Name: Śledzenie dynamiki wszczepienia mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj protokół obrazowania fluorescencyjnego in vivo do monitorowania regeneracji mięśni u myszy przy użyciu komórek GFP. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki wszczepienia komórek macierzystych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace Z. Yang i Y. Wang były możliwe dzięki grantowi K02 AR051181 z NIAMS/NIH oraz grantom z Muscular Dystrophy Association i Harvard Stem Cell Institute dla Y. Wang. Prace Q. Zeng i X. Xu są wspierane przez grant programowy przyznany Optical Imaging Lab przez Brigham and Women’s Hospital. Autorzy chcieliby podziękować Wen Liu z Department of Anesthesia, BWH, za pomoc techniczną przy pracy z komórkami.

Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Izolacja komórek satelitarnych 
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Po podaniu środka znieczulającego usuwa się mięśnie kończyn myszy transgenicznych GFP (C57BL/ Ka-βactin-EGFP). Po pocięciu na małe kawałki komórki satelitarne są dysocjowane enzymatycznie poprzez inkubację posiekanego tkanki z 2% roztworem kolagenazy i dispazy przez 1 godzinę w 37°C.</li>
 <li>Trawienie enzymatyczne neutralizuje się pożywką wzrostową zawierającą Ham F-10 i 20% FBS, a następnie dysocjuje się mięśnie poprzez wielokrotne tryturację pipetą Pasteura. Komórki są filtrowane przez sito komórkowe (ø70-100μm), a następnie wysiewane na niepowlekaną szalkę na 1 godzinę w 37°C.</li>
 <li>Ostrożnie usuwa się nadsącz i wysiewa komórki na szalkę powleczoną kolagenem. Krok ten powtarza się po 1 godzinie w celu oczyszczenia mioblastów (pre-plating).</li>
 <li>Wymienia się pożywkę i wysiewa komórki w odpowiednim czasie. Ostatecznie oczyszczone mioblasty hoduje się w pożywce zawierającej Ham F-10, 20% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (pożywka wzrostowa) w 37°C przy 5% CO2 i 95% powietrza.</li>
 </ol> 
</li>
<li>Hodowanie i namnażanie pierwotnych mioblastów w pożywce wzrostowej z dodatkiem podstawowego FGF w stężeniu 10 ng/ml.</li>
<li>W przypadku wszystkich eksperymentów in vivo wstrzykujemy 5x105 komórek na jeden mięsień TA.</li>
<li>Podczas zbierania mioblastów odrywamy komórki, używając 0.25% trypsyny/EDTA, a następnie dwukrotnie przemywamy je PBS. Liczbę komórek określa się za pomocą hemocytometru, a następnie resuspensuje w HBSS do stężenia 5x104 komórek/μl. Skoncentrowane komórki w HBSS umieszcza się w lodzie i wstrzykuje w ciągu 1 godziny od zebrania.</li>
</ol>
In Vivo Obrazowanie
<ol>
<li>Samce myszy mdx w wieku 4-6 tygodni są zamawiane z laboratorium Jackson i utrzymywane w zwierzęcym domu hodowlanym.</li>
<li>Po około jednym tygodniu aklimatyzacji w nowym środowisku myszy są gotowe do implantacji hodowlanych komórek.</li>
<li>Przed transplantacją komórek mysz poddaje się znieczuleniu poprzez dostrzyszkowe (i.p.) wstrzyknięcie mieszaniny Ketaminy (100 mg/kg) i Ksylazyny (10 mg/kg). Następnie usuwa się sierść z okolic mięśnia TA, nakładając preparat Nair na nogę i odczekując 30 sekund, po czym miejsce to przeciera się wodą destylowaną.</li>
<li>Podczas gdy mysz nadal znajduje się pod wpływem znieczulenia, 5x105 komórek w 10μl HBSS są powoli wstrzykiwane do każdego mięśnia TA w 3 punktach za pomocą igły o rozmiarze 30G.</li>
<li>Po kroku 4 mysz może być regularnie obrazowana za pomocą fluorescencyjnego obrazowania in vivo. Do uzyskania obrazów tylnych kończyn myszy wykorzystuje się stację do obrazowania fluorescencyjnego NightOwl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), wyposażoną w wysokoczułą kamerę CCD.</li>
<li>W dniu obrazowania in vivo sprawdzamy najpierw odrost sierści na mięśniu TA. W razie potrzeby ponownie stosujemy preparat Nair w celu usunięcia sierści, zgodnie z powyższym opisem, po znieczuleniu myszy mieszaniną Ketaminy i Ksylazyny.</li>
<li>Gdy mysz jest pod wpływem znieczulenia, umieszczamy ją w pozycji brzusznej na arkuszu czarnego, niefluorescencyjnego papieru (czarny papier Artagain firmy Strathmore). Aby w pełni odsłonić mięsień TA dla lepszego obrazowania, przyklejamy tylne łapy do papieru taśmą.</li>
<li>Umieszczamy mysz w komorze obrazującej i ustawiamy tylną nogę przeznaczoną do obrazowania w centrum pola widzenia kamery. Najpierw zmieniamy filtr emisyjny, aby wykonać tradycyjne zdjęcie nogi w skali szarości z czasem ekspozycji 5 sekund. W razie potrzeby korygujemy pozycję myszy oraz ostrość kamery. Parametry obrazowania, w tym czas ekspozycji (1,250 ms), wysokość próbki (0.9 cm) itp., pozostają stałe w całym procesie eksperymentalnym.</li>
<li>Następnie włączamy odpowiedni filtr emisyjny dla długości fali zielonego białka fluorescencyjnego. Wykonujemy obraz fluorescencyjny z czasem ekspozycji 1,250 ms i binningiem równym 1. Po obrazowaniu mysz zostaje przeniesiona z komory obrazującej do klatki w celu wybudzenia.</li>
<li>Do analizy wyznaczamy obszar zainteresowania (ROI) nad sygnałami fluorescencyjnymi, aby zmierzyć ich intensywność w jednostkach fotonów na sekundę. Jako kolejną wartość ilościową mierzymy rozmiar ROI w liczbie pikseli. Eksperymenty obrazowe mogą być powtarzane co tydzień lub częściej przez kilka miesięcy, jeśli jest to konieczne, w celu pozyskania danych podłużnych.</li>
</ol>
Po zakończeniu eksperymentów mysz zostaje poddana eutanazji, a mięsień TA zostaje pobrany do analizy histologicznej.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

