną miarą sukcesu w zarodkach kontrolnych. Powinny wyglądać jak te pokazane tutaj dla cykli od 11 do 13.
W tym filmie pokazany jest kolejny zarodek kontrolny. Ten wyrażający KLP 61 FGFP i wstrzyknięty z tubuliną r Domine. Zostało to również sfotografowane za pomocą obiektywu 100x na konfokalu z obracającym się dyskiem, a całkowity czas wynosi siedem minut.
Ten film został uzyskany natychmiast po mikroiniekcji, a gradient stężenia tubuliny r Domine jest wyraźnie widoczny na początku filmu. Zarodki te można wykorzystać do badania inhibicji Klp 61 F po mikrowstrzyknięciu przeciwciała Klp 61 F. Widzimy ubytek Klp 61 FGFP z wrzecion.
Właśnie pokazaliśmy, jak mikrowstrzykiwać zarodki nacinające drosophilas. Wykonując tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o wykonywaniu kontroli, najpierw przećwiczeniu wstrzykiwania samego buforu lub rutyny i upewnieniu się, że mitoza przebiega normalnie przez komórkę. Gdy wszystkie twoje zastrzyki są niezawodne i nie powodują uszkodzeń, można wstrzyknąć inhibitor i zbadać efekt tego konkretnego hamowania.
Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania wysokiej rozdzielczości w zarodku drożdży owocowej Drosophila melanogaster w celu badania mitozy. Procedura polega na ostrożnym obchodzeniu się z zarodkami, aby zapewnić pomyślne obrazowanie i analizę.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Tło
- Drosophila melanogaster jest organizmem modelowym szeroko stosowanym w badaniach biologicznych.
- Zrozumienie mitozy jest kluczowe dla poznania podziału komórek i rozwoju.
- Techniki obrazowania wysokiej rozdzielczości poprawiają obserwację procesów komórkowych.
- Mikroiniekcja pozwala na precyzyjne manipulowanie zarodkami do celów eksperymentalnych.
Cel badania
- Zbadanie dynamiki mitozy w zarodkach Drosophila.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania do szczegółowej obserwacji komórkowej.
- Ustanowienie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań w dziedzinie biologii rozwoju.
Zastosowane metody
- Zbieranie zarodków na płytkach z soku winogronowego.
- Mikroiniekcja zarodków w celu manipulacji eksperymentalnej.
- Obrazowanie wysokiej rozdzielczości do obserwacji procesów mitotycznych.
- Ostrożne obchodzenie się z zarodkami, aby zapobiec uszkodzeniom podczas przygotowania.
Główne wyniki
- Udane wizualizowanie etapów mitozy w zarodkach Drosophila.
- Wykazanie skuteczności technik mikroiniekcji.
- Dostarczenie informacji na temat czasowania i regulacji podziału komórek.
- Ustanowienie ram dla przyszłych badań nad rozwojem zarodków.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w badaniu mitozy w zarodkach Drosophila.
- Obrazowanie wysokiej rozdzielczości jest niezbędne do zrozumienia dynamiki komórkowej.
- To badanie przyczynia się do szerszej dziedziny biologii rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional interrogation of mitotic proteins in a rapid, synchronous in vivo system, supporting target validation through phenotypic readouts of protein inhibition. The syncytial Drosophila embryo provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of mitotic targets, allowing assessment of protein function prior to lead identification. Quantitative imaging of spindle dynamics offers predictive confidence in target essentiality and pathway involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by visualizing loss-of-function phenotypes via protein-specific antibody microinjection.
- Operational Value: Supports biological de-risking through gradient-dependent phenotypic series resembling allelic mutants.
- Predictive Value: Facilitates target confidence assessment by correlating inhibition strength with mitotic defect severity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible mitotic readouts (pole-to-pole distance) for compound or inhibitor screening.
- Quantitative Output: Provides measurable, imaging-based endpoints enabling dose-response analysis of protein inhibition.
- Scalability: Allows parallel embryo preparation and imaging for medium-throughput functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic machinery conservation supports translational biomarker alignment with human cell division pathways.
- Preclinical Continuity: Enables mechanistic follow-up from genetic hits to functional validation in a living system.
- Risk-Adjusted Decisions: Helps prioritize targets based on phenotypic penetrance and specificity of inhibition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate mitotic targets before assay development and lead identification stages, leveraging in vivo functionality.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via direct perturbation of mitotic proteins.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable mitotic imaging readouts.
- Analytics: Delivers objective, imaging-based measurements (e.g., spindle length) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved mitotic mechanisms and protein function conservation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple mitotic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function through direct, reversible protein inhibition in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized embryo preparation and injection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization using phenotypic severity gradients.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and live confocal imaging.
- Dependent on microinjection apparatus, antifade oils, and high-resolution imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging and injection consistency.
- Adaptation considerations include protein solubility, antibody functionality, and fluorescent tag compatibility.
- Practical limitations include embryo viability post-injection and potential diffusion barriers in larger embryos.
