Name: Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj techniki mikroiniekcji do badania mitozy w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę podziału komórkowego i dynamiki wrzeciona mitotycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy protokół jest obecnie stosowany w naszym laboratorium i był na przestrzeni lat udoskonalany przez wiele osób, w tym dr. Davida Sharpa, dr Mijung Kwon, dr Patrizię Sommi oraz dr Dhanyę Cheerambathur. Dziękujemy dr. Billowi Sullivanowi (UCSC), który udzielił nam cennych wskazówek dotyczących manipulacji i mikroiniekcji wczesnych embrionów Drosophila w fazie inicjowania naszych prac w tym systemie (ref. 13). Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Scholeya. Nasze prace nad mitozą u Drosophila są finansowane z grantu NIH GM55507.

Przepisy:
Szalki z sokiem winogronowym:
<ul>
<li>5.5g agaru bakteryjnego</li>
<li>14.5 g dekstrozy lub glukozy</li>
<li>7.15 g sacharozy</li>
<li>45 ml koncentratu soku winogronowego (100% soku)</li>
<li>204.5 ml H2O</li>
<li>625 μl 10N NaOH</li>
</ul>
Wymieszać wszystkie składniki i podgrzewać w kuchence mikrofalowej do wrzenia. Dodać 2.8 ml mieszaniny kwasów (mieszanina kwasów: 20.9 ml kwasu propionowego, 2.1 ml kwasu fosforowego, 27 ml H20)
Wymieszać i przelać do szalek Petriego o średnicy 35 mm. Pozostawić do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez jeden lub dwa dni. Jeśli szalki nie będą użyte w najbliższym czasie, zabezpieczyć je parafilmem i przechowywać w temperaturze 4°C (przed użyciem doprowadzić do wyrównania temperatury z temperaturą pokojową).
Pasta drożdżowa:
Rozpuścić około jednej łyżeczki drożdży (Sigma YSC2, drożdże z Saccharomyces cerevisiae typu II) w wodzie, aby uzyskać gęstą pastę. Bezpośrednio przed użyciem nanieść niewielką ilość pasty na każdą płytkę z sokiem winogronowym.
Bufor G-PEM:
<ul>
<li>80 mM Na-PIPES, pH 6.9</li>
<li>1 mM MgCl2</li>
<li>1 mM EGTA</li>
<li>1 mM GTP</li>
</ul>
Bufor do wstrzykiwania:
<ul>
<li>150 mM aspartynianu potasu</li>
<li>10 mM fosforanu potasu</li>
<li>20 mM imidazolu, pH 7.2</li>
</ul>
Klej heptanowy:
Rozwiń dwustronną taśmę klejącą i umieść ją w butelce o pojemności 100ml, dodaj około 50ml heptanu, szczelnie zamknij butelkę i pozostaw do mieszania przez kilka dni, delikatnie nią potrząsając. Podczas używania dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty.
Komora odwodniająca:
Należy wziąć szalkę Petriego o średnicy 100 mm, umieścić wewnątrz jedną część szalki o średnicy 35 mm, aby stworzyć „podest”, a wokół niej wsypać Drierite (bezwodny siarczan wapnia) tak, aby wysokość Drierite nie przekraczała poziomu „podestu”, a następnie przykryć całość. Przed wstrzykiwaniem szkiełko nakrywkowe z embrionami zostanie umieszczone na tym „podestcie” w celu odwodnienia. Zaleca się stosowanie przynajmniej częściowo wskaźnikowego Drierite i jego wymianę po zmianie koloru.
Protokół:
Niniejszy protokół można zastosować do wstrzykiwania niemal każdego rozpuszczalnego odczynnika do syncytialnego zarodka Drosophila: na przykład białka fluorescencyjnego do obserwacji, inhibitora białka docelowego lub obu tych substancji jednocześnie.
Przygotowanie wszystkich niezbędnych elementów:
1.- Od 2 do 3 dni przed eksperymentem przygotuj płytki z sokiem z winogron i ustaw klatkę do składania jaj: weź plastikową butelkę (6 oz, z okrągłym dnem od Applied Scientific Drosophila), wytnij dwa małe otwory (około 1cm2) po przeciwnych stronach butelki i wypełnij je kawałkiem waty (umożliwi to przepływ powietrza), przelej muchy do butelki i przykryj ją płytką z sokiem z winogron. Przechowuj w 25°C (lub w temperaturze pokojowej); muchy powinny składać embriony przez około 10 dni.