W niniejszym badaniu opracowaliśmy niezawodną i stabilną platformę obrazowania do śledzenia znakowanych fluorescencyjnie komórek przeszczepionych do mięśnia szkieletowego biorcy. Mioblasty znakowane GFP pochodzące od transgenicznej myszy GFP reprezentują rodzaj dorosłych komórek macierzystych, które w przyszłości będą kandydatami do terapii komórkowej. Stała kontrola parametrów, w tym liczby komórek, sposobu wstrzykiwania komórek, czystości tła, pozycji obrazowania oraz parametrów urządzenia, jest kluczowa dla uzyskania wysokiej jakości obrazów, a w szczególności dla analizy ilościowej.
Obrazowanie fluorescencyjne znajduje wiele zastosowań w badaniach biomedycznych, ponieważ jest nieinwazyjne, łatwe w użyciu i charakteryzuje się wysoką przepustowością. Ponadto obrazowanie fluorescencyjne może zapewniać pomiar ilościowy oparty na liczbie fotonów, choć ze względu na rozpraszanie, tłumienie i absorpcję światło nie może przenikać na duże odległości w tkance, co stanowi wadę tej techniki. Podejmowane są wysiłki w celu wykorzystania reporterów czerwonych lub bliskiej podczerwieni, aby zwiększyć głębokość penetracji światła.
Kolejną zaletą obrazowania fluorescencyjnego jest możliwość jego przeniesienia do praktyki klinicznej, pod warunkiem że konkretny reporter fluorescencyjny zostanie zatwierdzony do stosowania u ludzi. W porównaniu z MRI, CT i PET, obrazowanie fluorescencyjne charakteryzuje się dużą elastycznością, ponieważ nie wymaga drogiego sprzętu ani środków kontrastowych. Przykładem są endoskopy i mikroendoskopy oparte na fluorescencji, które są wykorzystywane w klinikach. Łącząc obrazowanie fluorescencyjne z innymi modalnościami, spodziewamy się uzyskać możliwość pozyskiwania zarówno informacji anatomicznych, jak i funkcjonalnych na temat zachodzących procesów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Dystrofie mięśniowe stanowią grupę degeneracyjnych chorób mięśni charakteryzujących się postępującą utratą kurczliwych komórek mięśniowych. Obecnie nie istnieje dostępna metoda leczenia przyczynowego. Ostatnie postępy w biologii komórek macierzystych dają nową nadzieję na opracowanie skutecznych terapii komórkowych w leczeniu tych schorzeń. W tej dziedzinie szeroko stosuje się transplantację różnych typów komórek macierzystych znakowanych białkami fluorescencyjnymi do mięśni dystroficznych modeli zwierzęcych. Nieinwazyjna technika umożliwiająca podłużne śledzenie losów przeszczepionych komórek może usprawnić i zwiększyć dokładność oceny procesu wgryzania się komórek transplantowanych w tkankę mięśniową.
W niniejszym badaniu wykazujemy, że obrazowanie fluorescencyjne in vivo jest czułą i niezawodną metodą śledzenia przeszczepionych komórek znakowanych GFP (Green Fluorescent Protein) w mięśniach szkieletowych myszy. Pomimo obaw dotyczących tła wynikającego z konieczności użycia zewnętrznego światła do wzbudzenia białka fluorescencyjnego, stwierdziliśmy, że zastosowanie myszy nago lub usunięcie sierści za pomocą odczynników do depilacji w znacznym stopniu eliminuje ten problem. Przy użyciu kamery CCD sygnał fluorescencyjny można wykryć w mięśniu piszczelowym przednim (TA) po wstrzyknięciu 5 x 105 komórek pochodzących albo z transgenicznych myszy GFP, albo z hodowli mioblastów transdukowanych eGFP. W przypadku mięśni położonych bardziej powierzchownie, takich jak mięsień prostownik długi palców (EDL), wstrzyknięcie mniejszej liczby komórek generuje wykrywalny sygnał. Intensywność sygnału można zmierzyć i określić ilościowo jako liczbę fotonów emitowanych na sekundę w obszarze zainteresowania (ROI). Ponieważ uzyskane obrazy wykazują wyraźne granice wyznaczające obszar wszczepienia, można również zmierzyć wielkość ROI. Jeśli kończyny są za każdym razem pozycjonowane w ten sam sposób, zmiany w całkowitej liczbie fotonów na sekundę na mięsień oraz wielkość ROI odzwierciedlają zmiany w liczbie wszczepionych komórek i wielkości obszaru wszczepienia. Zatem zmiany w tym samym mięśniu w czasie są mierzalne ilościowo. Technika obrazowania fluorescencyjnego in vivo była stosowana głównie do śledzenia wzrostu komórek tumorigennych; nasze badanie wykazuje, że jest ona potężnym narzędziem, które umożliwia śledzenie losów przeszczepionych komórek macierzystych.

Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.

Dystrofie mięśniowe to grupa degeneracyjnych chorób mięśni, charakteryzujących się postępującą utratą kurczliwych komórek mięśniowych. Obecnie nie istnieje...

Witam, jestem Juwan Ma z Wydziału Anestezjologii w Bergham Women's Hospital w Bostonie. Dzisiaj zaprezentujemy technikę pozyskiwania obrazów fluorescencyjnych in vivo w celu monitorowania postępów regeneracji mięśni u myszy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania przyżywalności przeszczepionych komórek macierzystych mięśni.Zacznijmy zatem. Komórki znakowane białkiem GFP do transplantacji są izolowane i hodowane z myszy transgenicznych GFP. Przed kontynuacją uciśnięcie palca u nogi pozwala potwierdzić, że mysz znajduje się w pełnej anestezji. Następnie usuwane są mięśnie kończyny tylnej. W warunkach aseptycznych mięsień zostaje poddany maceracji.Komórki satelitarne są dysocjowane poprzez inkubację rozdrobnionej tkanki w 2% roztworze kolagenazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Po inkubacji dodaje się pożywkę wzrostową zawierającą ham F 10 oraz 20% FBS, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne. Następnie mięśnie są dysocjowane poprzez wielokrotne tryturacje za pomocą pipety Pasteura.Następnie komórki są filtrowane przez sitko komórkowe, a potem wysiewane na niepowlekaną szalkę hodowlaną. Szalkę umieszcza się w standardowym inkubatorze do hodowli komórek na jedną godzinę. W celu oddzielenia komórek satelitarnych od innych populacji komórek o silniejszych właściwościach adhezyjnych, supernatant zostaje przelany na szalkę powleczoną kolagenem i inkubowany przez kolejną godzinę.Po tej inkubacji uzyskany supernatant wzbogacony w komórki satelitarne zostaje ponownie usunięty, naniesiony na nową płytkę pokrytą kolagenem i hodowany do momentu zaobserwowania kolonii mioblastów. Proces ten nazywa się prepl; komórki są pasażowane po osiągnięciu 60 do 70% konfluencji komórkowej. Niewielka część komórek jest wykorzystywana do immunocytochemii, z barwieniem markerami komórek miogennych w celu weryfikacji czystości komórek mięśniowych w hodowli.Po potwierdzeniu czystości komórek miogennych, komórki są namnażane w tej samej hodowli. W ramach przygotowania do transplantacji, komórki są odrywane przy użyciu 0,25% Trypsyny z N EDTA. Komórki są dwukrotnie płukane i resusp endowalne w HBSS do stężenia 5×10⁷ komórek na mililitr, a następnie do mięśnia piszczelowego przedniego (TA) wstrzykuje się 10 µL zawiesiny komórkowej.W celu obrazowania in vivo, mioblasty znakowane GFP są najpierw przeszczepiane do samców myszy w wieku od czterech do sześciu tygodni. Mysz zostaje poddana znieczuleniu ketaminą i ksylazyną, a procedurę rozpoczyna się po potwierdzeniu stanu znieczulenia. Aby zredukować szum tła, włosy na obu tylnych łapach są usuwane poprzez nałożenie depilatora na łapy i odczekanie 30 sekund przed jego wytarciem.Następnie nogi przeciera się ponownie nowym aplikatorem z końcówką watną nasączonym wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości wydzieliny z nozdrzy oraz włosy przed przeszczepieniem komórek do myszy. Najpierw pobiera się do strzykawki Hamiltona pięć razy 10⁵ komórek w 10 µL HBSS. Za pomocą igły o rozmiarze 30 G wstrzykuje się taką samą liczbę komórek w trzech miejscach wzdłuż długiej osi mięśnia TA: w górnej części przyśrodkowej oraz w części dolnej.Po każdym wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę przez dwie minuty przed wycofaniem jej z mięśnia, aby zapobiec wyciekowi wzdłuż igły. W czasie oczekiwania należy pobrać taką samą ilość