2.- Przynajmniej jeden dzień przed eksperymentem przygotować igły do iniekcji; używamy do tego wyciągacza igieł/pipet Kopf model 720 oraz cienkościennych szklanych włókien (World Precision Instruments tw100f). W przypadku iniekcji fluorescencyjnej tubuliny, igły należy przechowywać w temperaturze 4°C, aby zapobiec polimeryzacji wywołanej temperaturą wewnątrz igły.
Przygotowanie tubuliny:
Uwaga: Wszystkie prace z tubuliną należy prowadzić w temperaturze 4°C, aby zapobiec polimeryzacji.
<ol>
<li>Wyjąć znakowaną tubulinę z zamrażarki i pozostawić ją na lodzie od 5 do 15 minut.</li>
<li>Rozcieńczyć buforem G-PEM (od 4 do 10 razy, w zależności od wymaganej intensywności).</li>
<li>Wirować z prędkością 13k rpm w temperaturze 4°C przez 10-15 minut.</li>
<li>Nabrać 1 - 2 μl do igły.</li>
</ol>
Przeciwciało lub inhibitor chemiczny:
Przygotować igły w taki sam sposób jak dla tubuliny, stosując odpowiednie stężenie (może to wymagać wcześniejszego przetestowania). Przeciwciało może znajdować się w buforze do wstrzykiwania, buforze G-PEM lub PBS. Jeśli wymagany jest inny bufor, należy go wstrzyknąć jako kontrolę, aby upewnić się, że sam bufor nie powoduje uszkodzeń.
Uwaga: Inhibitor i fluorescencyjna tubulina mogą zostać zmieszane i wstrzyknięte razem, jeśli na to pozwalają stężenia. W przeciwnym razie należy wstrzyknąć fluorescencyjną tubulinę i odczekać od 5 do 10 minut przed wstrzyknięciem inhibitora. Podczas wykonywania podwójnej iniekcji należy rozpocząć od większej liczby embrionów, ponieważ mniejsza ich liczba powróci do normalnego stanu.
Zbiór zarodków:
<ol>
<li>Umieść nową płytkę z sokiem z winogron na klatce do składania jaj.</li>
<li>Zdejmij tę płytkę po godzinie; jest to pierwsza w ciągu dnia kolekcja i często nie jest ona najwyższej jakości. Można ją odrzucić.</li>
<li>Wymieniaj płytkę co godzinę, aby kontynuować zbieranie embrionów w interwałach godzinnych.</li>
</ol>
Przygotowanie szkiełek nakrywkowych:
<ol>
<li>Umieść szkiełko zakrywające o wymiarach 50 x 22mm po jednej stronie przedmiotu szkiełka. Przyklej cztery narożniki do przedmiotu szkiełka taśmą, aby zapobiec jego przesuwaniu się.</li>
<li>Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nanieś jedną warstwę kleju heptanowego w jednej linii na szkiełko zakrywające (klej nie powinien być lepki i powinien wyschnąć w ciągu kilku sekund; w przeciwnym razie dodaj więcej heptanu).</li>
<li>Przyklej kawałek dwustronnej taśmy klejącej na przedmiocie szkiełka w kierunku szkiełka zakrywającego.</li>
</ol>
Przygotowanie embrionów:
Uwaga: Obrazowanie zarodków należy przeprowadzić około 2 godziny po rozpoczęciu ich zbierania, dlatego należy rozpocząć poniższe kroki z odpowiednim wyprzedzeniem, aby ukończyć je w tym przedziale czasowym.
<ol>
<li>Za pomocą zwilżonego pędzelka ostrożnie pobierz embriony z płytki z sokiem z winogron i umieść je na dwustronnej taśmie klejącej na szkiełku przedmiotowym.</li>
<li>Używając zewnętrznej części pęsety, przetaczaj embriony po dwustronnej taśmie klejącej, aż chorion (błona zewnętrzna) pęknie.</li>
<li>Pobierz embrion, delikatnie przetaczając go po chorionie, aby przykleił się do pęsety, a następnie umieść go na kleju z heptanu na szkiełku nakrywkowym, tak aby długa oś embrionu była równoległa do długiej krawędzi szkiełka. Ustaw od 10 do 20 embrionów w jednym rzędzie.</li>
<li>Zdejmij szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze odwadniającej na 3 do 8 minut (czas ten zależy od wilgotności w pomieszczeniu oraz liczby embrionów przeznaczonych do iniekcji).</li>