komórek do kolejnej strzykawki i wstrzyknąć je do przeciwległego mięśnia TA. Po wstrzyknięciu komórek mysz należy natychmiast umieścić w pozycji brzusznej na czarnym, niefluorescencyjnym papierze, przymocowując obie łapy do papieru stroną podeszwową do dołu i rozstawiając nogi pod kątem 90 stopni. Następnie mysz umieszcza się w komorze stacji do obrazowania fluorescencyjnego Night Owl, LB 9 81.Przy użyciu wysokoczułej kamery CCD, jedna tylna kończyna zostaje umieszczona w centrum pola widzenia kamery. Najpierw wykonuje się tradycyjne zdjęcie kończyny w skali szarości. Przed rozpoczęciem obrazowania wybiera się odpowiedni filtr emisyjny o długości fali specyficznej dla zielonego białka fluorescencyjnego.Wykonaj jedno zdjęcie z czasem ekspozycji 1 250 milisekund, a następnie kolejne z czasem ekspozycji 500 milisekund. Stwierdzamy, że dłuższy czas ekspozycji umożliwia wykrycie słabego sygnału, podczas gdy krótszy czas ekspozycji ujawnia więcej szczegółów. Po wykonaniu obrazowania jednej tylnej kończyny, ustaw drugą tylną kończynę w centrum pola widzenia kamery i obrazuj tę kończynę w ten sam sposób, jak pokazano wcześniej.Aby zapewnić porównywalność wyników, wysokość preparatu powinna pozostać niezmieniona. Po obrazowaniu mysz jest przenoszona z powrotem do klatki, a następnie monitoruje się jej wybudzanie z narkozy. Do analizy należy wyznaczyć obszar zainteresowania nad sygnałami fluorescencyjnymi, aby zmierzyć liczbę fotonów na sekundę.Zmierzyliśmy również rozmiar obszaru zainteresowania w liczbie pikseli, aby uzyskać dodatkową wartość ilościową do pozyskania danych podłużnych; eksperymenty obrazowe można powtarzać w różnych dniach lub tygodniach, zgodnie z potrzebami. W przeprowadzonych eksperymentach obraz fluorescencyjny tylnej kończyny myszy, wykonany w dniu wstrzyknięcia komórek znakowanych GFP, wykazał wysoką intensywność sygnału. Intensywność sygnału spadła w drugim dniu, a następnie wzrosła do stabilnego poziomu do dnia siódmego, 14. i 21. Gdy zmiany fluorescencji zostały poddane analizie ilościowej poprzez pomiar intensywności sygnału jako liczba fotonów na sekundę, zaobserwowaliśmy wyraźny spadek intensywności sygnału dzień po wstrzyknięciu, co odzwierciedlało zmniejszenie liczby komórek dodatnich pod kątem GFP.Jednak w siódmym, czternastym i dwudziestym pierwszym dniu intensywność sygnału wzrosła do stabilnego poziomu, co wskazywało na zajście regeneracji mięśni. Przedstawiliśmy sposób wykorzystania obrazowania fluorescencyjnego in vivo do monitorowania postępów regeneracji mięśni po wstrzyknięciu komórek znakowanych GFP. Stosując tę metodę, jesteśmy w stanie badać dynamikę regeneracji mięśni po wstrzyknięciu każdego rodzaju komórek znakowanych fluorescencyjnie.Ponieważ obrazy mogą być pozyskiwane nieinwazyjnie w określonych odstępach czasu, możliwe jest zgromadzenie dokładniejszych danych podłużnych przy użyciu mniejszej liczby zwierząt i mniejszym nakładem pracy. Przy zastosowaniu stałych parametrów pomiarowych obrazy z tych samych zwierząt wykonane w czasie powinny być porównywalne ilościowo. Aby zredukować tło, niezwykle ważne jest utrzymanie czystej powierzchni skóry nad mięśniem; absolutnie niezbędne jest usunięcie wszystkich włosów pokrywających kończyny oraz dokładne przetarcie tego obszaru patyczkami lub wacikami bawełnianymi.I pamiętajcie, aby za każdym razem stosować ten sam zestaw parametrów, aby zapewnić spójność wszystkich pomiarów. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestrowanie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą in vivo obrazowania fluorescencyjnego