<li>Umieść próbkę w metalowej komorze z smarem próżniowym.</li>
<li>Przykryj embriony olejem halokarbonowym 700, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu. Embriony są teraz gotowe do iniekcji.</li>
</ol>
Wstrzykiwanie do zarodków:
<ol>
<li>Zlokalizuj zarodki przy użyciu obiektywu 16x.</li>
<li>Przesuń zarodki w bok i znajdź igłę, nie zmieniając płaszczyzny ogniskowania.</li>
<li>Wycentruj igłę i przesuń ją w górę, nie zmieniając jej położenia w osi x lub y.</li>
<li>Jeśli igła jest zamknięta, wprowadź krawędź szkiełka nakrywki w pole widzenia (poza miejsce, w którym znajdzie się igła) i opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowania. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywki, aż uderzy ono w igłę i delikatnie ją otworzy. Jeśli igła jest otwarta, przejdź do kroku 5. (Igły można otworzyć kwasem fluorowodorowym przed napełnieniem).</li>
<li>Wprowadź zarodki w pole widzenia (poza miejsce, w którym znajdzie się igła), opuść igłę do oleju i upewnij się, że z igły wydobywają się wyraźne krople cieczy.</li>
<li>Ostrożnie, ale pewnie przesuń zarodek do igły, wstrzyknij kroplę do zarodka, a następnie odsuń zarodek.</li>
<li>Po wstrzyknięciu cieczy do wszystkich zarodków są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
Obrazowanie:
Wykonaj obrazowanie embrionów za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 60 lub 100X: Uwagi:
<ol>
<li>Interwał czasowy w serii time-lapse powinien wynosić maksymalnie kilka sekund, ponieważ mitoza w zarodku przebiega bardzo szybko, w zależności od dokładnego procesu będącego przedmiotem badań.</li>
<li>W zależności od interesującego procesu można pozyskać serię 3D lub pojedynczą płaszczyznę obrazowania.</li>
<li>W przypadku szybko działających inhibitorów przeniesienie z mikroskopu do iniekcji do mikroskopu obrazującego musi odbyć się szybko.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="Proces podziału komórki; schemat wrzeciona i mikroskopia; wykres długości wrzeciona w funkcji czasu; obrazy mikroskopowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1: Badanie mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila. Jądra we wczesnym embrionie ulegają szybkim podziałom bez cytokinezy; podczas cykli od 10 do 13 jądra tworzą monowarstwę w korze. A. Schemat wczesnego embrionu z jądrami w korze. Embrion może ekspresować białka znakowane GFP i/lub RFP oraz może zostać poddany mikroiniekcji innych znakowanych białek i/lub inhibitorów. B. Obrazowanie time-lapse embrionu ekspresującego GFP-tubulinę i RFP-histon. C. Wykres odległości między biegunami dla cykli 11, 12 i 13 w embrionie typu dzikiego. Długość wrzeciona wykazuje okresy stałej długości (izometryczne) oraz okresy wydłużania, które są bardzo spójne i powtarzalne. D. Dynamika mikrotubul wrzeciona. Iniekcja niskiego stężenia tubuliny z rodamyną prowadzi do powstania plamek składających się z kilku podjednostek tubuliny, które mogą być wykorzystane do badania dynamiki mikrotubul.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Niniejszy protokół jest stosunkowo prosty, jednak każdy krok wymaga praktyki, aby upewnić się, że zarodki nie zostaną uszkodzone. Zawsze należy przeprowadzać uważne eksperymenty kontrolne, aby zapewnić uzyskanie wiarygodnych wyników. Dobrym sposobem na rozpoczęcie jest mikroiniekcja buforu lub tubuliny z rodaminą do zarodków kontrolnych wykazujących ekspresję GFP-tubuliny, aby upewnić się, że mitoza przebiega prawidłowo we wszystkich cyklach na powierzchni zarodka (cykle od 10 do 13). W zarodkach kontrolnych nie powinno ...

techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym drosophila melanogaster

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie zarodka syncytialnego Drosophila melanogaster do badania mitozy1. Drosophila posiada użyteczne narzędzia genetyczne z zsekwencjonowanym genomem i może być łatwo utrzymywana oraz manipulowana. Istnieje wiele mutantów mitoticznych, a muszki transgeniczne wykazujące funkcjonalne białka mitoticzne znakowane fluorescencyjnie (np. GFP) zostały i są nadal tworzone. Celowana ekspresja genów jest możliwa dzięki zastosowaniu systemu GAL4/UAS2. 

Wczesny embrion Drosophila przechodzi wielokrotne mitozy w bardzo szybkim tempie (czas trwania cyklu komórkowego ≈10 min). Jest on odpowiednim modelem do obrazowania mitozy, ponieważ podczas cykli 10-13 jądra dzielą się szybko i synchronicznie, bez następującej po tym cytokinezy, na powierzchni embrionu w pojedynczej warstwie bezpośrednio pod korym. Te szybko dzielące się jądra prawdopodobnie wykorzystują ten sam mechanizm mitotyczny co inne komórki, jednak są one zoptymalizowane pod kątem szybkości; powszechnie uważa się, że punkt kontrolny nie jest rygorystyczny, co umożliwia badanie białek mitotycznych, których brak spowodowałby zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach z silnym punktem kontrolnym. Embriony wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP lub poddane mikroiniekcji białek znakowanych fluorescencyjnie można łatwo obrazować w celu śledzenia dynamiki żywych komórek (Ryc. 1). Ponadto do embrionów można mikroiniekować przeciwciała blokujące funkcję lub inhibitory specyficznych białek, aby zbadać efekt utraty lub zaburzenia ich funkcji3. Odczynniki te mogą dyfundować w całym embrionie, docierając do wielu wrzecion i tworząc gradient stężenia inhibitora, co z kolei skutkuje gradientem defektów porównywalnym do serii allelicznej mutantów. Idealnie, jeśli białko docelowe jest znakowane fluorescencyjnie, gradient inhibicji można zwizualizować bezpośrednio4. Zakłada się, że najsilniejszy fenotyp jest porównywalny z fenotypem null, choć trudno formalnie wykluczyć możliwość, że przeciwciała mogą w rzadkich przypadkach wywoływać efekty dominujące, dlatego należy stosować rygorystyczne kontrole i ostrożną interpretację. W większej odległości od miejsca iniekcji funkcja białka jest utracona tylko częściowo, co pozwala na ujawnienie innych funkcji białka docelowego.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie embrionu syncytialnego Drosophila melanogaster do badania mitozy1. Drosophila posiada użyteczną genetykę z zsekwencjonowanym...