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Ten film demonstruje protokół ortotopowego wszczepiania komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji do trzustki myszy. Ortotopowy model myszy pomaga w badaniu skuteczności nowych terapii w przypadku guzów pierwotnych i przerzutowych.

Fluorescencyjny ortotopowy model myszy: wszczepianie GFP z ekspresją komórek rakowych do myszy w celu oceny progresji guza in vivo

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium przeszczepionych myszom. Metoda pozwala na badanie wpływu wybranych leków na wielkość zmiany endometriotycznej poprzez monitorowanie i kwantyfikację fluorescencji emitowanej przez reporter fluorescencyjny w czasie...

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak przeprowadzić in vivo (przy użyciu matryc elektrod powierzchniowych i igłowych) oraz ex vivo (przy użyciu ogniwa dielektrycznego) mięsień brzuchaty łydki gryzonia. Zademonstruje technikę zarówno na myszach, jak i szczurach oraz szczegółowo omówi dostępne modyfikacje (np. otyłe zwierzęta, młode).

Wykonywanie miografii impedancji elektrycznej in vivo i ex vivo u gryzoni

Poznaj protokół obrazowania fluorescencyjnego in vivo do monitorowania regeneracji mięśni u myszy przy użyciu komórek GFP. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki wszczepienia komórek macierzystych w czasie rzeczywistym.

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Przeglądaj więcej filmów