Procedura rozpoczyna się od zbierania embrionów z płytek z świeżym sokiem z winogron po 30 do 60 minutach. Po wyjęciu płytki z klatki w jeziorze, należy zebrać embriony za pomocą zwilżonego pędzelka i umieścić je na dwustronnej taśmie klejącej. Delikatnie przetoczyć jeden embrion po taśmie, używając jednej strony pęsety, aż do momentu przerwania chorionu.Pobierz embrion i ostrożnie umieść go na szkiełku nakrywkowym. Nanieś warstwę kleju het. Powtarzaj tę czynność, aż uzyskasz odpowiednią liczbę embrionów.Po odwodnieniu embriony są gotowe do iniekcji. Dzień dobry, nazywam się Ingrid Bruce Musher i pracuję w laboratorium dr. Jonathana Sculleya w Katedrze Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę mikroiniekcji syncytialnych embrionów Drosophila.Niniejszą procedurę stosujemy do badania roli mikrotubul i motorów opartych na białkach mitralnych w mitozie. Przykładowo, mikroiniekujemy przeciwciała lub inne inhibitory specyficznych białek mitotycznych. Analizując wpływ inhibitora na mitozę, jesteśmy w stanie określić funkcję białek docelowych.Zacznijmy zatem. Aby przygotować klatkę lęgową na dwa lub trzy dni przed eksperymentem, należy wyciąć dwa małe otwory o powierzchni około 1 cm² po przeciwnych stronach plastikowej butelki. Wypełnij otwory kawałkiem waty, aby umożliwić przepływ powietrza.Wprowadzić muchy do butelki, a następnie przykryć ją płytką z sokiem winogronowym. W przypadku drożdży przechowywać klatkę z muchami w temperaturze pokojowej; muchy będą składać jaja przez okres do 10 dni, co należy rozpocząć co najmniej jeden dzień przed eksperymentem. Przygotować igły do iniekcji i przechowywać je w temperaturze 4 °C.W dniu eksperymentu należy przygotować i załadować igły. Najpierw wyjmij oznakowaną tubulinę z zamrażarki i umieść ją w lodzie na od 5 do 15 minut. Następnie rozcieńcz ją buforem GPEM, a potem wiruj przez 10 do 15 minut przy 13 000 RPM w temperaturze 4 °C.Na koniec nabić od jednego do dwóch mikrolitrów do igły i przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec polimeryzacji indukowanej temperaturą wewnątrz igły. Przed przygotowaniem szkiełka nakrywnego przygotować klej heptanowy, zwijając dwustronną taśmę klejącą i umieszczając ją w butelce o pojemności 100 ml.Dodaj około 50 mililitrów heptanu, szczelnie zamknij butelkę i przechowuj ją w ruchu obrotowym przez kilka dni. Przed przygotowaniem embrionów przygotuj komorę dehydratacyjną, w której embriony zostaną umieszczone przed iniekcją. Aby to zrobić, umieść jedną część szalki 35 milimetrów wewnątrz szalki Petriego 100 milimetrów, aby stworzyć platformę, a wokół niej dodaj środek osuszający, którym jest bezwodny siarczan wapnia, tak aby wysokość środka osuszającego nie przekraczała wysokości platformy i przykrycia.Aby rozpocząć przygotowywanie embrionów, należy najpierw zebrać je z klatki jeziornej, wymieniając co godzinę płytkę z sokiem winogronowym i drożdżami; obrazowanie embrionów powinno nastąpić około dwóch godzin po rozpoczęciu zbioru. Aby przygotować szkiełko nakrywkę, należy umieścić ją po jednej stronie preparatu mikroskopowego i przymocować cztery narożniki taśmą, aby zapobiec przesuwaniu się. Za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem należy nałożyć jedną warstwę kleju heptanowego w linii na szkiełku nakrywce.Klej nie powinien być lepki i powinien wysychać w ciągu kilku sekund. Jeśli jest zbyt gęsty, należy dodać więcej heptanu. Na koniec przykleić kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka przedmiotowego obok przykrycia.Przesunąć pędzlem zwilżonym wodą. Ostrożnie zebrać zarodki z płytki z sokiem z winogron i umieścić je na dwustronnej taśmie klejącej na szkiełku. Następnie, używając jednej części pęsety, toczyć zarodki po dwustronnej taśmie klejącej, aż do przerwania chorionu.Pobierz zarodek, delikatnie przesuwając go po powierzchni Corianu, aby przywarł do pęsety, a następnie umieść go w kleju heptanowym na szkiełku nakrywkowym. Przesuń zarodek tak, aby jego dłuższa oś była równoległa do dłuższego boku szkiełka nakrywkowego. Umieść od 10 do 20 zarodków w jednym rzędzie.Zdejmij szkiełko nakrywkę i umieść je w komorze dehydratacyjnej na od trzech do ośmiu minut. Czas ten zależy od lokalnej wilgotności oraz ilości substancji do wstrzyknięcia. Następnie umieść szkiełko nakrywkę w metalowej komorze z zastosowaniem smaru próżniowego.Na koniec przykryć embriony olejem halokarbonowym, aby zapobiec ich dalszemu odwodnieniu. Embriony są teraz gotowe do iniekcji. W pierwszej kolejności zlokalizować embriony przy użyciu obiektywu 16 x.Odsuń zarodki i zlokalizuj igłę, nie zmieniając płaszczyzny ogniskowania. Wyśrodkuj igłę i przesuń ją w górę, nie zmieniając jej położenia w kierunku X lub Y. Aby otworzyć igłę, wprowadź krawędź szkiełka nakrywki w pole widzenia, ale poza miejsce, w którym znajdzie się igła.Następnie obniżyć igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwać szkiełko nakrywkę, aż uderzy ono w igłę i delikatnie ją przebije. Unieść igłę.Teraz ustaw zarodki w polu widzenia. Opuść igłę do oleju, upewniając się, że z igły wydobywają się ładne krople cieczy. Powoli przesuń zarodek w stronę igły, wstrzyknij kroplę do zarodka, a następnie odsuń zarodek.Po wstrzyknięciu wszystkich embrionów są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym z obiektywem 60x lub 100x. Embrion kontrolny powinien wyglądać tak jak ten pokazany w filmie. Jest to embrion wykazujący ekspresję GFP tubuliny oraz RFP histony, obrazowany obiektywem 100x przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym.Całkowity czas wynosi osiem minut. Wykresy odległości od bieguna do bieguna są bardzo powtarzalne i stanowią wiarygodną miarę sukcesu w embrionach kontrolnych. Powinny one wyglądać tak jak przedstawione tutaj dla cykli od 11 do 13.Na tym filmie pokazano inny embrion kontrolny. Ten wykazuje ekspresję KLP 61 FGFP i został wstrzyknięty r Domine tubuliną. Obrazowanie przeprowadzono również z użyciem obiektywu 100 x w konfokalnym mikroskopie z dyskiem obrotowym, a całkowity czas wynosi siedem minut.Nagranie to zostało wykonane bezpośrednio po mikrowstrzykiwaniu, a gradient stężenia r Domine tubuliny jest wyraźnie widoczny na początku filmu. Zarodki te mogą być wykorzystane do badania inhibicji Klp 61 F po mikrowstrzyknięciu przeciwciał przeciwko Klp 61 F. Widoczny jest zanik Klp 61 FGFP z wrzecion.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić mikroiniekcję zarodków muszki owocówki (*Drosophila*). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o przeprowadzeniu kontroli – najpierw należy poćwiczyć wstrzykiwanie samego buforu lub rutyny oraz upewnić się, że mitoza przebiega normalnie w fazie komórkowej. Gdy wszystkie iniekcje będą powtarzalne i nie będą powodować uszkodzeń, można wstrzyknąć inhibitor i zbadać efekt tej konkretnej inhibicji.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w zarodku synchronicznym Drosophila melanogaster

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ze względu na ich duży rozmiar i stosunkowo prostą organizację, komórki pielęgniarskie Drosophila idealnie nadają się do badań obrazowania żywych komórek. Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania związków egzogennych do komórek, a przedstawiony protokół demonstruje procedurę z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi zwanymi latarniami molekularnymi (MB) używanymi do wizualizacji endogennych transkryptów mRNA.

Mikroiniekcja komórek pielęgniarskich Drosophila: metoda dostarczania wewnątrzkomórkowego

Ten film opisuje, jak wykonywać mikrozastrzyki, które dostarczają odczynniki do żywych zarodków Drosophila. Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do wprowadzenia związków egzogennych, takich jak kwasy nukleinowe i białka, we wczesnych stadiach rozwoju zarodka. Przedstawiony protokół pokazuje, jak skonfigurować i wykonać procedurę wstrzykiwania dowolnego rozpuszczalnego odczynnika - w tym przypadku białka fluorescencyjnego do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.

Mikroiniekcja żywych zarodków Drosophila: wczesne dostarczenie odczynników do rozwijającego się zarodka

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest wstrzyknięcie globularnej aktyny sprzężonej z rodaminą do zarodków Drosophila i zobrazowanie wewnątrzjądrowego montażu pręcików aktyny po stresie cieplnym.

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj techniki mikroiniekcji do badania mitozy w syncytialnym zarodku Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę podziału komórkowego i dynamiki wrzeciona mitotycznego.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów